肾脏和肾神经在应激、钠盐所致
高血压中的作用^*

林善锬　邹文泉　陈靖　李鹏

　　摘要　本工作采用电生理、生化、放免、电镜等方法,探讨了慢性应激和盐致高血压大鼠交感神经系统和肾脏功能的改变。实验在雄性SD大鼠上进行。结果表明: (1)高盐大鼠肾血浆流量(RPF)和尿钠排泄明显增加,而应激大鼠RPF显著下降。(2)电镜显示高盐大鼠近曲和远曲小管上皮细胞及线粒体变大,应激则使细胞萎缩、线粒体变小。(3)高盐大鼠肾皮质Na-K-ATP酶活性下降,应激可使其恢复。(4)频谱分析显示应激大鼠低频波动(0.2～0.9 Hz)明显增加。(5)应激导致大鼠肾素活性(PRA)及血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)水平升高,并能使高盐大鼠低PRA和ANGⅡ水平升高。(6)大鼠去除双侧肾神经后,应激无法造成血压升高、RPF下降和PRA、ANGⅡ上升。上述结果提示: 肾交感神经系统兴奋性增加介导的肾脏机制,可能在应激和/或盐致高血压发病过程中具有重要作用。
　　关键词: 应激；高盐饮食；高血压；肾脏机制；交感神经系统
　　学科分类号: Q463

STRESS AND DIETARY SALT INTAKE IN THE
PATHOGENESIS OF HYPERTENSION: ROLE OF
THE RENAL AND SYMPATHETIC NERVOUS SYSTEM^*

LIN　SHAN-TAN，ZOU　WEN-QUAN，CHEN　JING
Department of Nephrology,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040;
LI　PENG
Department of Physiology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032

　　ABSTRACT　Using the methods of electrophysiology,biochemistry,radioimmunoassary,and electron microscopy,changes of sympathetic nervous system and renal function in hypertensive SD rats induced by stress and high-salt intake were investigated.The results are as follows.(1)Renal plasma flow (RPF) and urinary sodium excretion obviously increased in salt-loading rats.Stress could result in marked reduction of RPF.(2)Electron micrography showed a dramatic increase in cell and mitochondrial volume in the proximal and distal convoluted tubules of high-salt diet rats.After stress of two weeks,the cells of the tubule became atrophic and mitochondrial volume decreased.(3)The same recovery from the declining renal cortical Na-K-ATPase activity in high-salt diet rats could be observed by maintained stress.(4)Low frequency (0.2～0.9 Hz) of BP variability was higher in stress rats as compared to control.(5)Both plasma renin activity (PRA) and angiotensin Ⅱ (ANGⅡ) levels increased in stress rats,but the decrease in high-salt diet rats gradually reached the high level of the former in two weeks.(6)Increase of BP,fall in RPF,or augment in PRA and ANGⅡ were not observed in stress rats subjected to bilateral renal denervation.The above results indicate that the renal mechanism mediated by increased renal sympathetic nervous system plays an important role in stress- and salt-induced hypertension pathogenesis.
　　Key words: stress;high salt intake;hypertension;renal mechanism;sympathetic nervous system

　　紧张应激和高盐饮食是影响血压的两个主要环境因素。应激经中枢激活交感神经系统,高盐饮食则可提高交感神经对应激的反应性^［1,2］。活动亢进的交感神经系统可能通过作用于心血管和肾脏而使动脉血压持续性升高^［3］。这些研究结果大多来自对有高血压遗传倾向个体的分析。应激和钠盐对于遗传正常大鼠血压和肾脏的影响尚缺乏系统研究。本工作在建立Sprague-Dawley(SD)大鼠应激性高血压模型和盐致高血压模型基础上,从分子、细胞、组织、器官和整体等不同水平,探讨应激和／或盐对SD大鼠交感神经系统活动性和血压长期调节的核心器官肾脏的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物及分组　　5周龄雄性SD大鼠(体重60～100 g)随机分成: (1)应激组(Str),参照林青方法^［4］,以间断性交流电(100～130 V)电击大鼠足底加噪音(持续2周)建立应激性高血压模型。(2)高盐组(HNa),以高盐饮食(8% NaCl)建立盐致高血压模型。(3)高盐＋应激组(HNa+Str),高盐饮食,于第11、12周龄给予两周应激。(4)对照组(NC),予1% NaCl饲料,普通饮水。8周后所有动物(13周龄)用于实验。
　　1.2　尾套法测定血压和心率　　采用RBP-1型大鼠尾压心率测定仪 (北京中日友好医院生产)检测,取三次测量的平均值。
　　1.3　肾功能测定　　各组随机取6只大鼠进行廓清试验(方法略)^［5］,肾小球滤过率(GFR)以菊糖清除率表示,肾血浆流量(RPF)以对氨基马尿酸清除率表示,记录尿量(UV)(直接测量法),尿钠浓度(UNaV)采用火焰分光光度计测定。
　　1.4　电镜观察及肾皮质Na-K-ATP酶活性测定　　各组随机取10只大鼠断头后,迅速切除肾皮质,取少量组织固定后环氧树脂618液包埋,超薄切片,经醋酸铀－枸橼酸铅双染色,JEM-1200EX电镜观察。其余肾组织称重后匀浆,参照Jurgenson法作组织Na-K-ATPase活性测定^［6］。
　　1.5　频谱分析　　由于频谱分析技术可显示清醒大鼠血压的短时波动,而血压的谱成分与自主神经系统活动性密切相关,能较好反应交感血压控制,因此可作为观察交感神经系统变化的定量指标^［7］。本研究随机取对照和应激两组大鼠各6只,行左股动静脉插管,通过压力换能器与八道生理记录仪(RM6000,Nihon Kohden,Japan)相连,术后8　h平衡,记录动物完全清醒安静状态下血压信号(10 min),作为对照值。再予动物100 dB蜂鸣噪声的急性刺激10 min,记录血压信号。将信号输入386电脑,分别计算低频峰(LF,0.2～0.9 Hz)和高频峰(HF,0.9～ 3.5 Hz)的面积(功率谱密度和),并确定各个谱峰的中心频率。血压检出程序和功率谱分析程序由上海医科大学生物医学工程教研室提供。
　　1.6　血浆肾素活性(PRA)和血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)浓度测定　　取四组大鼠血标本,放免法测定(药盒购自北京北方生物技术研究所)。
　　1.7　双侧肾神经切除术　　12只SD雄性大鼠(300～350 g)随机分组: (1)去肾神经组(n=6),手术切断双侧肾神经。(2)假手术组(n=6)。两组动物正常饮食,同时予以慢性应激。2周后检测肾功能(RPF、GFR、UV及UNa)和PRA、ANGⅡ浓度(方法同上)。
　　1.8　统计方法　　所有数据均表示为,采用t检验及方差分析进行统计,P<0.05为有显著性差异。

　　2　结果

　　2.1　应激、钠盐对大鼠血压及肾功能的影响
　　应激和／或钠盐致高血压模型大鼠变得躁动不安,易于激惹。清醒状态下,尾套法测得各组大鼠实验前(5周龄)血压(kPa)无明显差异(NC: 15.1±2.7,Str: 14.7±2.3,HNa: 15.4±3.6,　HNa+Str: 15.1±3.3)。8周后(第13周龄),应激(20.7±2.8)、高盐(18.2±4.1)及高盐+应激组(22.7±11.6)大鼠血压均较自身第5周龄显著升高,且明显高于对照组(15.7±2.6),其中以高盐+应激组最显著；而且,此组动物血压亦明显高于高盐组(图1)。为了分析高盐与应激对血压有无交互作用,作析因方差分析显示F=51.39,　P<0.01,提示两因素有协同作用。各组大鼠心率在实验前后和各组间均无显著差异。

图1　慢性应激和高盐饮食对SD大鼠收缩压(SBP)的影响
Fig.1　Effects of chronic stress and high sodium diet on systonic
blood pressure(SBP) in SD rats
^*P<0.01 vs NC;^**P<0.01 and ^***P<0.001 vs 5th week rats;^****P<0.01 vs HNa rats.NC: normal control group;Str: stress group;
HNa: high-salt diet group;HNa+Str: high-salt diet+stress group.

　　与对照组相比,应激组大鼠仅表现为RPF显著降低,GFR、UNaV及UV均无明显变化。相反,高盐组大鼠RPF明显升高,UNaV及UV亦显著上升;予以应激后,盐负荷大鼠表现为RPF、GFR显著下降,明显低于其它各组(P均小于0.01),UNaV及UV也较高盐组明显下降(P均小于0.01),与对照组无差异(表1)。

表1　慢性应激与高盐饮食对SD大鼠肾功能、肾皮质Na-K-ATP酶
活性及肾素血管紧张素系统的影响
Table 1　Effects of chronic stress and high sodium diet on renal function,renal cortical Na-K-ATPase activity and renin-angiotensin-system in SD rats

	RTF /ml^.(min^. 100 g)^－1	GFR /ml^.(mim^. 100 g)^-1	UNav /μEq^. min^-1	UV /μl^.min^-1	Na-K-ATPase /μmol^.pi^. (mg pr^.h)^-1	PRA /ηg^.(ml^.h)^-1	ANGII /μg^.ml^-1
NC	4.14±0.23	0.82±0.05	4.73±0.23	36.83±7.06	5.67±0.15	3.63±0.09	0.67±0.04
Str	3.57±0.24^a	0.79±0.04	5.93±1.01	27.33±3.30	6.06±0.10	4.61±0.07^b	1.43±0.14^c
HNa	4.78±0.12^a	0.88±0.11	13.13±0.68^b	70.83±9.36^b	3.52±0.23^b	1.23±0.02^c	0.24±0.03^c
HNa+Str
	1.42±0.23^b	0.51±0.08^b	4.45±0.75	27.0±3.60	5.23±0.30	4.03±0.03^b	1.55±0.10^c

Values are ;^aP<0.05,^bP<0.01 and ^cP<0.001 vs NC.RPF: renal plasma flow;GFR: glomerular filtration rate;UNaV: urinary sodium excretion;UV: urine flow rate;PRA: plasma renin activity;ANGⅡ: angiotensin Ⅱ;NC: normal control group;Str: stress group;HNa: high-salt diet group;HNa+Str: high-salt diet+stress group.

　　2.2　应激、钠盐对大鼠肾脏超微结构及肾皮质Na-K-ATPase活性的影响
　　电镜显示4组大鼠肾小球基底膜未见明显改变。在近曲小管,高盐组上皮细胞肥大,
线粒体变大;高盐+应激组则上皮细胞萎缩,线粒体变小;应激组无明显改变(图2,见图版Ⅰ)。在远曲小管也可观察到类似的变化,且更加显著(图3,见图版Ⅱ)。
　　高盐组肾皮质Na-K-ATPase活性明显低于其它各组(P<0.01),应激组、高盐+应激组与对照组之间无显著性差异。
　　2.3　应激、钠盐对交感神经系统和肾素血管紧张素系统(RAS)的影响
　　清醒大鼠安静时收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的功率谱同时存在两个明显的低频峰和高频峰。应激时正常大鼠SBP及DBP均升高,且低频波动明显,其功率谱密度值(PSD)明显增加。高血压大鼠安静时低频峰幅度大于正常鼠,PSD显著增加;应激时血压升高更显著,低频波动加大,PSD增加更明显(表2)。

表2　应激对正常大鼠及应激性高血压大鼠血压和功率谱密度值(PSD)的影响
Table 2　Effects of stress on blood pressure and power spectra density in normotensive and stress-induced hypertensive rats

			BP /kPa	LF,PSD	HF,PSD
Normotensive	Resting	SBP	19.5±8	203±103	404±198
		DBP	12.5±6	171±101	375±308
	Stress	SBP	21.6±5^*	468±211^*	381±128
		DBP	13.9±8^*	422±154^*	437±275
Hypertensive	Resting	SBP	22.5±5^+	800±406^+	582±266
		DBP	15.1±5^+	630±301^+	371±318
	Stress	SBP	24.5±6^*	2249±1469^*	605±314
		DBP	16.0±8^*	1784±823^*	437±275

n=6.Values are ;^*P<0.05 compared with resting rats;⁺P<0.05 compared with nomotensive rats (resting).BP: blood pressure;PSD:power spectra density.

　　应激组和高盐+应激组大鼠PRA及ANG-Ⅱ水平明显高于对照组,相反,高盐组则明显低于对照组(表1)。
　　2.4　肾神经在应激致高血压中的作用
　　应激后可见假手术组动物收缩压逐渐升高,至第15天,收缩压由(13.8±3.0)升至(18.3±3.4)　kPa(P<0.01),明显高于去肾神经组;后者应激前后收缩压无明显变化,分别为(13.9±3.0)和(13.8±3.0)kPa(图4)。

图4　慢性应激对去神经SD大鼠收缩压(SBP)的影响
Fig.4　Effect of chronic stress on systonic blood pressure(SBP) in SD rats subjected to bilateral renal denervation
P<0.05 and ^**P<0.01 compared with rats subjected to bilateral renal denervation.

　　两组大鼠的GFR、UNaV及UV均无明显差异,仅假手术大鼠RPF明显低于去肾神经组。此外,假手术组PRA和ANGⅡ水平亦明显高于去肾神经组(表3)。

表3　肾神经切除对SD大鼠肾功能及肾素血管紧张素系统的影响
Table 3　Changes of renal function and renin-angiotensin-system in SD rats subjected to bilateral renal denervation

	RTF	GFR	UNav /μEq^.min^-1	UV /μl^.min^-1	PRA /ηg^.(ml^.h)^-1	ANGⅡ /μg^.ml^-1
	/ml^.(min^.100 g)^-1
Sham	3.73±0.26	0.81±0.05	5.52±0.88	39.5±3.68	4.3±0.2	1.43±1.10
DNX	4.45±0.16^*	0.84±0.09	6.57±1.0	40.0±4.41	3.4±0.2^**	0.99±0.09^*

Values are .^*P<0.05 and ^**P<0.01 compared with sham rats.RPF: renal plasma flow;GFR:glomerular filtration rate;UNaV: urinary sodium excretion;UV: urine flow rate;PRA: plasma renin activity;ANGⅡ: angiotensin Ⅱ.

　　3　讨论

　　行为紧张和高盐饮食对于血压和肾脏功能的影响,在有高血压遗传倾向大鼠及原发性高血压患者中已得到广泛研究,而对于遗传正常大鼠血压和肾功能的作用则有不同的报道。本研究发现,慢性应激可使正常饮食大鼠血压升高,RPF下降;使盐负荷大鼠血压进一步升高,RPF下降更明显,同时伴有显著的抗利钠、抗利尿反应。而高盐组大鼠血压升高的同时还有RPF、UNaV及UV增加。应激引起的上述改变可能与交感神经兴奋增加有关^［8］。大量资料表明,交感神经活动增强是高血压的始动因素,进而导致肾脏血流动力学和／或肾小管水钠重吸收的改变。盐负荷大鼠对应激表现出更强烈的心、肾反应,提示盐可能增加了交感神经对应激的反应。有研究发现高盐饮食可使每一次神经冲动神经末梢释放去甲肾上腺素含量增加,使应激引起的心血管反应亢进^［9］。应激致盐负荷大鼠的抗利钠、抗利尿反应可能与中枢β-肾上腺素能机制激活有关^［10］。本实验结果经析因方差分析显示,应激和钠盐对SD大鼠血压有协同作用,支持了Anderson的观点^［11］。
　　进一步电镜检查发现,应激和钠盐刺激还可导致肾脏形态结构的改变。8周盐负荷大鼠表现为水钠排泄增加,近、远曲小管上皮细胞肥大,线粒体变大,这可能是细胞内钠摄取增加所致,与前人的报道相符^［12］。已知肾小管上皮细胞基侧膜面积、细胞内钠及醛固酮水平是决定Na-K-ATPase数量与活性的重要因素,但本组大鼠肾小管钠泵活性并未随细胞体积增大、基侧膜区增加而升高,反而降低,这可能与盐负荷时醛固酮下降、容量扩张导致体内内源性洋地黄样Na-K-ATPase抑制剂产生增加及高钠本身对钠泵的抑制有关^［13,14］,从而促进利尿、利钠。应激对正常饮食大鼠的肾小管形态及皮质钠泵活性并无影响,但可导致盐负荷大鼠肾小管上皮细胞萎缩,线粒体变小,钠泵活性增加。已有人证实去甲肾上腺素可通过增加Na-K-ATPase活性刺激近曲小管转运,而应激可使交感神经活动增加,血、尿中去甲肾上腺素水平升高^［9,15］。因此我们推测应激降低盐负荷大鼠利钠、利尿反应,增加钠泵活性,可能至少与两个原因有关: (1)高盐饮食提高了交感神经对应激的反应性,使应激诱导的去甲肾上腺素释放增加;(2)应激通过增加盐负荷大鼠PRA和ANGⅡ,导致醛固酮水平升高。肾小管上皮细胞萎缩可能与RPF下降有关。
　　本实验采用短时动脉压频谱分析技术显示,慢性应激性高血压大鼠安静时SBP和DBP均高于正常组,低频段功率谱值也明显高于正常鼠,提示这种高血压鼠交感活动性高于正常状态。短时应激后,高血压鼠血压及交感活动增加较正常鼠更明显。交感神经系统与RAS密切相关,有人甚至认为PRA与儿茶酚胺一样,是交感神经活动的一种生化指标^［16］。实验显示慢性应激可使RAS激活,与人体应激时反应类似,从而进一步证实2周应激确实可使SD大鼠交感神经活动增加。高盐饮食抑制RAS可能与容量扩张、抑制肾素分泌有关。
　　由于肾交感神经参与肾血流动力学及肾小管水、钠排泄的调节,为了进一步明确肾神经在应激性高血压中的作用,本研究探讨了去肾神经后应激对肾功能和RAS表达的影响。结果发现,切除大鼠双侧肾神经后,应激前后血压无明显变化;而假手术组血压显著升高,且伴有RPF降低、PRA及ANGⅡ升高,提示应激性高血压发病过程中,肾神经有关键作用,与应激时RPF、PRA及ANGⅡ的变化有直接关系。因此我们认为由肾传出神经兴奋性增加介导的肾血管过度收缩、RAS激活及传入肾神经兴奋性增加,经中枢使交感兴奋性冲动输出增加,可能是应激性高血压发病的主要原因之一。
　　综上所述,肾交感神经系统兴奋性增加介导的肾脏机制可能在应激和／或钠盐致高血压发病过程中具有重要作用。

^*本课题属卫生部重点项目(No.0795301-3),并由美国纽约中华医学基金会 (CMB No.90-527) 资助
^*Supported by the Key Project Foundation of Health Ministry (No.0795301-3)

作者单位：林善锬　邹文泉　陈靖：上海医科大学华山医院肾病科,上海 200040
　　　　　李鹏：上海医科大学生理教研室,上海 200032

图2　电镜下各组SD大鼠近曲不管上皮细胞的改变
Fig.2　Electron micrography show the proximal tubule epithelia cells in SD rats exposed to chronic stress anc high sodium diet
A:low(×750)magnification;B:high (×3750)magnification

图3　电镜下各组SD大鼠远曲小管上皮细胞的改变
Fig.3　Electron micrography show the distal tubule epithelial cells in SD rats exposed to chronic stress and sodium diet
A:low(×750)magnification;B:high (×3750)magnification

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1997-10-23收稿　1998-06-05修回