脂多糖对离体培养大鼠血管
平滑肌细胞增殖的影响

李剑　林树新　李莹　赵贺玲　贾斌

　　摘要　本研究观察到10^－7～10^－5 kg/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可显著促进血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖及DNA的合成(P<0.05)。5×10^－4～10^－3 kg/L LPS却抑制VSMC的增殖及DNA的合成,降低其活力(P<0.01),并呈时间依赖效应。一氧化氮合酶抑制剂N-Nitro-L-Arginine(L-NNA)可拮抗LPS的抑制作用。大剂量LPS作用组VSMC上清液中一氧化氮(NO)代谢产物NO^－₃和NO^－₂的含量与对照组相比显著增加(P<0.01),48 h组比24 h组增加9.1%,72 h组比48 h组增加4.5%;同时,诱导性一氧化氮合酶(inductive nitric oxide synthase,iNOS)免疫组化染色呈阳性。结果表明,低浓度LPS促进VSMC增殖和DNA合成,而高浓度LPS却明显抑制VSMC增殖和DNA合成,降低其活力。这种抑制作用可能与LPS诱导VSMC产生的NO有关。
　　关键词:脂多糖(LPS);血管平滑肌细胞(VSMC);增殖;一氧化氮(NO);诱导性一氧化氮合酶(iNOS)
　　学科分类号:R363

EFFECT OF LIPOPOLYSACCHARIDE ON THE
PROLIFERATION OF RAT VSMCs IN VITRO

LI　JIAN，LIN　SHU-XIN，LI　YING,ZHAO　HE-LING,JIA　BIN
(Department of Pathophysiology,The Fourth Military Medical University,Xi′an 710032)

　　ABSTRACT　In cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs) of SD rat,it was found that 1×10^－7～1×10^－5 kg/L lipopolysaccharide(LPS) markedly stimulated proliferation and DNA synthesis of VSMCs in a dose dependent manner (P<0.05).A time-dependent marked inhibition in proliferation,DNA synthesis and viability of VSMCs (P<0.01)could be obtained by 5×10^－4～10^－3 kg/L LPS.The inhibitory effect of LPS could be prevented by L-NNA,which reduced NO production by inhibiting NOS.NO^－₃and NO^－₂of LPS group markedly increased(P<0.01):48 h group vs 24 h group increased by 9.1%,72 h group vs 48 h group increased by 4.5%.When 5×10^－4～10^－3 kg/L LPS was added,positive immunohistochemical staining of inductive nitric oxide synthase could be observed.These results suggest that LPS of low dose stimulated the proliferation and the DNA synthesis of VSMCs,while LPS of high dose markedly inhibited them probably due to the increased NO production.
　　Key words:lipopolysaccharide(LPS);vascular smooth muscle cells;proliferation;nitric oxide(NO);inductive nitric oxide synthase(iNOS)

　　细菌性感染是临床上常见的致病原因,其中以内毒素血症最为多见,常导致血管壁损伤、渗出、水肿,甚至可引起DIC或休克。LPS是内毒素的主要毒性成分。血管平滑肌是血管壁的重要组成部分,动脉粥样硬化、高血压等许多疾病的发生发展过程都与动脉平滑肌的异常增殖有关。血流中的LPS可损伤内皮细胞、血小板,甚至经破损的血管壁直接作用于VSMC,使这些细胞释放某些活性因子,引起一系列心血管反应,但其具体机制仍不十分清楚。本实验主要研究LPS直接作用於血管平滑肌细胞时,对血管平滑肌细胞的增殖、DNA合成和细胞活力的影响,并初步探讨其机制。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　　RPMI-1640培养基(美国Gibco)。新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所,批号961003)。NO^－₃,NO^－₂测试盒(南京建成生物工程公司)。³H-TdR(上海原子核研究所,摩尔活度为851 GBq/mmol)。iNOS一抗(中山公司)。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。LPS、MTT(美国Sigma)。PPO (FLUKE公司)。 POPOP(上海化学试剂一厂)。液体闪光计数器LS-6500(美国Beckman)。
　　1.2　方法
　　1.2.1　VSMC的培养　　SD大鼠,雌雄不限,体重150～200 g,4～8周龄。腹腔麻醉后,无菌操作取出胸主动脉段,按贴壁法培养VSMC^［1］。实验用3～10代传代细胞。细胞纯度达95%以上。
　　1.2.2　MTT法(四唑盐比色试验)^［1］　　测细胞的活力和增殖。用0.25％胰蛋白酶消化细胞并用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×10⁴个/ml,将细胞悬液移入96孔板(100 μl/孔),培养24 h后,换成含5%小牛血清的RPMI-1640,同时加入不同浓度的LPS,继续培养20 h后,每孔加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl,37℃继续孵育4 h后终止培养。小心吸弃上清液,每孔加入DMSO 150 μl,振荡10 min,用酶联免疫检测仪(波长490 nm)测定各孔的光吸收值,实验结果以A值表示。
　　1.2.3　～³H-TdR掺入实验^［1］　　测DNA合成。将细胞悬液移入96孔板(5×10³个/孔),加入含10％小牛血清的RPMI-1640,培养24 h后,换成含5％小牛血清的RPMI-1640,同时加入不同浓度的LPS,继续培养18 h后,每孔加～³H-TdR溶液50 μl(1.85 kBq/ml),37℃继续孵育6 h后终止培养。用液闪计数器进行～³H-TdR掺入量的测定。结果以cpm值表示。
　　1.2.4　细胞上清液中NO^－₃,NO^－₂含量的检测　　将细胞悬液移入96孔板(5×10³个/孔),加入含10％小牛血清的RPMI-1640,培养24 h后,换成含5％小牛血清的RPMI-1640,同时加入不同浓度的LPS,继续培养24、48、72 h后,终止培养。收集上清液,按照南京建成生物公司所提供的试剂盒,用分光光度法检测NO^－₃,NO^－₂的含量。
　　1.2.5　iNOS免疫组化染色　　将细胞悬液移入已置入玻片的培养皿中,加入含10％小牛血清的RPMI-1640,培养24 h后,换成含5%小牛血清的RPMI-1640,同时加入不同浓度的LPS继续培养24、48、72 h后,将贴有细胞的玻片夹出,用PBS(pH 7.4)冲洗10 min×2次,然后用4％多聚甲醛固定10 min,再用PBS(pH 7.4)冲洗10 min×2次,加入iNOS兔IgG多抗,抗体效价1∶50,4℃冰箱保存过夜。再按试剂盒说明逐一加入其他试剂,最后用DAB呈色,酒精系列浓度脱水,二甲苯透明,树胶封固。
　　1.2.6　实验数据均以均数±标准差(±s)表示,组间以t检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2.1　LPS对VSMC增殖及活力的影响
　　将不同浓度LPS加入细胞培养液,用MTT法和³H-TdR掺入法观察LPS对VSMC增殖、DNA合成及活力的影响。当LPS浓度为 10^－7～10^－5 kg/L时,实验组A值和cpm值均比对照组显著升高(P<0.05),表明低浓度LPS可促进VSMC的增殖及DNA的合成,且这种促进作用呈现剂量依赖效应。当LPS的浓度为5×10^－4～10^－3 kg/L时却呈现相反效应,其实验组A值和cpm值比对照组分别降低15.6%和51.7%,27.9%和75.9%。结果如图1所示,表明高浓度LPS抑制VSMC的增殖,DNA的合成,降低其活力。

图1　不同浓度LPS对VSMC增殖,DNA合成和活力的影响
Fig.1　Effect of different doses of LPS on the proliferation,
DNA synthesis and viability of VSMC
n=6,±s;^*P<0.05,^**P<0.01 vs control.:A value of MTT;---:³H-TdR incorporation.

　　2.2　10^－3 kg/L的LPS降低VSMC活力的时间依赖效应
　　前面实验观察到10^－3 kg/L的LPS可降低VSMC MTT的A值及DNA的合成。我们还观察到LPS的这种抑制作用呈现时间依赖效应(图2)。加药后,48 h组A值和cpm值比24 h组分别降低17.5%和71.4%;72 h组A值和cpm值比48 h组分别降低27.3%和39.9%。

图2　LPS降低VSMC活力的时间依赖效应
Fig.2　Suppressive effect of LPS on the time dependent viability of VSMC
n=6,±s;^*P<0.05;^**P<0.01 vs control.:A value of MTT;---:³H-TdR incorporation.

　　2.3　N-Nitro-L-Arginine(L-NNA)对LPS降低VSMC活力和DNA合成的影响
　　L-NNA是NOS的抑制剂。将L-NNA (5×10^－4 mol/L) 加入细胞培养液24 h后,测定VSMC的A值和cpm值与对照组无明显差别(P>0.05);把与上述同浓度的L-NNA和LPS(10^－3 kg/L)同时加入细胞培养液中,结果如图3所示,L-NNA可拮抗LPS对VSMC活力的抑制作用(P<0.05)。

图3　L-NNA对LPS降低VSMC活力和DNA合成的影响
Fig.3　Effect of L-NNA on the decrease of viability and DNA synthesis of VSMC induced by LPS
n=6,±s;^*P<0.05,^**P<0.01 LN,LPS vs control;^△P<0.05,^△△P<0.01,LPS+LN vs LPS.
□:A value of MTT;■:³H-TdR incorporation.

表1　细胞上清液中NO^－₃,NO^－₂的含量
Table 1　Change of NO^－₃,NO^－₂contents in medium

Group	Time/h	Content of NO^－3,NO^－2／mol^.L^－1 (±s)	P (vs control)
Control	24	12.38±2.32	>0.05
10^－5 (kg/L) LPS	24	12.38±2.91	>0.05
10^－4 (kg/L) LPS	24	13.03±3.17	<0.01
10^－3 (kg/L) LPS	24	353.60±16.39	<0.01
10^－3 (kg/L) LPS	48	385.92±18.14	<0.01
10^－3 (kg/L) LPS	72	403.22±20.59	<0.01
LPS+L-NNA	24	151.55±10.09	<0.01^*

n=6.^*P<0.01 vs 10^－3 kg/L LPS 24 h.2.4　细胞上清液中NO^－₃,NO^－₂的含量

　　将不同剂量LPS (10^－5～10^－3 kg/L)和LPS+L-NNA组加入细胞培养孔中,24 h后收取上清液;同时,10^－3 kg/L LPS再设48、72 h组各收取样本。结果如表所示:对照组和10^－5～10^－4 kg/L LPS作用组上清液中NO^－₃,NO^－₂的含量无显著差别;而10^－3 kg/L LPS组上清液中NO^－₃,NO^－₂的含量比对照组和10^－5～10^－4 kg/L LPS作用组明显升高(P<0.01)。加10^－3 kg/L LPS的三个不同时间点组之间进行比较,48 h组和72 h组比24 h组上清液中NO^－₃,NO^－₂的含量分别升高9.1%和14.0%。 LPS+L-NNA组NO^－₃,NO^－₂的含量比LPS组显著降低(P<0.01)。
　　2.5　iNOS免疫细胞组织化学
　　把长有细胞的玻片分为未加药的对照组、10^－5 kg/L LPS和10^－3 kg/L LPS处理组(又分为24、48、72 h三组),每组3张玻片。按试剂盒说明染色,结果显示:对照组和10^－5 kg/L LPS组呈阴性,仅见苏木素衬染后的蓝色胞核,胞浆不着色。10^－3 kg/L LPS组呈阳性,棕色的iNOS免疫反应产物位于胞浆,核呈空泡样,不着色。且随药物作用时间延长免疫反应产物着色加深。

　　3　讨论

　　内毒素参与动脉粥样硬化(As)、DIC、休克等多种疾病的发生和发展机制。LPS是内毒素的主要毒性成分。本研究表明低剂量LPS促进VSMC的增殖、DNA的合成和活力,这与Ross关于As发生机制的损伤学说有一致之处,提示低剂量LPS的刺激可能参与As的发生。1993年Ross^［2］又在自然科学杂志上发表文章,在原有对损伤反应学说的基础上,特别强调了生长因子、细胞因子和其他物质如NO等在As发生发展中的作用。由于NO极不稳定,我们通过测NO代谢产物NO^－₃,NO^－₂来间接反映NO的产量。发现10^－7～10^－5 kg/L LPS组NO^－₃,NO^－₂的量与对照组无显著差别,并不诱导NO的产生。已知VSMC中只存在iNOS,无结构型NOS(cNOS)^［3］。免疫组织化学染色显示小剂量LPS并不诱导VSMC中iNOS的表达。说明低剂量LPS促VSMC的增殖与自分泌的NO无关,而是通过其他因子或途径,其具体机制有待于进一步研究。有文献报道,LPS刺激VSMC可产生多种细胞生长因子，如:肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)、内皮衍生舒张因子/一氧化氮(EDRF/NO)等^［4］。这些因子对VSMC的增殖有促进和抑制的双重作用。Warner和Libby发现LPS可诱导VSMC合成TNF,TNF可促进sis原癌基因的表达,从而促进VMSC的增殖;同时TNF可诱导VSMC合成IL-1,IL-1一方面通过激活c-fos、c-mic、c-jun等原癌基因的表达,直接促进VSMC的增殖^［5］,另一方面还可刺激VSMC合成血小板衍生生长因子(PDGF),后者以自分泌的方式促进VSMC的增殖^［6］。此外,我们观察到高浓度LPS抑制VSMC增殖,DNA的合成和降低VSMC活力,且随时间延长这种抑制作用有增强趋势。在应用了一氧化氮合酶抑制剂L-NNA后,细胞的增殖,DNA的合成和活力与对照组相比显著增高。大剂量LPS组NO代谢产物NO^－₃,NO^－₂的量比对照组有明显增加。同时,只有大剂量LPS时才有iNOS的表达,且呈时间依赖性。这表明NO在LPS抑制细胞增殖,DNA的合成和活力过程中起重要作用。有文献报道,大剂量NO可作为细胞毒性分子^［7］,其作用机制可能通过以下几条途径:(1) NO与O₂/O^－₂结合产生OONO^－等氮氧自由基,有杀伤作用。 (2) NO可使 核糖核酸还原酶等失活,从而抑制细胞的增殖。 (3)通过损伤线粒体电子传递而抑制细胞呼吸。(4) 对DNA的直接损伤。 (5)介导肺组织内树突状细胞的活性。但关于LPS对VSMC抑制作用的确切机制还有待进一步研究。

作者单位：第四军医大学基础部病理生理学教研室,西安 710032

参考文献

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［5］汤 健,周爱儒.原癌基因与心血管疾病.北京:北京医科大学、协和医科大学联合出版社.1990,86～87。
［6］Wu　CC,Chou TC,Ding YA,et al.Evidence for inducible nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rats.Biochem　Biophys　Ras　Commun， 1996， 228　(2):459～466.
［7］Vallance P.Hyperdynamic circulation in cirrhosis:a role for nitric oxide? Lancet，1991，337～376.

1998-01-09收稿　　1998-03-25修回