大鼠心脏缺血-再灌注损伤
对心肌L-Arg/NO途径的影响

郑惠珍　唐朝枢 苏加林 吴涛

　　摘要　为探讨大鼠心脏缺血-再灌注损伤(IRI)期间一氧化氮(NO)生成增加的环节和过程。本实验用离体灌流大鼠心脏,预灌流15 min,停灌45 min,取30 ml KH 液循环灌流15 min,观察冠脉流出液中细胞胞浆酶(LDH)、蛋白质、肌红蛋白漏出量和NO^－₂含量、心肌组织NOS活性、L-精氨酸(L-Arg)转运的改变。结果显示,心脏IRI后,冠脉流出液中LDH活性、蛋白质和肌红蛋白量较对照组分别增加4.1,5.4和1倍(均P<0.01)。NO^－₂含量增加1.2倍(P<0.01)。心肌组织tNOS活性、iNOS活性和cNOS活性分别增加48.2%、43.2%和52.1%(均P<0.01)。NO^－₂含量与心肌组织iNOS活性呈正相关,(r=0.7942,P<0.01)。心肌组织L-Arg转运呈现高、低亲和两种方式。IRI组心肌L-Arg转运能力增强,最大转运速率(V_max)较对照组升高48％(低亲和,P<0.05)和2倍(高亲和,P<0.01); 低亲和Km值降低47.4%(P<0.05),高亲和Km值改变无统计学意义。L-Arg转运高、低亲和转运载体的V_max与iNOS活性、NO^－₂含量均呈高度正相关关系。结果提示: 心脏IRI时,心肌L-Arg转运能力增强,主要通过激活iNOS而增加NO的生成,L-Arg转运是NO生成的重要环节。
　　关键词: 心肌; 缺血-再灌注损伤; 一氧化氮; L-精氨酸转运; 大鼠
　　学科分类号: Q463；R331.3

EFFECTS OF MYOCARDIAL ISCHEMIA REPERFUSION
INJURY ON L-ARGININE/NITRIC
OXIDE SYSTEM IN RAT HEART

ZHENG　HUI-ZHEN，WU　TAO
Department of Physiology,Guangdong Medical College,Zhanjiang　524023;
TANG　CHAO-SHU，SU　JIA-LIN
Institute of Cardiovascular Research,Beijing Medical University,Beijing 100083

　　ABSTRACT　Ischemia reperfusion injury(IRI) model of rat heart was prepared by preperfusion for 15 min,then a suspension for 45 min and recycling reperfusion for 15 min with 30 ml KH buffer.The leakage of lactate dehydrogenase(LDH),protein,myoglobine and nitrite (NO^－₂) in the circular perfusion fluid were measured.Myocardial nitric oxide synthase(NOS) activity and L-arginine transport were observed.In the IR group,the leakage of LDH,protein,myoglobine and NO^－₂ were increased respectively by 4.1,5.4,1 and 1.2 times(P<0.01) and NOS(tNOS,iNOS,cNOS) activity by 48.2%,43.2%and 52.1%,(P<0.01,respectively) as compared with the control group.L-arginine transport might be mediated by either high- or low-affinity transport system in cardiac tissue.In the IR group,L-arginine transport increased significantly with the V_max being increased by 48% and 2 times respectively for the low-affinity and the high-affinity transport as compared with control.Michaelis constant (km) was decreased by 47.4% for low-affinity transport (P<0.05),but not significantly changed for the high-affinity transport.These results suggest that the increase of nitric oxide generation might result from the increased myocardial NOS activity and L-arginine transport during IRI.
　　Key words: myocardium; ischemia reperfusion injury; nitric oxide; L-arginine transport; rat

　　心脏缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI）是心脏外科、冠状动脉搭桥术等手术期间心肌损伤的主要因素,其发病机理尚未完全阐明。近年,心肌L-精氨酸/一氧化氮（L-arginine/nitric oxide,L-Arg/NO）系统在心脏IRI中的作用受到高度重视^［1］,大量资料表明,IRI时,心肌NO/cGMP生成增加^［2］,NO对IRI的病程和预后具有重要影响^［3，4］。但IRI的心肌NO生成增加的发生环节和机理迄今尚未完全阐明。本工作在离体灌流的大鼠心脏,观察IRI对L-Arg/NO途径的影响,以探讨IRI心脏NO生成增加的环节和过程。

　　1　材料和方法
　　1.1　大鼠心脏IRI模型制备　　体重150～250 g Wistar大鼠,雌雄兼有,氨基甲酸乙酯(1　g/kg) ip麻醉,摘取心脏悬挂于Langendorff灌流装置上,灌流液为Krebs-Henselert(KH)液,持续通混合气(95％ O₂－5％　CO₂),恒温37℃,灌流压7.85 kPa。预灌流15 min后,随机分为两组: （1）对照组(n=7)持续KH液开放灌流45 min,再用30 ml KH液循环灌流15 min。（2）缺血-再灌组(IR组,n=6)停止灌流,将心脏在保温、保湿条件下旷置45　min,再取30 ml用95％　O₂－5％　CO₂平衡的KH液循环灌流15 min。实验结束时,收集冠脉流出液分别测定乳酸脱氢酶(LDH)活性(全自动生化分析仪)、蛋白质(考马斯亮蓝法)、肌红蛋白漏出量^［5］及亚硝酸盐含量,并分别换算为每克(或每毫克)心肌组织释放量。取心肌组织进行下述测定。
　　1.2　一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）活性测定^［6］　取心肌组织约200 mg,制备匀浆,离心,上清液以考马斯亮蓝法定量蛋白,取含200 μg蛋白的上清液,加入孵育液［Tris-HCl缓冲液50 mmol/L,pH 7.4,内含NADPH,CaCl₂,钙调蛋白(或不含Ca²⁺,含EGTA),A-Arg 5 μmol/L和³H-A-Arg 0.025 kBq/管］100 μl,37℃振荡孵育30 min,加入冷终止液终止反应,再加入pH 8.0的Dowex AG50 W-X8(Na⁺型)混匀,4℃静置1 h,离心,取上清用β-液闪计数仪（FJ2115型）测定样本的³H放射活性。由此计算 ～³H-瓜氨酸的生成量,结合蛋白质浓度计算NOS的比活性,以每毫克蛋白每分钟生成的³H-瓜氨酸的pmol数表示。含Ca²⁺/钙调蛋白管为总NOS （tNOS）,不含Ca²⁺/钙调蛋白管为诱导型NOS （iNOS）,两者之差为固有型NOS （cNOS）活性。
　　1.3　心肌组织 ～³H－A-Arg转运测定　　参照Durante等人方法^［7］,每例取心肌组织约500 mg,制备1 mm厚组织薄片,均分为10管,每管加KH液1 ml,预孵育后,加³H－A-Arg,终浓度为0.01～10 mmol/L,37℃孵育1 min,用冷KH液终止反应并冲洗3次。组织经甲酸消化,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,取0.2 ml消化液加入闪烁液,在β-液闪计数仪上测定³H放射活性。同时做非特异转运管。计算组织摄入³H－A-Arg的量,以nmol/（mg pr^.min）表示。
　　1.4　材料　　Wistar大鼠由北京医科大学实验动物中心提供。L-［2,3-³H］-Arg为Dupont NEN产品（2.29 TBq/mol）,A-Arg、Dowex AG 50W-X8为Sigma公司产品。其余为市售分析纯制剂。
　　实验结果以表示,Student′s t test及相关与回归方法进行统计学分析。

　　2　结果

　　缺血45 min,再灌注15 min的心脏,冠脉流出液中LDH活性、蛋白质和肌红蛋白含量较对照组分别增加4.1、5.4和1倍（均P<0.01）。
　　2.1　IRI促进心肌组织摄取 ³H－A-Arg
　　心肌组织A-Arg转运Eadie-Hofstee plot呈现高、低亲和两种转运方式(图1B)。IR组心肌A-Arg转运能力增强; 最大转运速率(V_max)较对照组升高48％(低亲和,P<0.05)和2倍(高低亲和Km值降低47.4％(P<0.05),高亲和Km值的改变无统计学意义(表1,图1)。

表1　缺血-再灌注损伤对大鼠心肌组织A-Arg转运最大速率及米氏常数的影响
Table 1　Effects of ischemia reperfusion injury on cardiac tissue L-arginine transport and Michaelis constant

Group	Vmax　/nmol^.(mg pr^.min)^-1		Km ／μmol^.L^－1
	Low affinity	High affinity	Low affinity	High affinity
Control	15.8±1.8	2.3±1.5	1405±347	49±27
IR	23.4±2.3^*	7.0±1.7^**	739±249^*	61±21

,n=5.^*P<0.05,^**P<0.01 vs control.亲和,P<0.01)。

图1　缺血-再灌注损伤对大鼠心肌L-精氨酸转运动力学的影响
Fig.1　Effect of ischemia reperfusion injury on kinetics of cardiac
L-arginine transport in rat

　　2.2　IRI提高心肌组织NOS活性
　　IRI提高心肌组织NOS活性,tNOS活性、iNOS活性及cNOS活性较对照组分别增加48.2%、43.2%和52.1%(表2)。iNOS活性与A-Arg转运高亲和、低亲和载体的V_max均呈高度正相关,而cNOS活性与高亲和载体的V_max无相关关系(图2)。

图2　L-精氨酸转运与一氧化氮合酶活性的关系
Fig.2　Relationship between L-arginine transport and NOS activity

表2　缺血-再灌注损伤对冠脉流出液中亚硝酸盐含量及心肌NOS活性的影响
Table 2　Effects of ischemia reperfusion injury on nitrite content and nitric oxide synthase activity

Group	NO^－2／pmol^.mg^-1w.w	NOS ／pmol^.(mg pr^.min)^－1
		tNOS	iNOS	cNOS
Control	50.9±12.3	36.3±1.3	17.6±3.1	19.8±3.5
IR	112.9±28.6^**	53.8±4.4^**	25.2±3.0^**	28.6±6.2^**

^**P<0.01 vs control.

　　2.3　IRI增加NO释放
　　IRI使冠脉流出液中亚硝酸盐含量较对照组增加1.2倍(P<0.01)(表2)。NO^－₂与LDH、蛋白质、肌红蛋白漏出量均呈高度正相关,相关系数分别为 0.9301,0.8429和0.8724(均P<0.01)。
　　NO^－₂含量与A-Arg转运、iNOS活性也呈正相关关系,但与cNOS活性无此关系(表3)。

表3　L-精氨酸摄取、一氧化氮合酶活性与亚硝酸盐含量的相关关系
Table 3　Correlation between L-arginine uptake or nitric
oxide synthase activity and nitrite content

	r	P
High affinity Vmax－NO^－2	0.7397	0.0145
Low affinity Vmax－NO^－2	0.9135	0.0002
cNOS－NO^－2	0.5508	0.0989
iNOS－NO^－2	0.7942	0.0061

　　3　讨论

　　我们在预实验中观察到,心脏缺血45 min,再灌注15 min,冠脉流出液中NO^－₂含量在可检测范围之外,因而采用30 ml KH液循环灌流15 min的方法,提高冠脉流出液中NO^－₂含量。实验观察到缺血再灌注后,心肌胞浆酶LDH,细胞内蛋白质和肌红蛋白大量漏出释放入灌流液中,心肌NO生成增加,与文献报道一致^［2］。同时观察到,冠脉流出液中亚硝酸盐含量与酶漏出、蛋白质漏出呈高度正相关,提示心肌损伤程度与NO释放量呈正比。
　　细胞NO的生成,以A-Arg为底物,经NOS催化生成。A-Arg与多种生理过程有关,它是蛋白质、肌酸、聚胺生物合成的前体,是尿素循环的中间产物,最近已经证明,A-Arg是NOS的唯一底物。细胞内A-Arg除部分为代谢产生外,主要源于细胞外组织间液,经细胞膜上转运载体（transporter）转运入细胞内,贮存于A-Arg池。转运A-Arg的载体主要为Na⁺-非依赖系统Y⁺型(Na⁺-independent system Y⁺),近年已对该转运体作了受体研究^［8］。在巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等细胞类型上观察到^{［7,9～11］},A-Arg转运体有高、低亲和两种成分,高亲和成分主要为Na⁺-非依赖系统Y⁺型,低亲和成分为b^o,+型．本实验观察到,大鼠心肌组织A-Arg转运也存在高、低亲和两种成分,其Km值分别为(49±27) μmol/L 和(1?405±347) μmol/L。生理血浆A-Arg浓度为50～100 μmol/L^［9］,以高亲和成分起主要作用。IRI提高心肌摄取A-Arg的能力。表现为A-Arg浓度-转运曲线上移,在相同浓度下,A-Arg转运速率显著高于对照组（P<0.01）; 高亲和、低亲和的最大转运速率（V_max）均显著增高（P<0.01); 低亲和的Km值有意义地降低（P<0.05）,提示心肌IRI通过上调高、低亲和的A-Arg转运载体数量及提高低亲和转运载体酶活性而促进A-Arg跨膜转运。
　　心脏存在两种类型NOS,即固有型（cNOS）分布于血管内皮,心内膜(ecNOS)和心内神经末梢(ncNOS),为Ca²⁺依赖性; 　诱导型（iNOS）分布于吞噬细胞、心肌细胞和血管平滑肌细胞,为非Ca²⁺依赖性。经cNOS合成NO不需要依赖细胞外的A-Arg,而经iNOS合成NO则需依赖细胞外的A-Arg跨膜转运^［9］。心肌IRI时,NOS基因表达增加,活性增加。本实验观察到,IRI后心肌两型NOS活性都显著升高,但仅iNOS活性与A-Arg跨膜转运的高、低亲和转运载体的V_max呈高度正相关关系; 而cNOS活性无此关系; iNOS活性与NO^－₂释放量正相关,而cNOS活性与NO^－₂释放量无相关关系; 此外,不论高亲和或是低亲和A-Arg转运载体的V_max均与NO^－₂产生量高度正相关(P<0.01),这些结果表明,在心肌组织,IRI心肌的A-Arg转运能力提高,主要通过激活iNOS活性而增加NO的生成和释放,A-Arg转运是NO生成的重要环节。Bogle^［10］,Durante^［7,9］,Green^［11］等报道^［12］,巨噬细胞株J744、血管平滑肌细胞、内皮细胞,A-Arg转运增加时NO生成也增加,A-Arg转运体抑制剂L-Lysine或L-ornithine抑制A-Arg转运和NO生成,提示A-Arg转运为NO生成的重要调节步骤。心肌组织可能存在与上述细胞相似的调节过程。但心肌组织成分复杂,心肌细胞本身A-Arg转运的特征如何,在IRI中的作用如何,有待进一步研究。

作者单位：郑惠珍　吴涛：广东医学院生理学教研室,湛江 524023;
　　　　　唐朝枢^?苏加林：北京医科大学心血管基础研究所,北京 100083

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1997-12-27收稿　　1998-03-30修回