胞内记录猫体感皮层内脏伤害性
感受神经元的电生理特性^*

陈京红　滕国玺

　　摘要　为了从细胞水平探讨皮层内脏伤害感受的特性及机制,本文应用细胞内电位记录技术,观察了猫体感皮层内脏大神经皮层代表区的851个神经元对电刺激内脏大神经的诱发反应及电生理特性。其中412个单位为内脏伤害性感受神经元,其自发放电有多种形式,根据诱发反应现象分为特异性和非特异性伤害感受神经元,内脏伤害性诱发反应分为兴奋性反应(51.7%)、抑制性反应(31.31%)及混合性反应(17%)三类。在形式上具有潜伏期长、反应形式复杂等特点。实验发现85个神经元为内脏及肋间神经的会聚反应细胞。部分神经元用神经生物素进行细胞内电泳标记以显示功能细胞所在层次及形态。结果说明皮层体感神经元具有内脏伤害性感受的作用,并从细胞及突触后电反应特点上探讨了内脏痛的感受机制。
　　关键词:皮层体感区;内脏;伤害性感受;细胞内记录;标记;痛
　　学科分类号:R338.8,R338.25

INTRACELLULAR ELECTROPHYSIOLOGICAL
CHARACTERISTICS OF VISCERAL NOCICEPTIVE
NEURONS IN CORTEX SⅠ AREA OF CATS^*

CHEN　JING-HONG，TENG　GUO-XI
(Laboratory of Neurophysiology,Brain Research Institute,China Medical University,Shenyang 110001)

　　ABSTRACT　In the present work we investigated electrophysiological properties of visceral noci～cep～tive neurons in the primary somatosensory cortex (SⅠ).Intracellular recordings of 851 neurons in the representing area of greater splanchnic nerve (GSN) in SⅠ area were made in 22 cats.The neurons showed a variaty of modes in sponteneous discharges,which could be classified into visceral nociceptive neurons (VNNs) and non-visceral nociceptive neurons (NVNNs).VNNs (412) could be further divided into specific and non-specific subtypes,with three distinct response modes:excitatory,inhibitory,and mixed response.These responses were characterized by longer latency and complex responsive fashion.In addition,85 single convergence neurons induced by input from GSN and intercostal nerve were observed.Neurobiotin was injected into some of the cells by electrophoresis to identify the depth and morphology following recordings.The results indicated that VNNs were located in the SⅠ area.
　　Key words:somatosensory cortex;visceral;nociceptive;intracellular recording;labeling;pain

　　内脏痛是与躯体痛性质不同的一种伤害性感觉,也是最普遍的临床症状之一,它给患者带来巨大的痛苦。内脏痛的研究起步不晚,因研究难度较大,与躯体痛相比其发生机制及中枢传导的研究进展相当缓慢^［1］,且多限于对外周传入及脊髓节段的研究。因内脏痛觉是一种主观体验,因此伤害性冲动必然上升到大脑皮层而进入意识领域,但迄今为止,用细胞内记录的方法支持这种论断的证据十分有限,仅限于皮层内脏伤害性感受的诱发电位^［2］及胞外放电的研究^［3,4］,而对于皮层体感区内脏伤害性单个感受神经元的电生理及形态特性的系统研究仍未见报道。
　　目前痛觉的皮层感受日益引起重视,而感觉皮层对功能的理解在极大程度上取决于不同皮层神经元的性质,能否从单一内脏伤害感受细胞的反应模式去解释内脏痛复杂的感受特性,是一个令人十分感兴趣的问题。所以,本课题用在体微电极细胞内记录技术,研究皮层体感区（primary somatosensory cortex,SⅠ) 中内脏大神经代表区的内脏伤害性感受神经元的电生理特性,并对部分神经元用神经生物素(neurobiotin)进行标记,从单细胞的机能特性及与形态结合的角度,联系内脏痛感受的特殊性探索内脏痛传导的皮层内感觉机制,为皮层在内脏痛感受中的作用提供新的科学依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物准备　　选成年健康猫22只,体重2.0～3.2 kg。前肢局麻条件下静脉插管,建立给药途径。戊巴比妥钠（40　mg/kg）静脉麻醉,于左侧背部腹膜外暴露内脏大神经（greater splanchnic nerve,GSN ）,于其向中端置双极银丝保护刺激电极(极间距离2.5 mm),置神经蜡和明胶海绵以绝缘并吸收体液,防止因电流外溢引起的周围组织兴奋所致的躯体性传入的影响。部分实验分离11～12肋间神经,亦置刺激电极,并用神经蜡保护之。暴露皮层SⅠ区GSN代表区（AP,23 mm;LR,4 mm）^［5］,并用50℃固定熔点的蜡覆盖脑表面以防干燥及脑波动。做小脑延髓池引流以降低脑压。维持肛温于37～38℃,实验过程中按时补充麻醉药,部分实验用三碘季铵酚制动^［6］。
　　1.2　电生理记录　　细胞内记录的玻璃微电极尖端直径≤0.5μm,内充3 mol/L KCl溶液,同时作胞内标记时内充神经生物素(Sigmar产品)的醋酸钾溶液。于右侧SⅠ中GSN代表区,选放电形式稳定、RP绝对值大于40 mV、电极停留5 min以上的神经元进行观察,不符合条件者舍弃。将引导的细胞内电位经MEZ-8201生物放大器输入VC-10示波器,观察神经元的电活动同时作磁带记录,ATAC-350机处理数据,并由X-Y记录仪描记实验结果。
　　刺激GSN的参数为波宽0.5～1.0 ms,强度0.6～1.0 mA的单方波电流,此强度足以使该神经中Aδ和C纤维兴奋,并产生瞳孔变化等痛反应,刺激反应可被吗啡抑制。
　　观察完电生理现象后,某些神经元进行神经生物素电泳,其参数:强度1～3nA、波宽为220 ms、频率1　Hz的正电流,时间为3～15 min。实验完毕后,于左心室灌流生理盐水和固定液(多聚甲醛和戊二醛),取脑块于固定液中放置过夜,翌日做冠状连续切片(70μm)。
　　1.3　组化染色检查　　将切片经带有HRP的Strepavidin处理后,PBS 冲洗,DAB呈色反应,酒精、二甲苯系列脱水透明,光镜检查分析,部分刺激相关神经元用中性红染色进行组织学定位（如图1 为所标记的皮层体感区第Ⅴ层细胞）。

图1　在皮层体感区第Ⅴ层的神经生物素标记神经元的显微照相图
Fig.1　　Microphotograph of the neuron labelled by neurobiotin in SⅠ
area lamina Ⅴ (×85)Scale bar,10μm.

　　1.4　统计方法　　采用组间对照,数据用t检验统计处理,P<0.05为显著性界值。

　　2　结果

　　实验共记录851个神经元（平均静息电位,－53.91±10.08 ）的细胞内电位反应,将对强刺激GSN出现诱发反应的神经元叫做内脏伤害感受神经元(visceral nociceptive neurons,VNNs,占总数的48.41%),不出现反应的神经元叫非内脏伤害感受神经元(non-visceral nociceptive neurons,NVNNs,占51.59%)。在VNNs中,又根据诱发反应性质将仅对伤害性刺激产生长潜伏期反应的VNNs叫做特异性内脏伤害感受神经元(specific visceronociceptive neurons,SVNNs),具有短潜伏期反应的VNNs则叫做非特异性内脏伤害感受神经元(non-specific visceronociceptive neurons,NSVNNs)。胶质细胞多为│RP│>70 mV且呈非活动静息状态神经元。SⅠ区 GSN 代表区同一柱状结构细胞放电形式、刺激诱发反应均近似。
　　2.1　皮层内脏伤害性感受神经元电生理特性
　　2.1.1　VNNs的自发生物电活动形式　　皮层GSN代表区VNNs自发电活动形式呈多种多样,但主要有下列6种模式（见图2）。

图2　SⅠ区VNNs的自发生物电活动模式
Fig.2　Modes of biological electric activities of visceral nociceptive neurons in SⅠ area
A:Non-discharges in resting state.B:Synaptic noise activites.C:Occasionally discharges.D:Continous tonic discharges.E:Rhythmic high frequence discharges.F:Pair-spikes.

　　在细胞内电反应记录过程中,对VNNs和NVNNs 的部分电学特性及深度分布进行比较,发现两者存在某些差别,如表1所示。NVNNs的静息电位绝对值高于VNNs。分别随机统计100个VNNs或NVNNs,发现VNNs中具有自发放电性质的细胞数及放电频率均高于NVNNs,但放电幅值无显著差异。在皮层深度分布上,VNNs相对深于NVNNs。

表1　猫皮层SⅠ区 VNNs 和 NVNNs 部分特性的比较
Table 1　Comparison of partial characterisitics between VNNs and NVNNs

	VNNs (n )	NVNNs (n )	Statistic analysis
Resting potential /mV	-50.24±10.08 (n=100)	-56.70±15.90^**(n=100)	P<0.01
Cells having discharge	76 (n=100)	32 (n=100)
Cells without discharge	24	68
Frequency of discharges	63.45±13.60 (n=45)	40.90±10.58^**(n=25)	P<0.01
Amplitude of discharges /mV	39.85±7.18 (n=45)	36.09±6.47(n=25)	P>0.05
Depth distributed H/μm	1184.12±744.8 (n=45)	880.00±581.10^**(n=25)	P<0.01

±s.^**P<0.01 significantly different from VNNs.

　　2.1.2　VNNs的诱发反应　　(1)阈强度:根据GSN刺激强度不同,NSVNNs产生不同反应,0.4 mA以下时只出现短潜伏期的诱发反应,随强度增加出现长潜伏期的反应成分,且EPSP上锋电位增加,当强度达到0.6 mA以上时,反应成分不再增加,提示内脏痛伤害性反应阈值为0.6 mA,本研究均采用1.5 倍阈上电流刺激GSN作为内脏痛伤害性刺激。(2) VNNs诱发反应特性:诱发反应分为兴奋性(51.70%)、抑制性(31.31%)及混和性(17.0%)等。对无或仅有少量自发放电的VNNs,阈上刺激时呈潜伏期固定的诱发反应,而高频自发放电的神经元诱发反应整合后呈诱发锋电位、增频、高频抑制及放电模式转换等现象。
　　诱发反应有兴奋性突触后电位(EPSP)和抑制性突触后电位(IPSP),本实验观察到从单一到多成分的各种反应,一般短潜伏期成分是小于35 ms的反应,第二成分多在70 ms左右,第三、第四成分分别在140和230 ms左右。还发现短潜伏期成分如单个EPSP为(30.83±28.00)ms (n=30)、单个IPSP为(35.5±6.55) ms,(n=10)均比实验曾看到的SⅠ区躯体隐神经反应潜伏期［单个EPSP(5.77±4.08)ms,单个IPSP(11.44±6.46) ms,n=10］为长(P<0.01),SVNNs的痛反应潜伏期［如单一EPSP (68.67±14.31)ms,n=15］也明显长于躯体神经伤害性刺激潜伏期［(45.00±11.78)ms,n=10］(P<0.01),VNNs的反应时程［(25.78±8.97)ms n=50］也长于躯体反应［(19.39±7.95)ms n=20］ (P<0.01)。此外,VNNs中IPSP出现率(18.2%)大于躯体伤害性感受神经元的IPSP的出现率(9.3%)。其反应形式:(1) 兴奋性反应:包括刺激诱发的EPSP及其上的锋电位发放、诱发锋电位或增频反应。在增频反应中,兴奋性后发放较多,持续性后续增频效应能持续几秒到几十秒,本研究中有21个此类型反应神经元(见图3)。(2) 抑制性反应:包括局部超极化(IPSP) 和锋电位抑制及减频反应。锋电位抑制可使自发放电产生抑制甚至使自发锋电位消失(见图4)。(3) 混合性反应:包括EPSP-IPSP序列反应神经元43个,先抑制后兴奋性17个及先兴奋后抑制性神经元12个。

图3　不同VNNs对刺激内脏大神经所诱发的各种兴奋性反应
Fig.3　Excitatory responses in variety of VNNs evoked by stimulating GSN
A:Uni-EPSP.B:Poly-EPSPs.C:Spikes on EPSP.
D:Uni-spike.E:Spikes on EPSP in spontaneous dis-
charges condition.F:Increased discharges (upper curve as control).

图4　　不同VNNs对刺激内脏大神经诱发的抑制性反应
Fig.4　Inhibitory responses of VNNs in SⅠ evoked by stimulating GSN
A:Uni-IPSP.B:Double IPSPs.C:IPSP (in discharges).D:Poly IPSPs(in discharges).E:Discharges
vanished gradually.

　　2.2　吗啡对GSN诱发的SⅠ区VNNs反应的影响
　　对3次检查潜伏期和反应形式都较稳定的神经元,静脉注射1 mg/kg吗啡,1 min后长潜伏期放电消失,3 min后诱发反应均消失,20 min后部分神经元可以恢复。说明吗啡可抑制VNNs的反应,观察10例效果基本相同,但有些神经元在反应尚未恢复前电极脱出细胞。
　　2.3　内脏与肋间神经伤害性刺激反应在SⅠ区同一神经元的会聚现象
　　对263个神经元观察伤害性刺激GSN和同节段肋间神经产生的反应,看到内脏-体躯传入的85个会聚神经元(占32%)(见图5)。这些神经元多居深层,与细胞外实验结果类似^［13］。此类神经元对两种神经刺激均发生反应,两者的诱发反应形式类似的占72.35%,肋间神经诱发反应的潜伏期相对短些,对两类神经交替进行条件-检验刺激检查发现,在刺激间隔20 ms以上的情况下,条件刺激引起的诱发反应,在某些曲线图中可看到使检验刺激所引起的诱发反应幅值减小或潜伏期后移的现象,提示可以产生会聚性抑制。

图5　在同一神经细胞上内脏大神经和肋间神经的传入会聚
Fig.5　Convergence of splanchnic and intercostal nerve upon the same neuron
The responses induced by stimulating GSN(latency 70 ms)(A)
and intercostal nerve (latency 56 ms) (B)

　　3　讨论

　　3.1　皮层GSN代表区VNNs诱发反应的特点
　　3.1.1　诱发反应具有内脏痛反应性质　　反应主要表现为兴奋性、抑制性和混合性反应三种形式,与Follett 新近用细胞外记录直肠扩张引起的反应类似^［3,4］。GSN是上腹腔痛觉传入的主要神经,SⅠ区中又存在GSN的明确代表区。根据以前的工作证实,潜伏期60～70 ms左右的诱发反应系由Aδ纤维传入引起^［8］,陈培熹等人作的 GNS诱发的 SⅠ区C-CEP,潜伏期大于(127.5±28.0)ms的反应,认为由C类纤维传入所致,可作为内脏痛研究的适宜指标,而潜伏期更短的反应可能系由A类纤维传入诱发^［2］。本实验观察的VNNs 诱发反应中30 ms左右的成分可能为非痛觉反应成分,潜伏期70 ms左右的成分为Aδ纤维传入引起,大于140 ms的反应为C纤维传入所致,我室以往的驱体伤害实验已有类似证实。因此,VNNs反应的潜伏期较长、后作用也长、反应还可被吗啡等药物所抑制以及给GSN电流剌激后可观察到散瞳等痛反应现象,可说明其具有内脏伤害感受性质。
　　3.1.2　潜伏期长及具有复杂的反应形式　　本实验观察到短潜伏期的触觉反应成分、内脏伤害性反应潜伏期及反应时程都明显长于我们曾作的 SⅠ区躯体隐神经伤害性反应（P<0.01）,因内脏痛觉的传入主要由传导速度慢的C类纤维传导,C纤维主要传导慢痛。在反应形式上比较特异的是许多神经元在剌激数百毫秒后爆发持续性兴奋后发放（21个单位）、EPSP-IPSP或更复杂的序列反应（43例）及抑制-兴奋混合反应（29例）,与我室以前对躯体伤害性剌激反应相比,这些复杂的反应所占比例大且形式更为复杂^［7］,我们推测VNNs 与其相联系的神经网络联系比较复杂,因为只有通过不同的神经网络才表现出不同的生物电活动,由此可进一步设想内脏诱发反应的这种复杂性及潜伏期长的特点可能是皮层内脏痛感受定位弥散、触觉和痛觉感受迟缓、具有持续性且适应差等现象的神经元基础之一,可能是内脏触痛觉的传导经这更复杂的神经环路调节所致,有待进一步证实。
　　3.2　内脏伤害性感受神经元的自发电活动
　　3.2.1　放电型式的多样性　　VNNs的自发放电表现为典型的非递减性动作电位,可能同细胞内外环境的化学因子、膜阻抗的变化以及神经闭合环路或附近部位电路中的电流扩布等因素有关。有些细胞显示跨膜电位自发超极化和去极化的阈下振荡,即EPSP和IPSP所构成的突触噪声的变化,而不规则自发放电就是在这种突触噪声的基础上发展起来的。另一部分神经元则不具有这种突触后电位变化,而是显示前电位的缓慢平滑的周期性去极化,达到阈电位水平时便转变为动作电位,这就形成规则的紧张性的自发放电,是维持大脑皮层兴奋性的基础,用以及时响应突触冲动的传入。所以,自发活动的存在赋于感受细胞以极高的敏感度,对决定中枢神经系统的活动水平起重要作用。
　　对节律性放电的形成有几种解释:一种认为是神经元本身的兴奋性的周期变化从而具有内在的节律性^［9］。另一种认为神经元接受不同时续的兴奋性和抑制性交替传入而造成的^［10］。我们则认为是因为神经元处于复杂的神经网络之中,由闭合环路活动的结果。
　　3.2.2　内脏伤害性感受细胞更为活跃　　VNNs中具有自发放电细胞多于NVNNs,且自发放电频率显著高于NVNNs中自发放电细胞的频率。VNNs的RP更接近于阈电位,所以我们认为VNNs自身兴奋性高,且多处于活跃状态、易于响应及感受由更多突触传递的内脏传入的微弱信息。这与我们关于两种神经元膜特性存在差异的结果有关^［14］。
　　3.3　位置和深度分布　　大脑皮层细胞的特点之一就是具有明显的层次分布,SⅠ区神经元不论在位置:构筑和功能方面都具有高度特异性。本实验所记录的VNNs位于SⅠ区前中部即后乙状回的前部,并且在皮层各层均有分布,但分布比例不同,根据电泳Neuroitin标记及记录电极插入的深度进行定位,VNNs主要存在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层,其深度分布与NVNNs相比偏于深层（P<0.01),其它研究者也看到类似结果^{［11～13］}。
　　本实验发现在SⅠ区GSN代表区VNNs的比例占48.41％,远大于隐神经代表区伤害感受神经元比例（23.68％）,VNNs的IPSP的出现率高于躯体感受神经元,而且VNNs在代表区中分布较为弥散。此现象从侧面说明外周神经在其皮层代表区域反应部位较明确。而内脏痛属于多节段传入感觉,并形成复杂的神经网络,所以其代表区中VNNs较多,抑制性反应较多,投射分散,这是否与内脏感受定位不明确、感受不精细有关,还有待验证。
　　综上所述,与躯体伤害性感受神经元相比,VNNs诱发反应潜伏期长、反应形式复杂、感受神经元分布弥散,这些特点可能是内脏和躯体伤害性反应特点不同的基础之一。
　　衷心感谢刘素珍和蔡葵老师在本文实验中所给予的热情指导和大力协助。

*国家自然科学基金资助项目 (No.39170294)
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39170294)

作者单位：中国医科大学脑研究所神经生理研究室,沈阳 110001
　　　　　陈京红：现在通讯地址:军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850

参考文献

［1］Gebhart GF,Ness TJ.Mechanisms of visceral pain.In:Bond M,Charton JE,Wolf CJ Eds.Proceedings of the Ⅵth World Congress on Pain.　 Amsterdam:Elsevier Science Publishers BV,1991,351～363.
［2］Chen PX (陈培熹),Chen ZH (陈助华).Average evoked potential in the somatosensory cortex elicited by SPL A and C fiber imput.Acupunct Res (针刺研究),1987,12 (2):149～153 (in Chinese with English abstract).
［3］Follett KA,Dirks B.Characterization of responses of primary somatosensory cerebral cortex neurons to noxious visceral stimulation in the rats.Brain Res,1994,656 (1):27～32.
［4］Follett KA,dirks B.Responses of neurons in ventrolateral orbital cortex to noxious visceral stimulation in the rat.Brain Res,1995,669 (2):157～162.
［5］Tyner CF.Splanchnic nerve activation of single cells in the cat′s post-crucriate motosensory cortex.Exp Neurol,1979,63 (1):76～93.
［6］Kang R.Convergence of sensory inputs in somatosensory cortex:Interactions from separate afferent.Exp Brain Res,1985,57:271～278.
［7］Teng GX (滕国玺),Gong YS (龚益生),Liu SJ (刘素珍),et al.Influence of stimulation of nerve of hind limb on intracellular potentials of the neurons in primary sensory cortex of cat.J Chin Med Univ (中国医科大学学报),1996,25 (6):567～570 (in Chinese with English abstract).
［8］Sha L (沙 磊),Ding W (丁 伟),Teng GX (滕国玺).Responses of neurons in the somatosensory area to electric stimulation of nerve peroneus communis.Acupunct Res (针刺研究),1992,17 (3):151～155 (in Chinese with English abstract).
［9］Linas RR.　 The intrinsic 　electrophysiological 　properties of mammalian neurons:　Insights into central neurons system function.Science,1988,242:1654～1664.
［10］Shepherd GM,Koch C.Introduction to synaptic circuits.In:Shepherd GM,ed.The Synaptic Organization of the Brain.3rd,ed.London:Oxford University Press,1990,1～31.
［11］Lamour Y,Willer JC,Guilboud G.Rat somatosensory cortex:I.Characteristics of neuronal responses to noxious stimulation and comparison with responses to non-noxious stimulation.　Exp Brain Res,1983,49:35～45.
［12］Yamamura H,Iwata K,Truboi Y,et al.Morphological electrophysiological properties of ACCx nociceptive neurons in rats.　Brain Res,1996,735:83～92.
［13］Yamamoto T,Samejima A,Oka H.The mode of synaptic activation of pyramidal neuron in cat primary somatosensory cortex:an intracellullar HRP study.Exp Brain Res,1990,80:12～22.
［14］Chen JH (陈京红),Teng GX (滕国玺).Comparsion of membrane electrophysiological characteristics of visceral and non-visceronociceptive neurons in cortex SⅠ area.Chin Sci Bull　(科学通报),1998,43 (14):1467～1472 (in Chinese).

1997-11-26收稿　　1998-03-12修回