谷氨酸对大鼠海马CA₁区神经元的短暂性
外向K⁺电流的影响^*

许长庆　张宗明　夏作理　吴才宏　周培爱

　　摘要　为了在离子通道水平探讨谷氨酸对急性分离海马CA₁区神经元的短暂外向K⁺电流的影响。用7～10 d大鼠,以链霉蛋白酶E酶解加吸管吹打法制备海马CA₁区神经元; 利用全细胞膜片箝技术,观察了谷氨酸对海马CA₁区锥体细胞的短暂性K⁺电流的影响。结果观察到谷氨酸对短暂性K⁺电流有明显抑制作用,且呈明显浓度依赖性、时间依赖性和部分电压依赖性。上述结果表明,谷氨酸对K⁺通道的影响在中枢神经系统中具有重要作用。
　　关键词: 谷氨酸; 海马; 神经元; 电生理学
　　学科分类号: R338.26

EFFECTS OF GLUTAMATE ON TRANSIENT OUTWARD
POTASSIUM CURRENT OF DISSOCIATED HIPPOCAMPAL
NEURONS IN CA₁ SECTOR IN RATS^*

XU　CHANG-QING
Department of Neurology,Central Hospital of Jiangmen District,Jiangmen 529071
ZHANG　ZONG-MING
Department of Surgery,Third Affiliated Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100083
XIA　ZUO-LI
^*Department of Gerontology,Affiliated Hospital,Taishan Medical College,Tai′an 271000
WU　CAI-HONG,ZHOU　PEI-AI
National Laboratory of Biomembrane and Membrane Bioengineering,Peking University,Beijing 100871

　　ABSTRACT　The effects of glutamate on the transient outward potassium current of dissociated hippocampal CA₁ neurons of 7～10 d rats were studied by the whole-cell patch clamp technique.It was found that glutamate could block the transient potassium current in a dose- and time-dependent manner.The effect was partly voltage-dependent.These results suggest that glutamate may decrease the membrane conductance of K⁺ channels in hippocampal neurons.
　　Key words: glutamate; hippocampus; neurons; electrophysiology

　　谷氨酸是中枢神经系统的兴奋性神经递质之一,其在兴奋性突触传递、信号系统、学习和记忆及神经可塑性等方面具有重要功能,但是,谷氨酸的释放过量对神经元有毒性^［1］。短暂性前脑缺血后选择性海马CA₁区锥体神经元坏死是神经变性疾病领域的中心课题之一,因为其直接与记忆损伤有关^［2,3］。在脑缺血时,谷氨酸和天门冬氨酸比缺血前增加3～8倍,导致中枢神经系统的影响区的细胞外液中谷氨酸和天门冬氨酸大量积聚^［3］。谷氨酸在中枢神经系统中的作用近年受到广泛重视,其对K⁺通道的作用机制,尚不清楚。目前急性分离大鼠海马CA₁区神经元的技术已经成熟,且分离出的海马CA₁区神经元具有正常的电生理学特性^［4］。本实验利用膜片箝全细胞记录技术,观察了谷氨酸对急性分离的海马CA₁神经元短暂性外向K⁺电流的影响,探讨谷氨酸在离子通道水平对中枢神经元K⁺通道的影响,以期了解谷氨酸的生理作用或病理意义。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　　SD大鼠,鼠龄7～10 d,体重15～23 g,雌雄不拘,中国科学院动物研究所动物室提供。链霉蛋白酶E(Pronase E)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、氯化四乙胺(TEA-Cl),4-氨基吡啶(4-AP),己二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA),Mg-ATP,三羟甲基氨基甲烷(Tris),L-谷氨酸,均为Sigma公司产品。河豚毒素(TTX),北京防化研究院四二室提供。其余为国产分析试剂。孵育液(mmol/L):NaCl 124,KCl 5,KH₂PO₄ 1.2,MgSO₄1.3,CaCl₂ 2.4,NaHCO₃ 26,glucose 10,用5％CO₂～95％O₂调pH至7.4。无Ca²⁺ EGTA孵育液:将孵育液中的CaCl₂换成EGTA 2 mmol/L,其余成分相同。标准细胞外液(mmol/L):NaCl 150,KCl 5,MgCl₂ 1.1,CaCl₂ 2.6,HEPES 10,glucose 10,用Tris-HCl调pH至7.4。电极内液(mmol/L),KCl 65,KOH 5,KF 8.0,HEPES 10,EGTA 10,Mg-ATP 2,用Tris-HCl调pH至7.2。
　　1.2　海马CA₁区神经元的急性分离　　大鼠断头取脑,置孵育液(0～4℃)中10～20　s,分出海马,手工切成约500 μm厚的脑片,置于32℃孵育液内,连续通以5%　CO₂+95%　O₂混合气。2　h后换为含1.5 mmol/L链蛋白酶E的孵育液(32℃),40 min后用无钙孵育液和含钙孵育液各洗3次。然后分出CA₁区,移入盛有氧饱和标准细胞外液的离心管内,先后用400和150 μm左右的Pasteur吸管轻轻吹打,静止约2 min,取口部细胞悬液,加入含标准细胞外液的培养皿内,约15 min后细胞贴壁,即刻行全细胞膜片箝记录。
　　1.3　全细胞膜片箝记录　　玻璃微电极拉制后尖端直径为1～2 μm,充满电极内液后阻抗为2～5　MΩ,记录在20～24℃的室温下进行,记录前向细胞外液内加入1 μmol/L TTX ,0.2 mmol/L CdCl₂,实验用EPC-7(List,Germany)膜片箝放大器。当电极尖端与细胞膜之间形成高阻封接大于5　GΩ)后,负压破膜,使电极内液与细胞内液相通,调节放大器放大后通过接口Labmaster TL-1 (Axon Instruments,USA)与一台386微机相连,经3 kHz滤波。采样频率为10 ～50 kHz。保持电位(holding potential,HP)及箝制测试脉冲顺序的设定、信号采集与储存、结果分析均借助微机用pCLAMP 5.5.1软件完成。
　　1.4　加药方式　　用标准细胞外液将谷氨酸配成不同浓度。在全细胞记录条件下,用快速加药装置加于神经元周围,加药管内径为220 μm,管口距细胞约100 μm。

　　2　结果

　　2.1　海马CA₁区神经元的短暂性K⁺电流的分离
　　短暂性外向(快速失活)K⁺电流(A电流,I_A)的分离,利用pCLAMP　5.5.1软件,通过程序相减获得（图1）。首先在保持电压－100 mV下给予去极化刺激从－80 mV到+40 mV记录到的电流变化,刺激阶梯为10 mV。在超极化保持电压下(－100 mV),每个去极化刺激间隔3 s足以使钾通道的短暂性成分完全激活。此程序下可记录到钾电流的两种成分: 一是快速激活和失活的A电流; 另一个是具有慢激活,且几乎不失活的持续的外向K⁺电流成分。然后在保持电压为-60 mV下给予从-80 mV到+40 mV去极化刺激,记录电流变化,刺激阶梯为10 mV,可记录出一种缓慢激活且几乎不失活的持续外向K⁺电流。前者减去后者剩下只有短暂性外向K⁺电流成分。2 mmol/L 4-AP(4-氨基吡啶)对A电流的I-V 曲线影响见图2 。可见A电流去极化-50 mV以上被激活,I-V 曲线呈线性关系,去极化到+90　mV电流值未达饱和（实验结果未列出）,能被2 mmol/L 4-AP大部分阻断。A电流对TEA(20 mmol/L)不敏感（由于20 mmol/L TEA 对A电流没有影响,其影响后的I-V 曲线与对照重叠,故图2未画出）。

图1　分离出的短暂性K⁺电流
Fig.1　Isolated A-current (I_A) by digital substraction

图2　4-氨基吡啶对短暂性K⁺电流的影响
Fig.2　Effect of 4-AP on A-current

　　2.2　谷氨酸对A电流(I_A)的影响
　　在15 min 内,对照组的I_A峰值变化率在（0±8.75）%（n=10）范围内波动,不同时间条件下I_A峰值变化率比较，无显著性差异。本研究用5种不同浓度(1、10、100、1000和10000 μmol/L)的L－谷氨酸对细胞进行灌流,分别在灌流后1、5、10和15 min时间点采样; 对照用不含谷氨酸的标准细胞外液对细胞灌流,在与药液作用相同的时间间隔采样。5种不同浓度的谷氨酸在不同灌流时间内对I_A电流的I-V 曲线影响（图3,以1000 μmol/L 谷氨酸的影响为例)。可见谷氨酸对I_A的抑制作用具有时间依赖性。

图3　1000 μmol/L谷氨酸在不同时间条件下对短暂性K⁺电流的I-V 曲线的影响
Fig.3　Effects of 1000 μmol/L glutamate on I-V curves of I_A at different times

　　当去极化到+20 mV时,谷氨酸灌流5 min时50%抑制浓度(IC₅₀)是1530.22 μmol/L；去极化到+40 mV时,50%抑制浓度(IC₅₀)是643.55 μmol/L。不同浓度的谷氨酸灌流15 min后I_A变化抑制见表1。

表1　不同浓度的谷氨酸灌流15 min后A电流抑制率
Table 1　Inhibition rate of different concentrations of glutamate on A-current at 15 min after perfusion (±s,%)

Concentration /μmol^.L^－1	Depolarizing to +20 mV	Depolarizing to +40 mV
Control　(n=10)	2.12±11.30	2.43±9.46
1 (n=8)	1.44±7.67	20.19±7.43
10 (n=8)	30.27±7.32^*	35.28±6.78^**
100 (n=8)	40.28±6.39^**	54.26±7.57^**#
1000 (n=6)	60.38±9.21^**	78.65±8.54^**#
10000 (n=6)	65.48±8.65^**	82.17±11.42^**#

^*P<0.05,^**P<0.01 compared with control group (t test);^#P<0.05 compared with depolarizing to +20 mV (paired t test).

　　由表1可看出谷氨酸对A电流的抑制作用具有浓度依赖性和电压依赖性,即在去极化电压值较低,抑制作用较弱,随去极化电压的升高,抑制作用加强；浓度越高,抑制作用也越强。

　　3　讨论

　　瞬时外向型钾电流(I_A)^［5］从超极化膜电位除极时激活,并以快速激活且快速失活为特点区别于其它类型钾电流,其另一特点是对4-AP(4-氨基吡啶)极为敏感,2 mmol 4-AP可绝大部分阻断之。本研究将膜电位箝制在－100 mV,从而诱发出一种快速激活且快速失活的外向电流（图1）,其激活电位、电压值,达到峰值时间(2～4 ms)。完全失活电位的－40 mV(n=20)的特性,激活时间失活时间特性,符合I_A特点,应用4-AP可部分阻断之,对TEA不敏感。考虑分离出的该电流为I_A。I_A是动作电位复极化早期外向电流的主要成分,主要调节静息膜兴奋性,减慢去极化速度,延缓动作电位产生,并可使重复放电神经细胞呈现缓慢放电节律,有报道I_A受神经递质的调节^［5］。
　　本研究发现谷氨酸对I_A抑制作用具有浓度依赖性、时间依赖性。在100 μmol/L以上浓度,去极化到+40 mV时I_A抑制百分率明显大于去极化到+20 mV抑制百分率。持续给予谷氨酸可引起海马CA₁区神经元膜电导呈电压依赖性降低,表明谷氨酸能影响电压门控的离子通道的功能,且此影响是可逆的,停止加药后,短暂性K⁺电流的I-V曲线可恢复到用药前水平。Halliwell等^［6］报道Dentrotoxin（从非洲毒蛇中提取的一种肽）对海马CA₁区锥体细胞的I_A有明显抑制作用,是由于这种肽的神经毒作用,所以我们推测谷氨酸对I_A的抑制作用与其神经毒性有关。谷氨酸能诱导培养神经元死亡,并且认为主要通过NMDA受体通道介导的Ca²⁺引起^［7］。Chen QX等^［8］报道急性分离的海马CA₁区神经元短暂暴露NMDA（100 μmol/L,10 min）后可诱导一个继发性阳离子激活的内向电流,此内向电流为Ca²⁺内流引起,能增加细胞内游离Ca²⁺,并且决定了神经元的死亡。由此可推断谷氨酸首先作用K⁺通道,然后继发地激活NMDA门控的Ca²⁺内流,进一步引起细胞死亡。
　　谷氨酸作为中枢神经系统内一种兴奋性神经递质,其过量可引起神经毒性作用,还可引起细胞内Ca²⁺积聚。钙离子超载在缺血神经元坏死或凋亡中起重要作用。本研究发现谷氨酸对电压依赖性K⁺电流有明显的抑制作用,可能与细胞内Ca²⁺增加有关系,这是由于谷氨酸引起神经元膜电导降低,导致膜去极化,使电压依赖性Ca²⁺通道开放,Ca²⁺内流。
　　总之,本研究结果表明短暂性外向K⁺电流被成功地分离,谷氨酸对I_A有抑制作用,且呈剂量依赖性、时间依赖性和部分电压依赖性; 对进一步了解谷氨酸在中枢神经系统中的生理作用和病理作用有指导意义。

*山东省自然科学青年基金资助 (No.Q95C0925)
*Supported by the Nature Science Youth Foundation of Shandong Province (No.Q95c0925)

作者单位：许长庆：广东省江门市中心医院神经内科,江门 529071；
　　　　　张宗明：北京医科大学附属第三医院外科,北京　100083
　　　　　夏作理：泰山医学院附属医院老年病科,泰安 271000
　　　　　吴才宏　周培爱：北京大学生物膜与膜生物工程国家开放实验室,北京　100871

参考文献

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［8］Chen QX,Perkins KL,Choi DW，et al.Secondary activation of a cation is responsible for NMDA toxity in acutely isolated hippocampal neurons.J Neurosci,1997,17 (11): 4032～4036．

1997-12-08收稿　　1998-02-23修回