促肾上腺皮质激素对慢痛大鼠脊髓
生长抑素、c-fos表达及痛反应的影响

武强　李希成　阮怀珍　黎海蒂

　　摘要　本研究应用免疫组化、原位杂交和痛级均数测定法,探讨鞘内注射促肾上腺皮质激素(ACTH)对甲醛引起大鼠脊髓内生长抑素(Som)、c-fos表达及痛反应的影响。结果表明,足底注射甲醛可使大鼠脊髓内c-fos样免疫反应(FLI)、Som样免疫反应(Som-LI)、FLI/Som-LI及前Som原mRNA (PPS-mRNA)神经元数目显著增多以及痛级均数(PIR)显著升高。而鞘内注射ACTH可显著抑制甲醛引起的大鼠脊髓内FLI、Som-LI、FLI/Som-LI及PPS-mRNA增多和PIR升高效应。鞘内预先注射赛庚啶可阻断ACTH的抑制效应,而荷包牡丹碱、纳洛酮则无影响。结果提示,5-羟色胺受体可能参与ACTH抑制甲醛引起的痛反应。
　　关键词: ACTH;生长抑素;原癌基因c-fos;脊髓;免疫组化； 原位杂交
　　学科分类号: R338.3

EFFECT OF ACTH ON THE EXPRESSION OF
SOMATOSTATIN AND c-fos IN THE SPINAL CORD AND
FORMALIN EVOKED PAIN RESPONSE

WU　QIANG，LI　XI-CHENG，RUAN　HUAI-ZHEN,LI　HAI-DI
(Department of Physiology,Third Military Medical University,Chongqing 400038)

　　ABSTRACT　In the present study,the effect of ACTH on the expression of somatostatin and c-fos in the spinal cord and formalin induced pain responses in rats were studied using immunohistochemistry and in situ hybridization.The results showed that subcutaneous injection of formalin in the right hindpaw increased c-fos-like immunoreactivity (FLI),somatostatin-like immunoreactivity (Som-LI),Som-LI/FLI and perprosomatostatin mRNA (PPS-mRNA) in neurones of right spinal dorsal horn and significantly enhanced pain intensity rating.ACTH decreased the FLI,Som-LI,Som-LI/FLI and PPS-mRNA levels of the spinal cord evoked by formalin.The decrease of c-fos or Som level due to intrathecal injection of ACTH in rats with chronic pain was prevented by injection of cyproheptadine,but not by bicuculline and naloxone.The results indicate that the serotonin receptor may be involved in ACTH induced analgesia.
　　Key words: ACTH;somatostatin;proto-oncogene c-fos;spinal cord;immunohistochemistry;in situ hybridization

　　ACTH在中枢神经系统作用广泛,并参与痛觉调制。据报道,ACTH不仅可通过脑内5-HT和GABA产生镇痛作用^［1,2］,脊髓表面滴注ACTH也有镇痛效应,并有量效关系^［3］。而脊髓内的生长抑素(somatostatin,Som) 作为第一级伤害性传入神经末梢释放的一种神经递质或神经调制物,已被众多学者所公认^［4,5］。本研究用c-fos为伤害性刺激的“标志物”^［6］,观察鞘内注射ACTH对甲醛引起的痛反应和脊髓Som神经元的影响,探讨ACTH在脊髓痛觉调制中的作用。

　　1　材料和方法

　　实验用Wistar大鼠60只，体重200～220 g,雌雄不拘。
　　1.1　药品和试剂　　ACTH,天津生物制品公司产品,溶于人工脑脊髓液(ACSF)内;c-fos抗血清(1∶2?000),Cambridge Research Biochemicals产品;Som抗血清(1∶5?000),Sigma产品。前Som原mRNA(perprosomatostatin mRNA,PPS-mRNA)原位杂交试剂盒由第三军医大学组织胚胎教研室提供。ABC试剂盒,Vector公司产品;赛庚啶(cyproheptadine),荷包牡丹碱 (bicuculline) 和纳洛酮 (naloxone) 皆为Sigma产品,均溶于ACSF内。
　　1.2　实验分组　　实验分7组: (1)正常对照组(10例),2例动物不给任何刺激,作为空白对照;4例右后足内注射150 μl生理盐水;4例鞘内注射ACSF 15 μl。(2)甲醛组(10例),大鼠右后足底注射5％甲醛液150 μl。(3)ACTH小剂量组(9例),鞘内注射ACTH(0.5 U/10 μl)的同时,足底皮下注射5％甲醛液150 μl。(4)ACTH大剂量组(9例),鞘内注射ACTH(1 U/10 μl)的同时,足底皮下注射5％甲醛液150 μl。(5)赛庚啶组(8例),鞘内预先注射赛庚啶(5 mg/ml,5 μl),5 min后再向鞘内注射 ACTH (1 U/10 μl)+F(Formalin)。(6) 荷包牡丹碱组(7例),鞘内预先注射荷包牡丹碱(1 mg/ml,5μl),5 min后再向鞘内注射ACTH(1 U/10 μl)+F。(7) 纳洛酮组(7例),鞘内预先注射纳洛酮(1 mg/ml,5 μl),5 min后再向鞘内注射ACTH(1 U/10 μl)+F。
　　1.3　鞘内注射　　动物麻醉后按文献［7］方法进行脊髓蛛网膜下腔插管。待动物清醒后观察确无肢体功能损害后继续饲养,5～7 d后,在脊髓蛛网膜下腔注射药物,药物容量15 μl,并用生理盐水冲洗管道,总容量20 μl,5 mim注射完毕。
　　1.4　甲醛足内注射行为法　　在大鼠右后足底皮下注射5%甲醛溶液150　μl,注药后将大鼠置于笼内观察其行为反应，按Dubuisson^［8］痛反应程度的四级记分法计算其痛级均数(pain intensity rating，PIR)，作为衡量痛反应的标准。PIR越大痛反应越明显。
　　1.5　前生长抑素原mRNA原位杂交法　　以地高辛标记的反意cRNA探针按文献^［9］叙述步骤进行原位杂交前、杂交和杂交后处理。抗地高辛抗体工作浓度为1∶1?000,以NBT/BCIP(每毫升400 μg/200 μg)反应液显色。对照实验包括用2 μg/mg RNA酶A预处理切片30 min和用不含探针杂交缓冲液杂交,结果均检测不到明显的杂交信号。
　　1.6　免疫组化法
　　1.6.1　c-fos,Som免疫组化法　　在鞘内或足底注射药物后2 h,按常规进行大鼠组织灌流、固定,取脊髓腰段进行冰冻切片(40 μm),然后进行 ABC免疫组化染色。阴性对照分别采用正常羊(或兔)血清和PBS (0.01 mol/L)代替一抗,随后的步骤完全相同,对照切片上观察不到免疫反应阳性细胞。
　　1.6.2　c-fos/Som免疫双重染色法　　将c-fos免疫组化切片染色后再置入兔抗Som血清孵育48 h(4℃),随后依次进入生物素结合羊抗兔血清(1∶200)和ABC(1∶100)中各孵育2～4 h(室温),最后用DAB-H₂O₂液呈色,Som免疫阳性产物为棕色。
　　1.7　数据处理　　在每一动物脊髓腰3～4节段随机抽样4片，经图像分析,作阳性细胞计数，取均数作为该动物的c-fos样免疫反应(FLI)数,Som样免疫反应(Som-LI)数和PPS-mRNA数。实验数据皆用电子计算机经双样本t检验程序(PDA-2)进行统计学处理。结果以均值±标准误()表示。

　　2　结果

　　2.1　甲醛引起的大鼠痛反应及对脊髓内c-fos、Som的影响
　　大鼠右后足底注射甲醛后,动物出现躁动不安、注射足抬起不着地、舔足或咬足等反应,与对照组结果比较,PIR显著升高(图1),2 h后免疫组化染色可见脊髓FLI神经元大量出现于右侧背角的浅表层,另外固有核、背角颈部、腹侧部都有许多散在的FLI神经元;与此同时,脊髓Som-LI、PPS-mRNA阳性标记细胞及FLI/Som-LI双染神经元也明显增多,与对照组比较差异显著(P<0.01,图2见图版Ⅲ,表1)。

图1　鞘内注射ACTH对甲醛引起痛反应的影响
Fig.1　Effect of intrathecally injection of ACTH on the pain response induced by formalin

表1　鞘内注射ACTH对慢痛大鼠脊髓FLI、Som-LI、FLI/Som-LI和PPS-mRNA的影响
Table 1　Effects of intrathecal injection of ACTH on the FLI,Som-LI,FLI/Som-LI and PPS-mRNA neurons in the spinal cord of the rat receiving formalin injection

Groups	n	FLI	Som-LI	FLI/Som-LI	PPS-mRNA
Control	10	0	103±8.7	0	42±5.8
Formalin (F)	10	151.0±10.2^**	327±20.2^**	45.0±3.7^**	135±9.8^**
ACTH (0.5 U/10 μl)+F	9	38.0±4.9^++	205±9.6^++	12.0±3.1^++	85±7.8^++
ACTH (1 U/10 μl)+F	9	17.0±2.4^++	151±6.3^++	6.0±2.4^++	63±7.6^++
Cyproheptadine+	8	138.0±92^##	298±19.7^##	37.0±7.6^##	108±7.8^##
ACTH (1 U/10 μl)+F
Bicuculline+	7	16.2±3.1	153±5.4	6.3±2.5	63±4.7
ACTH (1 U/10 μl)+F
Naloxone+	7	17.0±1.9	154±4.9	5.8±1.9	62±5.2
ACTH (1 U/10 μl)+F

^**P<0.01,compared with control group;⁺⁺P<0.01,compared with formalin group;^##P<0.01,compared with ACTH+formalin group.

　　2.2　鞘内注射ACTH对甲醛引起大鼠痛反应和脊髓内c-fos、Som的影响
　　鞘内注射ACTH(0.5 U/10 μl和1 U/10 μl)的同时,再注射甲醛2 h后,可见PIR降低(图1),脊髓背角FLI神经元、Som-LI、FLI/Som-LI、PPS-mRNA阳性标记细胞数均较甲醛组减少 (P<0.01,图2见图版Ⅲ，表1)。而鞘内预先分别注射赛庚啶(5-HT能受体拮抗剂)、荷包牡丹碱(GABA能受体拮抗剂)和纳洛酮(阿片受体拮抗剂),5 min后再向鞘内注射ACTH(1 U/10 μl),同时注射甲醛,将其结果与ACTH(1 U/10 μl)+甲醛组比较,可见只有赛庚啶组大鼠脊髓内FLI,Som-LI,FLI /Som-LI及Som mRAN 有不同程度的增加(P<0.01,图2见图版Ⅲ,表1)。

　　3　讨论

　　本实验观察到鞘内注射ACTH 可抑制甲醛引起的痛反应、腰段脊髓背角c-fos、Som-LI和PPS mRAN阳性神经元的增多,提示ACTH在脊髓水平参与痛觉调制,抑制了伤害性刺激的传入,而这种抑制作用与5-HT受体有关。
　　据报道,Som是第一级伤害性传入神经末梢释放的一种神经递质或神经调制物^［4,5］,如伤害性热刺激和化学刺激可使兔脊髓背角的Som释放增多^［10］。而本文在大鼠右后足底皮下注射甲醛来引起持续的紧张性伤害刺激,发现痛级均数显著升高,作为中枢神经系统内伤害性刺激“标志物”^［6］的c-fos在脊髓背角的表达增多,以及Som-LI和PPS-mRNA阳性细胞均显著增加,这与文献报道一致^{［7,11,12］},表明Som与痛觉传递有关,伤害性刺激可使Som合成加速。
　　ACTH在中枢神经系统参与痛觉调制,不仅通过脑内5-HT和GABA产生镇痛作用^［1,2］,脊髓表面滴注ACTH也有镇痛效应,并有量效关系^［3］。本实验在鞘内注射ACTH后,观察到能显著地抑制甲醛引起的脊髓c-fos表达,Som-LI和PPS-mRNA神经元的增多,这在脊髓水平抑制了伤害性刺激的传入,使痛反应减小。
　　有资料指出,腹腔注射ACTH产生镇痛作用时,海马、下丘脑内5-HT含量增加^［1］,说明ACTH在脑内可通过5-HT产生镇痛作用。为进一步了解ACTH在脊髓水平通过何种途径产生镇痛作用,我们在实验中观察了几种受体拮抗剂的作用,发现赛庚啶能大部分翻转鞘内注射ACTH的作用,提示ACTH在脊髓水平可能也是通过5-HT能途径产生镇痛作用的。

作者单位：第三军医大学生理教研室,重庆 400038

图2　脊髓免疫组化,原位杂交染色显微照相
Fig.2　Photomicrograph of immunohistochemistry and in situ hybridization of the rat spinal cord (right spinal dorsal horn of L3～4 segment)
A.After injection of isotonic saline in the hindpaw,some Som-LI were distributed in the spinal dorsal horn (×75).B.After formalin was injected in the hindpaw,the Som-LI were densedly distributed in spinal dorsal horn (×75).C.I.t.of ACTH after sc formalin,the Som-LI of dorsal horn decreased (×75).D.The Som-LI of dorsal horn increased 5 min after i.t.cyproheptadine,ACTH and sc formalin (×75).E.Some PPS-mRNA were distributed in spinal dorsal horn after injection of isotonic saline in the hindpaw (×75).F.Formalin injection in the hindpaw led to PPS-mRNA increase in spinal dorsal horn (×75).G.The PPS-mRNA of dorsal horn decreased following i.t.of ACTH after sc formalin (×75).H.Double immunohistochemical staining of c-fos and Som,formalin injected in the hindpaw,FLI/Som-LI was increased in spinal dorsal horn (×300).

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1997-09-15收稿　1998-03-12修回