视皮层LTP维持阶段的
突触形态计量学研究^*

陈玉翠　韩太真　沈建新　乔健天

　　摘要　本实验使用18～20 d的幼年大鼠视皮层脑片标本,在LTP出现后3 h取局部微脑片固定进行LTP维持阶段超微结构的研究。分别与孵育相同时间而未予任何刺激的脑片和仅给予测试刺激的脑片作比较。运用图像分析仪分别对三组电镜结果进行以下参数的测量: (1)突触间隙的宽度;(2)突触后致密物(PSD)的厚度;(3)活性区的长度;和(4)突触界面曲率。用双盲法对突触数目进行计量,并用立体计量学方法对各种突触类型进行定量,所得数据用方差分析进行统计学处理。结果显示: (1)LTP形成后1.5 h左右,其反应达到峰值,然后维持在最高水平一直到3 h仍无下降趋势;(2)突触间隙的宽度较两个对照组明显增宽;(3)PSD的厚度也明显增厚;(4)活性区的面密度及突触界面曲率明显增加;(5)总突触数目和棘突触数目的数密度较空白对照明显增高;(6)穿孔性突触的数密度与对照组相比明显增加。结果提示: 活性区面密度的增加及突触界面曲率的增大可能是LTP维持的形态学基础。穿孔性突触的形成与LTP的维持密切相关。
　　关键词: LTP;视皮层脑片;突触间隙;突触后致密物质;突触界面曲率;棘突触;穿孔性突触
　　学科分类号: Q427

A QUANTITATIVE STUDY ON THE SYNAPTIC
ULTRASTRUCTURAL ALTERATIONS IN VISUAL
CORTEX IN THE MAINTENANCE OF LTP^*

CHEN　YU-CUI^**，HAN　TAI-ZHEN，SHEN　JIAN-XIN,QIAO　JIAN-TIAN^***
Department of Physiology,Medical College,Shantou University,Shantou,515031;
^**Present address: Department of Psychology,Peking University,Beijing 100871
^***Department of Physiology,Shanxi Medical University,Taiyuan,030001

　　ABSTRACT　The ultrastructure of synapses three hours after formation of long-term potentiation (LTP) was examined in the local microslices of visual cortical brain slices of 18～20 d rats.Slices without potentiating stimulation which were similarly incubated served as controls.The following structural changes were examined using a graph analyzer: (1)synaptic cleft width;(2)thickness of the postsynaptic densities(PSD);(3)length of the active zones;and(4)curvature of the synaptic interface.The number of synapses of different types in layerⅡ/Ⅲ　of visual cortex was quantified by double-blind scoring procedures.The various counts were converted to the number of synapses per unit volume using stereological quantitation method.Analysis of variance was used for statistical evaluation.Our results suggest that field potentials reached their peak values at about one and a half hours after tetanus and could be maintained as long as three hours without decay.In comparison with the control groups,synaptic cleft width,thickness of PSD,surface density per unit volume(Sv) of the active zones,curvature of the synaptic interface,numeric density per unit volume (Nv) of all synapses,spine synapses and the Nv of perforated synapses were all increased significantly.These data suggest that the increase of Sv of active zones and the increase of the curvature of synaptic interface may be the morphological feature characterizing the maintenance of LTP,in addition to the formation of perforated synapses.
　　Key words: long-term potentiation (LTP);visual cortical brain slice;synaptic cleft;postsynaptic densities(PSD);the curvature of the synaptic interface;spine synapse;perforated synapse

　　长时程增强(long-term potentiation,LTP)现象是指条件刺激后突触传递功效出现长时间的明显增强。表现在同样的测试刺激所引起的兴奋性突触后电位(或电流、复合突触电位等)明显增大^［1］。20余年的研究表明,LTP是研究学习与记忆细胞机制的良好模型,是迄今为止已知反映信息贮存的最客观的电生理指标。由于LTP的发现及NMDA受体特征的揭示,使学习与记忆机制的研究成为自80年代以来神经科学中最富成果的研究领域。其中关于LTP形成机制的探讨是到目前为止在LTP研究中最受关注的课题。任一功能性改变必然有其物质及形态学基础。因此有人设想^［2］,如此长时间的突触效应的增强必然伴随着中枢神经系统结构的变化。关于LTP与突触结构可塑性的相关性研究开始于1976年Fifkova^［3］的工作,总结20多年的研究可以看出^［4］,在海马结构关于LTP相关的形态学研究已经积累了大量资料,伴随着LTP的形成和维持有突触形态及数目的改变。但资料之间差异和矛盾之处甚多,目前尚未找出其内在的联系和规律。80年代初期,对LTP的研究已经扩展到脑内其它部位如新皮层、脑干核团、内侧膝状体、小脑等^［5］。而在这些脑区LTP相关的形态学研究尚未见系统报道。本研究室1995年首次报道了视皮层LTP形成后的超微结构特征^［6］。结果显示,视皮层脑片标本在LTP形成后1 h,在产生LTP的脑片局部发现有U型突触。本文使用视皮层脑片标本,在常规LTP实验后进行电镜观察,并结合图像分析及立体计量学方法,观察了幼年大鼠视皮层LTP形成后3 h(维持期)突触结构多个参数的变化,探讨了与LTP维持相关的最主要的形态学特征。

　　1　材料和方法

　　实验采用18～20 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不拘,随机选取体重约30～50g的动物进行实验。
　　1.1　电生理方法　　根据Zilles图谱^［7］所示,从枕极开始向前做冠状切片,切取含有视皮层区的500 μm脑片3～4片。实验用静置式界面浴槽,浴槽上置有尼龙网。脑片通过尼龙网与槽内人工脑脊液接触。浴槽温度控制在33±0.5℃,恒量流速的95% O₂和5%　CO₂混合气弥散于脑片周围。脑片一般孵育1.5 h。通过手术显微镜观察脑片,按Zilles图谱显示,在初级视皮层OC₁部位的Ⅱ/Ⅲ层安放记录场电位的玻璃微电极。刺激电极为直径75 μm的同心针电极,放置在视皮层白质与灰质交界处。刺激器输出的脉冲(波宽200 μs,强度2～10 V)经隔离器输送到刺激电极,引起的场电位(FP)由记录电极输入MEZ-8301微电极放大器,输出信号再进入VC-11记忆示波器供观察和拍照。同时也进入前置放大器,经放大后输入计算机,使用NEPAS-Ⅱ型软件对信号进行采集和分析。进行常规LTP记录。如有LTP出现,继续观察3 h。
　　1.2　形态学方法　　选取经过电生理记录后的脑片标本,分为3组: （1）仅孵育与实验组相同时间而未给予任何刺激的空白对照组(5例);(2)仅给予测试刺激的实验对照组(5例);(3)LTP形成后3 h组即实验组(5例)。电生理实验结束后,立即标记出记录电极周围直径1 mm的脑片区域,并将脑片迅速从网上移入2.5%戊二醛中进行前固定,2 h后切取记录电极周围脑片,进行常规透射电镜标本的制作。在每个铜网中随机选取切片用H-300电子显微镜拍摄突触图像。
　　1.3　参数测量　　用改进的QUANTIMENT-520图像分析仪测量突触间隙的宽度、突触后致密物(PSD)的厚度、突触后膜的弦长和弧长及突触活性区的长度。其中活性区长度与突触后膜致密物质(PSD)厚度参考Gldner^［8］方法测量。突触界面曲率的测量参照Jones等^［9］的方法。突触间隙宽度用多点平均法测定。
　　1.4　形态计量学分析　　用立体计量学方法定量分析突触的数密度(Nv)、面密度 (Sv)。选用的参照系均为单位体积(面积)的组织。所用公式^［10］如下:
　　Nv=8ENa／π² (Na为单位面积中的突触数目,E为PSD长度倒数的平均值);
　　Na=∑Nx／∑Ar (Nx为每张1万倍的照片上的突触数目,Ar为每张照片的面积);
　　Sv=4Bx/(Ar×π) (Bx为突触活性区的长度)。
　　1.5　统计学分析　　用方差分析对各组间各参数分别进行统计学处理,显著性指标P≤0.05。若各组间有显著性差异,再进一步做两两比较的q检验。统计分析由SAS软件包进行处理。

　　2　结果

　　2.1　LTP维持期场电位的变化
　　实验观察了视皮层LTP形成后3 h内的场电位变化情况。用强直刺激前后诱发电位第五波(又称N₁波)幅值的变化来判定LTP形成与否,以N₁波在条件刺激后幅值增大50%以上持续时间超过30 min判定为LTP形成。在实验组,LTP形成后约80～90 min左右达峰值,最大可达9.6倍,平均4.64倍,在LTP形成后观察3 h LTP幅值无下降趋势(图1)。

图1　LTP维持过程中场电位幅值的变化
Fig.1 Graph showing the development
of FP′s during the maintenance
of LTP The amplitude before stimulation is 1.n=13.

　　2.2　LTP形成前后局部神经毡超微结构的特点
　　视皮层Ⅱ/Ⅲ层神经毡内主要由轴突末梢、树突和神经胶质细胞的突起组成。轴突以含线粒体、突触小泡等作为辨认标志。树突在切片上可见纵切、横切和斜切的各种断面,其粗细长短各不相同。树突内平行排列的微管,可作为与轴突鉴别的依据。胶质细胞的突起透亮,仅含散在的致密物质,细胞器很少。轴突与树突和树突棘之间均主要形成Ⅰ型非对称性突触。LTP形成后可以看到有典型的凹型突触和穿孔性突触。在放大3万倍的照片上可以看到突触后成分中的棘器(图2A,B)。

　

图2　电镜照片示LTP形成后3 h突触形态变化
Fig.2　Electro-micrographic changes of synaptic profiles observed after three hours of the induction of LTP (×30000)
a.Arrow indicates spine apparatus in negative synapse.b.Arrow indicates perforated synapse．

　　2.3　LTP形成后突触结构参数的改变
　　各个测量参数在两个对照组间均无差别。LTP形成后3 h,与两个对照组相比突触间隙明显增宽;PSD明显增厚;活性区的面密度和突触界面曲率也明显增加(表1)。

表1　各组间突触结构参数的比较
Table 1　Comparisons of synaptic parameters in different groups

	Blank control group (n=50)	Experimental control group (n=50)	Experimental group (n=50)
Cleft width /μm	0.0186±0.004	0.0175±0.004^*	0.0210±0.005^+
Thickness of the PSD /μm	0.0328±0.010	0.0315±0.009^*	0.0400±0.013^+
Synaptic curvature	1.1656±0.222	1.1493±0.212^*	1.2955±0.302^+
Sv of the AZ/μm^2.μm^－3	0.0557±0.021	0.0515±0.020^*	0.0713±0.025^+

±s;n is the number of photographs used in experiment;^*P>0.05 vs blank control;⁺P<0.01 vs experimental control group;AZ: active zones.

　　2.4　LTP形成后各型突触比例的改变
　　突触界面曲率按其形状分为平直型、弯曲型和不规则型3类。在弯曲型突触中,又有正向弯曲(或称哭型突触、凸型突触)和负向弯曲(或称笑型突触、凹型突触、杯型突触和U型突触)。在弯曲型突触中,各型突触的比例发生明显的改变(表2)。正向弯曲型突触的比例在LTP形成后呈下降趋势,而负向弯曲型突触的比例明显增加。平直型和不规则型突触比例无明显变化。

表2　LTP维持过程中各型突触百分比的变化
Table 2　Changes of different type of synapses
during the maintenance of LTP

	Blank control group (n=50)	Experimental control group (n=50)	Experimental group (n=50)
Positive synapse	66%	64%	30%^*
Negative synapse	20%	21%	57%^*
Other synapse	14%	15%	13%

n is the number of photographs used in experiment;^*P<0.05 vs control.

　　2.5　LTP形成后突触数目的改变
　　所测各类突触的数密度在两个对照组间的差异无统计学意义。LTP形成后3 h,总突触和棘突触数目尤其是凹形棘突触的数密度较对照组明显增高;穿孔性突触的数密度与对照组相比也明显增加(表3)。

表3　各组间不同类型突触数密度的比较
Table 3　Comparisons of the numerical density per unit volume(Nv)of synapses of different types in different groups (N/μm³)

	Blank control group (n=50)	Experimental control group (n=50)	Experimental group (n=50)
All synapse	0.5018±0.1657	0.5483±0.1766^*	0.6421±0.1519^+
Spine synapse	0.4516±0.1679	0.4398±0.1457^*	0.5926±0.1508^+
Negative spine synapse	0.0505±0.0284	0.0437±0.0111^*	0.0888±0.0393^+
Perforated synapse	0.0196±0.0228	0.0206±0.0172^*	0.0470±0.0287^+

±s;n is the number of photographs used in experiment;N is the number of synapses;^*P>0.05 vs blank control;⁺P<0.01 vs experimental control.

　　3　讨论

　　突触界面曲率的变化可能是突触可塑性的一个形态学特征。有人^［12］推测突触界面曲率的差异代表着突触功能类型的不同,并有可能作为神经递质释放状况的标志,甚至还可能成为突触后膜上受体蛋白分子构像变化状态的标志。本研究发现,视皮层LTP形成后突触界面曲率和凹型突触的比例逐渐增加。Desmond^［10］等报道在海马结构,凹型突触比例随LTP的形成而增加,Markus等^［13］用红藻氨酸(kainic acid)后海马的突触出现LTP样反应时,也发现凹型突触所占比例增加,均与本实验结果一致。突触界面弯曲是扩大接触面的一种方式,弯曲的突触界面呈“袋状”,能减少其释放的递质向周围间隙的扩散,提高神经信息传递的有效性。弯曲型突触比平直型突触内有更多的线粒体,也即弯曲型突触处于更活跃的状态^［14］。
　　突触后致密物(postsynaptic density,PSD)也是中枢突触结构可塑性的重要参数。本研究显示,视皮层LTP形成后PSD明显增厚,活性区面密度增加。已有许多研究表明环境刺激^［15］、行为训练^［16］和药物等因素均可以引起脑内不同区域突触PSD的变化。LTP与学习记忆关系十分密切,有关学习记忆行为学研究结果^［17］表明,学习的训练和记忆的保持能力均与其海马内PSD厚度有关。Petukhov^［18］等也发现海马LTP产生后,PSD随之增厚,均支持本实验结果。生化分析证明PSD含有多种蛋白质和酶,在酶作用下蛋白质分子构像的可逆性转变能引起其亚微结构的变化(厚度增大或减小),PSD形态变化可能与突触后膜上受体及离子通道的变化密切相关^［8］,PSD增厚和增长可能是突触功效增强的物质基础。
　　视皮层LTP形成后穿孔性突触的数密度增加。中枢神经系统穿孔性突触(perforated synapse)随环境因素、视觉训练而增加,随年龄增大和记忆减退而减少。Geinisman^［19］等也对穿孔性突触与功能的关系做了大量的研究,认为节段形PSD可能参与形成了一种高效能的突触连接。他们^［20］用成年大鼠齿状回对LTP形成后突触的改变做了定量分析。结果发现,具有多个完全分隔传递区的穿孔性突触数目选择性增加,并且这种改变一直持续到老年。突触穿孔现象可能是突触分裂的中间步骤,而且突触穿孔后PSD变为节段性,出现多个活性区,使得不同受体簇的不同活性区传递功能大大加强,进一步增强了突触传递功效。因此突触穿孔可能是视皮层LTP维持过程中突触数目增高及活性区增多的原因,从而是视皮层LTP维持阶段的形态学主要特征。

^*广东省自然科学基金资助课题 (No.960775)
^*The project is supported by Guangdong Provincial Nature Science Foundation (No.960775).

作者单位：韩太真　沈建新：汕头大学医学院生理教研室,汕头 515031；
　　　　　乔健天：山西医科大学生理教研室,太原 030001
　　　　　陈玉翠：现在地址: 北京大学心理学系,北京 100871

参考文献

［1］Bliss TVP,Lomo T.Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.J Physiol　(Lond),1973,232: 331～356.
［2］Lynch G,Muller D,Seubert P.Long-term potentiation: Persisting problems and recent results.Brain Res Bull,1988,21: 363～372.
［3］Fifkova E,Van Harreveld A.Long-lasting morphological changes in dendritic spines of dentate granular cells following stimulation of the entorhinal area.J Neurocytol,1977,6: 211～230.
［4］Chen YC　(陈玉翠),Han TZ　(韩太真).Long-term potentiation associated synaptic morphological plasticity.Acta Psychol SIN　(心理学报),1997,29 (Suppl): 10～14 (in Chinese with English abstract).
［5］Han TZ (韩太真).The research of long-term potentiation.Prog Physiol Sci　(生理科学进展),1990,21: 76～78 (in Chinese).
［6］Han TZ (韩太真),Cai ZW (蔡志伟),Chen CY (陈彩云).The mophorlogical characteristic of synapses in visual cortex following LTP induction.Chin J Neurosci　(中国神经科学杂志),1995,2: 150～154 (in Chinese with English abstract).
［7］Zilles K.The Cortex of the Rat: A Stereotaxic Atlas. Berlin: Springer-Verlag,1985.
［8］Gldner FH,et al.Increase in postsynaptic density material in optic target neuron of the rat supyachiasmatic necleus after bilateral enucleation.Neurosci Lett,1980,17: 27～32.
［9］Jones DG， et al.An ultrastructrural study into the effect of pentobarbition on synaptic organization.Brain Res,1978,147: 47～63.
［10］Desmond NL,Levy WB.Change in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dentate gyrus.J Comp Neurol,1986,253: 466～475.
［11］Wu FM　(吴馥梅),Du HY　(杜红燕),Zhang ZG　(章子贵).The curvature of synaptic interface and it′s physiological importance.Chin J Neuroanat　(神经解剖学杂志),1994,1: 89～92　(in Chinese with English abstract).
［12］Markus EJ,Petit TL.Synaptic structural plasticity:Role of synaptic shape.Synapse,1989,3: 1～11.
［13］Petit TL,Markus EJ.The cellular basis of learning and memory: The anatomical sequel to neuronal use.In:Milgram NW， Macleod CM,Petit TL eds.Neuroplasticity,Learning and Memory,New York: Alan R.Liss,1987,87～124.
［14］Dyson SE,Jones DG.Quantitation of terminal parameters and their inter-relationships in maturing central synapses: A perspective for experimental studies.Brain Res,1980,183: 43～59.
［15］Gldner FH.Plasticity in synaptic apposition of optic nerve afferents under different lighting condition.Neurosci Lett,1979,14: 235～240.
［16］Vrensen G.Change in size and shape of synaptic connections after visual training: An ultrastructural approach of synaptic plasticity.Brain Res,1981,218: 79～97.
［17］Zhang ZG　(章子贵)，Du HY　(杜红燕),Lu HX　(陆汉新).Correlation between learning-memory and the cerebral synaptic structural parameters in mice.Acta Pychol Sin　(心理学报),1995,3: 317～321 (in Chinese with English abstract).
［18］Petukhov VV,Popov VI.Quantitative analysis of ultrastructural changes of the rat hippocampal field CA₃ in vitro in different functional states.Neuroscience,1986,18: 823～835.
［19］Geinisman Y,Morrell LT.Loss of perforated synapse in the dentate gyrus:morphological substrate of memory deficit in aged rats.Proc Natl Acad Sci,1986,83: 3027～3031.
［20］Geinisman Y,Morrell LT.Structural synaptic plasticity associated with the induction of long-term potentiation is preserved in the dentate gyrus of aged rats.Hippocampus,1992,2( 4): 445～456.

1997-12-15收稿　　1998-03-09修回