内源性一氧化氮在内毒素引起的
肺动脉高压和肺损伤中的作用

万梅　凌亦凌　谷振勇　张君岚　黄善生

　　摘要　本实验观察了家兔静脉内注入内毒素的主要成分脂多糖(LPS)后平均动脉血压(MAP)、肺动脉压(PAP)及入、出肺血NO含量的变化,并观察了静脉内预注入NO生成抑制剂N^ω-硝基-L-精氨酸(L-NNA)及诱生型NO生成抑制剂氨基胍(AG)后PAP和肺损伤的变化。结果观察到:家兔LPS注入后,MAP均明显下降,LPS注入后0.5、1、1.5、2h PAP明显增高(P<0.05)。LPS注入后PAP的高峰期(1h)入肺血NO含量明显降低,出肺血NO无明显变化。与对照组相比,LPS注入后3h出肺血NO含量和5h入、出肺血NO含量均明显增多。相关分析表明,兔LPS注入前和LPS注入后1h PAP与入肺血NO含量呈明显的负相关,而LPS注入后 3h和5h两者相关不明显。静脉预注入L-NNA后,LPS处理组的动物PAP明显增高,入、出肺血丙二醛(MDA)含量也明显增高,动物生存率明显降低。肺组织光镜下可见肺萎陷和小血管淤血加重,白细胞明显增加。静脉预注入AG后,LPS处理组的动物MAP在3～5h明显增高,此时PAP无明显改变,但5h时血中MDA含量明显减低,5h时与LPS组相比肺萎陷和小血管淤血减轻,白细胞也明显减少。以上结果提示,内毒素入血后较早期阶段可出现PAP的升高,此时入肺血NO的减少是参与肺动脉压增高(PAH)的机制之一。家兔内毒素进入血后较早期阶段NO对减轻内毒素引起的PAH和肺损伤起重要作用,而较晚的时期当诱生型NO合酶(iNOS)诱生后释放的NO则参与内毒素引起的肺组织炎症反应和肺损伤。
　　关键词: 内毒素;肺动脉高压;肺损伤;一氧化氮;兔
　　学科分类号: R543.2

EFFECTS OF ENDOGENOUS NITRIC OXIDE ON
PULMONARY ARTERYhYPERTENSION AND
LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN

WAN　MEI,LING　YI-LING，GU　ZHEN-YOUNG，
ZHANG　JUN-LUAN,HUANG　SHAN-SHENG
(Department of Pathophysiology,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017)

　　ABSTRACT　Changes in mean artery pressure(MAP),pulmonary artery pressure(PAP) and nitric oxide(NO) contents in inflow and outflow pulmonary blood(IPB,OPB) were observed after endotoxin lipopolysacchride (LPS) was injected iv in rabbits.Changes of PAP and lung injury were also observed after inhibitor of NO synthesis L-NNA or inhibitor of inducible NO synthesis AG was pre-injected by vein.The results showed that MAP decreased significantly after LPS administration,and 0.5～2h later PAP showed some increase(P<0.05) being maximum at PAP (1h) during which the content of NO in IPB was detectably decreased but NO in OPB did not.NO contents in OPB at 3h and in IPB and OPB at 5h increased significantly following LPS administration as compared with control.PAP correlated negatively with NO in IPB at the time before and 1h after LPS injection,which did not exist at 3 and 5h after LPS injection.After L-NNA pretreatment,when PAP elevated significantly,the MDA content in IPB and OPB also showed significant increase,while animal survival rate fell significantly.Light microscopic examination showed severe alveolar atelectasis,significant congestion and sequestration of leukocytes in lung tissue.When pretreated with AG,MAP elevated significantly in 3～5h,PAP remained unchanged.The MDA content in blood was lower at 5h in the LPS injected group with less pathological changes in lung tissue at 5h compared with the LPS group.The above results suggested that there was pulmonaryhypertension in the early stage after endotoxin administration.The decrease of NO content in IPB may be one of the mechanisms underlying pulmonary arteryhypertension(PAH).NO seemed to alleviate PAH and lung injury at the early stage after endotoxin administration.When iNOS was induced at the later stage,NO contributed to lung injury caused by endotoxin.
　　Key words: endotoxin;pulmonary arteryhypertension;lung injury;nitric oxide;rabbits

　　实验和临床研究发现,内毒素极易造成肺损伤,肺动脉压增高(pulmonary arteryhypertension,PAH）是内毒素造成肺损伤的早期表现之一^［1］。而在实验性内毒素血症或临床脓毒症病人常出现顽固性低血压。目前认为内毒素及细胞因子诱导机体组织生成的大量一氧化氮(nitric oxide,NO)是导致血压降低的主要原因^［2］。近年来研究表明,NO可参与各种条件下肺功能的调节和多种肺疾病的发生,而肺脏在疾病时肺内NO的生成及其代谢也会发生改变^［3］。内毒素致PAH的过程中肺内NO生成、代谢的改变目前研究极少。应用入、出肺血NO含量的改变来研究NO在肺内生成和代谢情况的研究尚未见报道。内毒素入血后不同时期内源性NO,尤其是原生型NO合酶(cNOS)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)所生成的NO分别在PAH和肺损伤中所起的作用报道较少。
　　实验拟从内毒素引起的PAH入手,观察静脉注入内毒素的主要成分脂多糖(lipopolysacchride,LPS)后平均动脉压力(mean artery pressure,MAP)、肺动脉压(pulmonary artery pressure,PAP)及入肺血(inflow pulmonary blood,IPB)和出肺血(outflow pulmonary blood,OPB)NO含量的变化;并观察静脉内预注入NO生成抑制剂N^ω-硝基-L-精氨酸(N^ω-nitro-L-arginine,L-NNA)及诱生型NO生成抑制剂氨基胍(aminoguanidine,AG)后PAP和肺损伤的变化,从而为内毒素休克时肺损伤的机理研究和临床防治提供启示。

　　1　材料与方法

　　1.1　兔LPS注入模型制备　　健康雄性纯种新西兰家兔41只,耳缘静脉注入乌拉坦1 g/kg bw,行全身麻醉。耳缘静脉注入E.coli LPS 8 mg／kg bw。实验分为对照组(n=10),LPS组(n=13),L-NNA+LPS组(n=9)和AG+LPS组(n=9)。对照组注入等容量生理盐水(normal saline,NS),L-NNA+LPS和AG+LPS组,分别在LPS注入前15 min注入L-NNA 10 mg/kg bw和AG 10 mg/kg bw,每隔0.5h记录一次MAP和PAP,直至LPS注入后5h。
　　分别于LPS注入前,LPS注入后1、3和5h取 IPB和OPB(如动物于1、3或5h内死亡,则于动脉血压降至3.99 kPa时取),以测定NO,MDA含量以及动物5h存活率,另取动物(每组n=3)分别于LPS后1、3、5h放血处死,取左下肺叶组织观察肺组织病理改变。
　　1.2　兔MAP和PAP的记录　　分离右颈动脉和左颈静脉,耳缘静脉注入肝素1250U／kg bw抗凝。右颈动脉插管至主动脉弓处记录MAP。用自制的肺动脉导管自左颈静脉插至肺动脉入口处,用多道生理记录仪(日本光电)同步记录MAP和PAP。根据插入的长度、记录的波形和压力可准确判定导管尖端所在的位置。自静脉、动脉导管采血分别代表IPB和OPB。
　　1.3　血浆NO^－₂和NO^－₃含量测定　　用Green等人的方法^［4］,结果以μmol／ml表示。
　　1.4　血浆丙二醛(MDA)含量测定　　用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定^［5］。结果以nmol/ml表示。
　　1.5　肺组织切片的制备　　取左下肺叶组织固定于10%福尔马林液中,常规石蜡包埋、切片,HE染色后光镜观察。
　　1.6　试剂　　LPS E.coli 0111:B4,L-NNA及AG均为Sigma公司产品,1,1,3,3-四乙氧丙烷为Fluka公司产品,TBA为上海试剂厂产品,硝酸盐测定试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。
　　1.7　统计学处理　　数据用均数±标准差（±s）表示。给药前后行配对t检验,组间行多样本F检验及两两比较的q检验,各组生存率的比较行χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　兔LPS注入后MAP和PAP的变化及L-NNA、AG的作用
　　对照组MAP和PAP无明显改变。LPS组在LPS注入后0.5～5h MAP均明显低于LPS注入前和对照组同时间点,MAP呈逐渐下降的趋势,PAP在LPS注入后0.5h(3.71±1.36) kPa,1h(3.77±1.05) kPa和2h(3.36±0.68) kPa明显高于LPS注入前和对照组同时间点(P<0.05),3h和4h仍高于LPS注入前(P<0.05),5h与LPS注入前相比无差异。
　　L-NNA+LPS组和AG+LPS组在LPS注入前MAP(12.31±0.41) kPa,(12.05±0.43) kPa与PAP(2.96±0.13) kPa,(2.71±0.10) kPa和LPS组［(MAP: 12.26±0.42) kPa,PAP: (2.88±0.15) kPa］相比无显著性差异。L-NNA+LPS组在LPS注入后0.5h和1h MAP均比LPS组同时间点明显减低;而PAP［0.5h: (5.35±0.52) kPa,1h: (4.57±1.10) kPa］比LPS组同时间点［0.5h: (3.71±1.36) kPa,1h: (3.77±1.05) kPa］明显增高,由于该组动物均在2h前死亡,故图中1.5h后的情况未作统计。AG+LPS组在LPS加入后3、4、5h MAP均比LPS组同时间点明显增高,而PAP则无明显改变(图1)。

图1　L-NNA和AG对家兔LPS注入后MAP和PAP的影响
　　Fig.1　Effects of L-NNA and AG on MAP and PAP after LPS administration
^*P<0.05,^**P<0.01 vs control;^#P<0.05 vs LPS.

　　2.2　兔LPS注入后PAH过程中入、出肺血NO含量的变化及与PAP的关系
　　LPS注入前OPB NO^－₂和NO^－₃含量明显低于IPB(P<0.05),IPB和OPB在LPS注入后1、3、5h NO^－₂和NO^－₃无明显差异;1h OPB NO^－₂和NO^－₃含量与LPS注入前比无差异,IPB NO^－₂和NO^－₃明显减少(P<0.05)；3h OPB NO^－₂和NO^－₃与LPS注入前比明显增高(P<0.01),而IPB无明显改变；5h IPB、OPB NO^－₂和NO^－₃均明显高于LPS注入前(表1)。

表1　家兔LPS注入后入、出肺血NO^－₂和NO^－₃含量的改变
Table 1　Changes of NO^－₂ and NO^－₃ content in OPB,IPB after LPS administration in rabbits

	Pre-LPS		1h Post-LPS		3h Post-LPS		5h Post-LPS
	IPB	OPB	IPB	OPB	IPB	OPB	IPB	OPB
NO^－2／NO^－3 (μmol／L)	39.82± 6.91	34.81± 7.68^#	30.64± 13.04^*	37.81± 13.18	46.80± 17.76	56.14± 22.80^*	80.15± 33.04^**	74.48± 31.82^**

n=10.±s.^#P<0.05,vs IPB of same time.^*P<0.05,^**P<0.01,vs Pre-LPS.

　　LPS组在LPS注入前、LPS注入后1h两个时间点,PAP和IPB NO^－₂和NO^－₃的含量均呈负相关,相关系数r分别为－0.8972(P<0.01),－0.7353(P<0.05)。而两者在LPS注入后3h和5h无明显的相关关系。
　　2.3　L-NNA和AG对5h生存率的影响
　　对照组和LPS组动物5h存活率为100%,L-NNA+LPS组为0%,AG+LPS组为100%。
　　2.4　L-NNA和AG对LPS注入后家兔IPB、OPB中MDA含量的影响
　　LPS组LPS注入前IPB、OPB MDA含量无明显差异,LPS注入后1h IPB MDA含量明显增加,OPB无明显改变;5h IPB,OPB中MDA含量与LPS注入前相比均明显增高;L-NNA+LPS组在LPS注入后1h IPB、OPB MDA含量明显增加,AG+LPS组LPS注入后1h IPB、OPB MDA含量与LPS组同时间点相比无差异,而LPS注入后5h则明显低于LPS组(表2)。

表2　L-NNA和AG对LPS注入后家兔IPB、OPB中MDA含量的影响
Table 2　Effects of L-NNA and AG on the content of MDA in IPB and OPB after LPS administration in rabbits (nmol/L,±s)

Groups	n	Pre-LPS		1h Post-LPS		5h Post-LPS
		IPB	OPB	IPB	OPB	IPB	OPB
LPS	10	44.16±9.34	41.53±6.32	56.17±12.40^*	47.23±10.07	52.46±6.94^*	55.30±9.76^*
L-NNA+LPS	6	39.58±7.42	37.66±10.36	54.67±18.34^*	59.77±16.52^*
AG+LPS	6	40.51±3.54	43.51±6.37	52.14± 8.36^*	49.23± 9.01	47.65±4.50	46.33±6.31

^*P<0.05,compared with Pre-LPS of same group.

　　2.5　L-NNA和AG对LPS注入后家兔肺组织病理改变的影响
　　对照组肺泡无萎陷和气肿,肺泡壁无增厚,毛细血管无扩张充血,白细胞不多;LPS组1h可见肺泡轻度萎陷,毛细血管充血,有时可见出血,白细胞少;LPS组3h肺明显萎陷,肺泡腔变窄,肺泡壁增宽,小血管扩张充血,腔内多形核白细胞增多,有时可见附壁现象,间质细胞增生,炎细胞浸润;LPS组5h可见肺泡萎陷更加严重,肺泡腔消失,局部出现代偿性肺气肿,肺泡壁有处变窄,甚至断裂,有处增宽明显,白细胞明显增多,小血管内皮肿胀甚至脱落,腔内多形核白细胞明显增多。L-NNA+LPS组1h可见肺泡腔变窄,肺泡壁增宽,毛细血管充血,腔内白细胞较LPS组增多。由于该组动物均于3h前死亡,故未观察3和5h的病理改变。AG+LPS组1、3h时肺组织的病理改变与LPS组的同时间点差异不明显,5h可见肺泡萎陷减轻,腔内白细胞反应轻,间质细胞数量较少(图2)。

图2　LPS注入家兔静脉内预注入L-NNA和AG后肺组织光镜下的改变
Fig.2　Light microscopic changes of lung tissue structure
after pre-administration of L-NNA and AG in rabbits,administrated with LPS (HE×360)

　　3　讨论

　　本实验显示家兔静脉内注入LPS后出现MAP下降而PAP增高的现象。我们首次观察了兔LPS注入模型PAP由增高到恢复过程中IPB、OPB NO^－₂和NO^－₃含量的变化。观察到LPS注入后3h OPB,5h IPB、OPB NO^－₂和NO^－₃含量明显高于LPS注入前,可能是LPS及其激活机体生成的细胞因子作用于某些细胞引起了iNOS的诱生,从而使NO大量生成所致。这与文献报道^［6］内毒素血症时iNOS的表达在3h首先出现相一致。相关分析显示LPS注入前PAP与IPB NO呈负相关,LPS注入后1h两者也呈负相关,而在LPS注入后3h和5h两者相关不明显,表明在体内NO没有明显增加时,IPB NO含量的多少直接影响着PAP的高低,换言之,此时IPB NO是抵抗肺动脉压增高和调节肺循环血流的主要因素之一,而在血中NO大量增多(可能是iNOS合成的NO)时,IPB NO的含量不是调节PAP的主要因素。本实验发现LPS注入后PAP的高峰期(LPS注入后1h)IPB中NO^－₂和NO^－₃含量明显降低,OPB无明显变化,表明IPB中NO的减少可能是导致此时PAH的主要因素。引起PAP增高时IPB NO减少的因素可能有两个：(1) NO可能与血中其他物质如氧自由基(OFR) 作用后被消耗；(2) 组织生成的NO减少。实验证实,MDA含量可间接反映OFR在体内的生成状况和组织损伤程度^［7］。本实验发现LPS注入后1h时IPB MDA含量明显增多,而OPB无明显改变,表明此时体循环中OFR引起的损伤已较严重,而肺脏此时尚有较强的抗氧化代偿机制,NO可与增多的OFR起反应,同时OFR又可抑制血管内皮细胞NO的生成^［8］,因而入肺血NO减少,而出肺血NO却没有减少,从而间接表明体内NO的改变与OFR有关。
　　本实验观察到预先注入NO的合成抑制剂L-NNA后PAP在较早期明显增高,再次表明内毒素入血后早期内源性的NO在抵抗PAH和调节肺循环血流中起重要作用。L-NNA既能抑制cNOS也能抑制iNOS合成的NO^［9］,而L-NNA预注入组的动物在LPS注入后较短时间内死亡,这时iNOS尚未诱生^［10］,所以我们考虑注入L-NNA后PAH和肺损伤的加重应该主要是抑制了cNOS释放的NO。注入L-NNA后,IPB、OPB MDA含量进一步增加,进一步证实内毒素入血后早期抑制了NO合成之后肺组织及其他组织损伤加重。
　　由肺组织病理发现,兔LPS注入后随时间的延长肺萎陷逐渐加重,白细胞也逐渐增多。白细胞在毛细血管中被激活后可释放大量的OFR及其他毒性物质,从而引起内皮损伤和通透性增加^［11］。因而本实验表明家兔注入LPS后0～5h中肺损伤随时间的延长而逐渐加重。预注入L-NNA后早期肺萎陷和白细胞聚集进一步加重,同时动物生存率明显降低,表明内毒素入血后早期内源性NO具有抗肺损伤作用。
　　实验证实,AG是iNOS合成NO的选择性抑制剂^［12］。预先注入AG后,动物的MAP明显升高,虽然PAP无明显改变,但 入、出肺血MDA含量明显减少,肺病理损伤和炎症反应明显减轻。表明LPS注入后iNOS释放的NO是参与肺炎症和肺损伤的主要因素之一,而对PAH的缓解似乎不起主要作用。
　　研究结果提示: 家兔内毒素入血后入肺血NO的减少是导致PAH的主要机制之一。内源性NO的作用依据内毒素入血后时间的不同有完全相反的作用: 早期NO对减轻内毒素引起的PAH和肺损伤起重要的作用,而较晚时期,iNOS诱生后释放的NO则参与内毒素引起的肺组织炎症反应和肺损伤的发生。以上研究为临床防治内毒素休克及败血症提供了启示: 不应过早地使用非选择性的NO合成抑制剂,应在适当的时机给予iNOS合成抑制剂。

作者单位：河北医科大学病理生理教研室,石家庄 050017

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1997-12-15收稿　1998-01-20修回