抑制素α亚基片段P³³对大鼠
离体培养黄体细胞凋亡的影响^*

张江红　俞瑾　丰有吉　倪江　程治平　孙颖　鲁桂琛　吴燕婉　李伟雄

　　摘要　我室先前的工作表明,抑制素α亚基片段P³³显著抑制离体培养大鼠黄体细胞的孕酮分泌,整体实验显示P³³促进黄体功能萎缩和细胞凋亡。本实验进一步在细胞水平探讨P³³促进黄体细胞凋亡的作用机制。应用DNA电泳检测技术、DNA荧光(AO-EB PI)染色和流式细胞分析方法观察了P³³对PMSG-hCG假孕大鼠胶原酶DNA酶分散的黄体细胞的自发凋亡的影响。结果三种方法一致显示,P³³ (1 μg/ml)促进黄体细胞的自发凋亡。阻断酪氨酸蛋白激酶活性(genistein 50 μg)则抑制P³³诱导的黄体凋亡;而阻断RNA和蛋白质合成(Cyx,50 μg/ml;Act D,50 μg/ml)均不抑制P³³促进的黄体细胞凋亡。结果表明,P³³促进培养大鼠黄体细胞的自发凋亡,其作用机制可能与TPK途径有关。本实验为抑制素α亚单位或其相关衍生物可能是卵巢局部调节因子之一的假说提供了又一证据。
　　关键词: 凋亡;黄体细胞;抑制素α亚基片段;酪氨酸蛋白激酶;RNA合成;蛋白质合成;大鼠
学科分类号: Q45

EFFECT OF HUMAN INHIBIN α-FRAGMENT
1-32-TYR(P³³) ON APOPTOSIS OF
CULTURED RAT CORPUS LUTEAL CELLS^*

ZHANG　JIANG-HONG,　YU　JIN,　FENG　YOU-JI
(Institute of Obstetrics/Gynecology,Shanghai Medical University,Shanghai 200011)
NI　JIAN，　CHENG　CHI-PING
(Department of Physiology,Harbin Medical University,Harbin 150086)
SUN　YING，　LU　GUI-CHEN
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100050)
WU　YAN-WAN,　LI　WEI-XIONG
(National Research Institute for Family Planning,Beijing 100083)

　　ABSTRACT　Recently,increasing evidence suggests that α inhibin or related proteins may be a functional regulator in the ovary,which is independent of hetero-dimer inhibin.In our previous study,it was demonstrated that human inhibin α-N-terminal fragment Tyr-1-32 (P³³) significantly inhibited progesterone production by rat corpus luteal cells in vitro,and stimulated luteal functional regression and apoptosis in vivo.In the present work,the action of P³³ on apoptosis was further studied in vitro in cultured rat CL cells.Gel electrophoretic analysis for detection of oligonucleosomal DNA fragmentation,AO-EB or PI assays and flow cytometry were used to observe the action of P³³ on the occurrence of spontaneous apoptosis by collegenase-DNase dispersed CL cells,obtained from PMSG-hCG induced pseudopregnent rats.The results showed that P³³ (1 μg/ml) stimulated spontaneous apoptosis of CL cells.The inhibitor of tyrosine protein kinase,genistein (50 μg/ml),inhibited P³³ enhanced spontaneous apoptosis.RNA and protein synthesis inhibitors cycloheximide (Cyx,50 μg/ml) and actinomycin D(Act D,50 μg/ml) did not protect the cells from apoptosis stimulated by P³³.The results suggest that P³³ stimulates spontaneous apoptosis in cultured rat CL cells with the involvement of tyrosine specific protein kinase system.This work provides further evidence for the hypothesis that α inhibin or related protein might be a functional regulator in the ovary.
　　Key words: apoptosis;corpus luteal cells;inhibin α-subunit fragment;tyrosine specific protein kinase (TPK);RNA synthesis;protein synthesis;rat

　　近年来,下丘脑-垂体-卵巢轴系统调控机理研究的一个突破性进展,就是发现抑制素-激活素-卵泡抑素轴这一调控垂体FSH-LH分泌的新家族。α,β_A,β_B三种亚单位在二硫键联接下的不同组合形成了作用相反的两个二聚体：抑制素(αβ_A,αβ_B)和激活素(β_Aβ_B,β_Aβ_A,β_Bβ_B),α亚单位为抑制素所特有,只有二聚体抑制素才抑制垂体FSH的分泌^［1,2］。但是新近的研究表明,在多种动物卵泡液中有大量游离的α亚单位前体蛋白存在,大鼠颗粒细胞分泌游离的α亚单位^［3］;大鼠卵巢α亚单位的表达远远高于β亚单位,并且很多组织只表达α亚单位mRNA^［4］,α亚单位基因纯合子缺失可致小鼠性腺瘤^［5］等等。所有这些均提示,α亚单位或其前体蛋白虽然没有垂体生物活性(不抑制FSH分泌),但很可能具有不同于二聚体抑制素的局部的旁分泌/自分泌调节作用。为了证明α亚单位可能具有局部调节作用,我们与中国医学科学院药物研究所合作合成了四个抑制素α亚单位片段,首先从功能调节角度观察了其对大鼠卵巢细胞激素分泌的作用。结果表明：α亚单位片段极显著抑制黄体细胞孕酮分泌^［6,7］,整体实验显示P³³促进黄体功能萎缩和结构萎缩^［8］,本实验进一步在细胞水平观察P³³对黄体细胞凋亡的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂、仪器　　DNA提取用PMSF、NP-40、EDTA、EGTA、SDS、琼脂糖、蛋白酶K和RNA酶A均为Sigma公司产品,按《分子克隆》实验指南配制。pBR322DNA/BstNI购自中国医学科学院基础医学研究所。Cycloheximide(Cyx)为瑞士产品,actinomycin D(Act D)、genistein、胶原酶Ⅱ、DNA酶Ⅰ为Sigma公司产品。Beckman高速离心机,Perkin-Elmer公司紫外分光光度仪,美国IKegami Electromics公司DNA指纹仪,瑞典LKB-Produkter AB激光密度仪。
　　P³³为人抑制素α亚基N末端［Tyr］-1-32片段,由中国医学科学院药物研究所合成^［9］,其结构为: Tyr-Ser-Thr-Pro-Leu-Met-Ser-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ser-Ala-Leu-Arg-Leu-
Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Ala-His-Ala-Asn-Cys-His-Arg
　　1.2　动物处理、细胞制备与培养
　　1.2.1　动物处理　　25～28日龄健康雌性SD大鼠,体重60～80 g,购自国家计划生育委员会科学技术研究所动物室。动物喂养条件为每日光照14 h,黑暗10 h,室温20±2℃,水食任意摄取。每只大鼠于上午8时颈部皮下注射PMSG 65 U,48 h后注射hCG 50 IU,促进卵巢排卵与黄体化。以hCG注射当天为黄体第一天(D1),细胞培养用黄体为D7组织。
　　1.2.2　黄体细胞的制备与培养　　黄体细胞的制备同前^［6,7］,胶原酶-Ⅱ―DNA酶-Ⅰ消化分散的细胞经离心洗涤后,用KRBGAL液稀释至每毫升含60万细胞,分装于50 ml培养管,13 ml/管,在37℃水浴中振荡培养。预培养1 h后加处理因素,继续培养4 h,取出培养管于400×g 15 min离心,按实验组合并收集细胞,细胞分别用于DNA提取电泳分析,流式细胞计数或荧光染色DNA形态观察。
　　1.3　DNA提取　　参照Kyprianou等^［10］方法进行。
　　1.3.1　细胞核的获取　　细胞＋10 Vol溶液A(mol/L: Tris-HCI 10,pH 7.4,Sucrose 250,MgCl₂ 3,EGTA 3,NaCl 25含PMSF 1)匀浆,过滤,离心(800×g,4℃ 15 min)。沉淀物中加入溶液A和0.5%　v/v NP-40于冰中孵育10 min,离心沉淀细胞核。
　　1.3.2　低分子量DNA的直接提取　　细胞核加DNA提取液(mol/L: EDTA 1.5,EGTA 35)于4℃孵育20 min,离心(9?000×g,4℃ 20 min),上清用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次,然后加乙醇－20℃过夜,离心沉淀DNA,洗涤,干燥,TE溶解DNA,测OD值,电泳检测DNA。
　　1.3.3　细胞核经“消化”后再提取DNA(自消化法)　　细胞核＋溶液B(mol/L: Tris-HCI 10,pH7.4,Sucrose 340,NaCl 25)离心洗涤两次,沉淀＋1 ml溶液B 37℃孵育2～3 h,然后按1 ml体系加7 μl终止反应液(mol/L: EDTA 0.15,EGTA 35)于冰中震摇以终止反应,离心收集细胞核,以下步骤同上。
　　1.3.4　高分子量DNA提取　　上述9?000×g离心沉淀物＋1 ml TE、0.1 ml 10% SDS和300 mg蛋白酶K 37℃过夜,氯仿-异戊醇抽提,乙醇沉淀DNA,再加RNA酶A(60 μg/ml)37℃1　h,抽提、沉淀、洗涤、干燥DNA(同上),TE溶解HMW DNA 测 OD值。
　　1.3.5　DNA含量测定　　用紫外分光光度计检测DNA浓度,根据测定的OD值计算样品DNA含量。低分子量DNA(Low molecular weight DNA,LMW DNA)的百分数=低分子量DNA/(低分子量DNA+高分子量DNA)×100%。
　　1.3.6　DNA琼脂糖凝胶电泳　　低分子量DNA样品(≤10 μg)在1.8%琼脂糖凝胶TAE电泳液中电泳分离,电压为4～5 V/cm,2～3 h。电泳后凝胶置EB(0.5 μg/ml)液中染色30～45　min,用指纹印迹仪观察照像。所有的细胞培养或细胞核孵育样品,均以相同的细胞或细胞核提取DNA,用相同体积的TE溶解DNA,相同体积样品上样电泳。DNA片段以pBR322DNA/BstN1为marker指示(1857、1060、929、383、121、13 bp)。凝胶电泳凋亡DNA片段(185 bp倍增)用光密度积分仪扫描定量(相对量)。
　　1.4　细胞的荧光染色法　　参照Piazza GA等的方法^［11］,取AO(100 μg/ml)和EB(100 μg/ml)等体积混匀制成AO-EB荧光染液。将培养细胞用PBS离心洗涤两次,稀释至10⁶/ml,取1　ml细胞悬液(10⁶细胞)离心收集细胞,加入25 μl PBS重新悬浮细胞,与1 μl AO-EB荧光染液混合,取10 μl点片,荧光显微镜下观察、照像。PI染色方法相同。
　　1.5　流式细胞术检测PI标记细胞DNA分析法　　参照Belloc F等的方法^［12］将计数的培养细胞用PBS离心洗涤两次后,用注射器吹入70%乙醇固定,取5×10⁵细胞离心弃乙醇,用PBS离心洗涤两次后加入0.1%　Triton-X 100,5 μg/ml RNA酶37℃消化15～20 min,然后加入50 μg/ml PI 4℃ 30～60 min后上机检测。本实验流式细胞测定在北京人民医院血液室指导下测定完成。

　　2　结果

　　2．1　LMW DNA电泳分析P³³对培养黄体细胞凋亡的影响及作用机制
　　所有的细胞培养或细胞核孵育样品,均以相同的细胞或细胞核提取DNA,用相同体积的TE溶解DNA,相同体积样品上样电泳。结果显示,实验对照组可见凋亡特征性梯形条带,P³³梯形条带多于对照组(图1A,B)。低分子量DNA含量的计算结果与电泳结果一致,P³³组低分子量DNA含量多于对照组(图1C,D)。表明P³³ 加强离体培养大鼠黄体细胞的自发凋亡。

图1　P³³ 加强离体培养大鼠黄体细胞的自发凋亡
Fig.1　Enhanced spontaneous apoptosis by P³³ in cultured rat corpus luteal cells
Low molecular weight (LMW) DNA was extracted directly from nuclei (A) or from those after 2 h autodigestion (B).The densities of densitometric scans of internucleosomal DNA (＜800,C) and the persentage of LMW DNA (D) were in correspondence with A.C: from duplicated independent experiments,SE did not exceed 25% of the mean.Lane 1: genestein+P³³;2:genestein;3: P³³;4: Zn²⁺+P³³;5: Zn²⁺;6: control.

　　Genistein是特异的酪氨酸蛋白激酶抑制剂,Genistein 50 μg与P³³ (1 μg/ml)合用则抑制P³³诱导的黄体凋亡,这一作用在提取细胞核将核于缓冲液B中37℃水育自消化2 h,然后再提取LMW的DNA电泳图上,尤为明显(图1B),低分子量DNA含量的计算结果与电泳结果一致,P³³组低分子量DNA含量在与Genistein合用时下降至对照组水平(图1C,D)。表明P³³促进的培养大鼠黄体细胞自发凋亡的作用机制可能与TPK途径有关。Cyx 和Act D 分别是RNA和蛋白质合成抑制剂,当 Cyx (50 μg/ml),Act D (50 μg/ml)分别与P³³(1 μg/ml)合用时,均不逆转P³³促进的黄体细胞凋亡(图2)。这些结果表明,P³³刺激的离体培养大鼠黄体细胞的自发凋亡与RNA和蛋白质合成途径无关。

图2　P³³刺激的离体培养大鼠黄体细胞的自发凋亡与RNA和蛋白质合成途径无关
Fig.2　 Spontaneous apoptosis stimulated by P³³ not through the RNA and protein synthesis pathway
DNA was extracted directly and LMW DNA for electrophoresis (equal volume of DNA in each lane) (A) and densitometric scans of internucleosomal DNA fragments of A-a (360～400 bp),A-b (A) (540～600 bp) from right to left (B)corresponding with A.

　　2.2　DNA荧光染色分析
　　AO(吖啶橙)、EB(溴化乙锭)是核酸特异的荧光染料,经RNA酶处理细胞后则特异地染色DNA。结果如图3所示,应用AO-EB荧光染色显示,对照组见较多的完整、圆形、黄染的细胞核,绿色很少;Zn²⁺组绿片更少;P³³ 组视野中多见成片的绿色碎片,高倍镜为囊泡状绿色,较少完整的细胞核。用PI染色观察这几组的核变化也得到了相同的结果,差别仅在于核着色不同(PI红色)。在黑白图上细胞核为白色,凋亡的绿色碎片结构为淡淡的絮状。可见P³³组凋亡的淡淡的絮状结构明显多于Zn²⁺组和对照组(图3)。

图3　培养黄体细胞DNA荧光染色分析(AO-EB荧光染色)
Fig.3　Staining feature of cultured corpus luteal cells by acridine orange/ethidium bromide
Left: control;middle: Zn²⁺ group;right: P³³ group all 160×.

　　2.3　流式细胞术分析
　　PI(碘化丙啶)为定量细胞化学的荧光染料,能插入双链DNA和RNA的碱基对之间;每隔5个碱基插入一个PI分子。经RNA酶消化后与DNA特异结合。以特定波长激发,可发射出红色荧光。核酸分子越大,则插入的PI分子越多,荧光强度越大。流式细胞术分析就是依据这一原理,计数一定量的个体(细胞或凋亡小体),根据荧光强度推断核酸分子大小。因此,该方法可了解细胞DNA含量变化及分布。
　　三组培养细胞经RNA酶消化、PI染色30～60 min后上机检测。计数5?000个单位(e-vents-细胞或凋亡小体)的核酸大小分布,结果见图4。P³³组G1峰明显降低(图4A),G1峰左侧出现较高的亚二倍体细胞群峰型(Sub 2n),亚二倍体细胞数增加。在光散图上(图4B)P³³组前向散射低于对照组和Zn²⁺组,呈单一的散射带。上述结果表明P³³组细胞核酸降解。

图4　流式细胞仪分析培养黄体细胞的DNA含量分布
Fig.4　Size distribution of DNA from cultured rat corpus luteal cells by flowcytometry
A． The ordinate indicates the number of cells in each size category;the abscissa is an arbitrary scale of cell size.B．The do tplot histograms show the dot plots of total cells.Each dot represents a single event．

　　3　讨论

　　黄体细胞凋亡机制的分析目前还停留在离体模型的探索水平,没有深入^［13］,以大鼠黄体为对象的在体和离体凋亡研究实验都尚未见报道。抑制素α亚基片段P³³显著抑制离体培养大鼠黄体细胞的孕酮分泌^{［ 6,7］},整体实验显示P³³促进黄体功能萎缩和结构萎缩^［8］,因此,本实验进一步在细胞水平观察P³³对黄体凋亡的影响。细胞凋亡是一个主动过程,在多种组织依赖RNA和蛋白质的合成^［14,15］,并有第二信使系统介与;Zn²⁺是公认的凋亡过程中核酸内切酶的抑制剂^［16,17］,所有这些是否具有种属或组织特异性,是否介与P³³促进黄体细胞凋亡的过程,本实验对此进行了探索。
　　实验首先尝试确立了大鼠黄体离体细胞凋亡研究模型。参照Kyprianou等的^［10］方法,提取小片段DNA;由于本方法首先获取细胞核,根据介导凋亡的核酸内切酶对离子的依赖性特点,将细胞核置于适宜的离子环境下,则可进一步激活该酶,促进细胞凋亡,即增加LMW DNA量,以保证电泳获得清晰的梯形DNA 条带(自消化方法)。实验证明,自消化方法的结果与DNA直接提取电泳的结果趋势相同(图1A,B),均显示黄体细胞具有自发凋亡现象(实验对照组可见凋亡特征性梯型DNA条带),而P³³促进其自发的凋亡。自消化方法具有放大差异,利于直观比较的优点(图1B)。采用DNA荧光染色和流式细胞术分析方法的观察结果与电泳结果一致提示P³³促进黄体细胞的自发凋亡。
　　在大鼠黄体,主要抑制RNA聚合酶的ActD和抑制核蛋白体上肽键的Cyx均可抑制黄体细胞孕酮分泌,抑制RNA和蛋白质的合成。但在本实验中,非但不能阻断P³³诱导的细胞凋亡,相反本身就促进细胞凋亡(图1A,B),说明大鼠黄体的凋亡过程与一般细胞有所不同。坏死是一个被动的过程,不需要新的蛋白质参与,而凋亡是一个主动的过程。一般来说,RNA和蛋白质合成抑制剂能阻断或抑制细胞的凋亡,说明这一过程有赖于一些新合成的蛋白质参与才能完成^［14,15］。但并非所有的细胞都遵循这一规律,如人白血病HL-60细胞、小鼠淋巴瘤细胞、以及巨噬细胞等,阻断蛋白质合成对一些因素所致的凋亡,不但不起对抗作用,反而导致凋亡^［18,19］。实验结果提示,可能介导凋亡的核酸内切酶在正常黄体组织内存在,但处于无活性状态,条件适合时才显示出活性。P³³促进黄体细胞的自发凋亡与RNA和蛋白质合成途径无关。
　　凋亡细胞内信息传递机制普遍认为是PKA介导凋亡的产生^［20］,而PKC系统则保护细胞免于凋亡^［15］,对TPK的作用知之较少。我们用TPK抑制剂genistein后对抗P³³诱导的细胞凋亡,提示TPK可能介与P³³诱导的黄体细胞凋亡过程。Kenny^［13］在探索阻止黄体细胞自发凋亡的实验中用酪氨酸磷酸酶抑制剂也发现抑制凋亡。与我们TPK的磷酸化可能介导黄体细胞凋亡产生的结果一致,使人们设想酪氨酸磷酸化可能参与黄体细胞凋亡过程。
　　本实验在离体细胞培养水平证实具有很强的抑制培养黄体细胞孕酮分泌的抑制素α亚基N 末端［Tyr］-1-32 片段能促进培养黄体细胞的自发凋亡。结果提示,诱发凋亡机制可能是该片段抑制培养黄体细胞孕酮分泌的机制之一。本实验结果为抑制素α亚单位或其相关衍生物可能是卵巢局部调节因子之一的假说提供了又一佐证。

*国家计划生育委员会85攻关项目资助 (No.85-918-05-02)
*This project was supported by the State Family Planning Foundation of China （No.85-918-05-02）.

作者单位：张江红　俞瑾　丰有吉：上海医科大学妇产科研究所,上海 200011
　　　　　倪江　程治平：哈尔滨医科大学生理教研室,哈尔滨 150086
　　　　　孙颖　鲁桂琛：中国医学科学院药物研究所,北京100050
　　　　　吴燕婉　李伟雄：北京国家计划生育科学技术研究所,北京 100083

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1997-12-08收稿　　1998-03-30修回