甘氨酸对鲫鱼视网膜ERG b-波
和ON型双极细胞活动的调制^*

徐祥敏　杨雄里^**

摘　要　本工作在分离灌流的鲫鱼视网膜上研究了甘氨酸对明、 暗视视网膜电图(ERG) b-波和胞内记录的ON型双极细胞反应的作用。 结果表明, 甘氨酸能明显压抑ERG b-波和ON型双极细胞的反应, 其作用能为士的宁所翻转; 甘氨酸对用谷氨酸分离的ERG P　Ⅲ成分(光感受器电位)无明显影响。 这些结果提示, 甘氨酸可能直接作用于双极细胞的受体, 从而调节视网膜ON通路的活动。
关键词: 甘氨酸; 视网膜电图(ERG) b-波; ON型双极细胞; 调制作用; 甘氨酸受体
学科分类号: Q436

GLYCINE MODULATES THE ERG b-WAVES AND
ON-TYPE BIPOLAR CELLS IN CARP RETINA^*

XU　XIANG-MIN，　YANG　XIONG-LI^{*    *}
(Shanghai Institute of Physiology, Laboratory of Neurobiology,
Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031)

ABSTRACT

　In the present work we investigated the effects of glycine on the electroretinograms (ERG) and light responses of ON-type bipolar cells under dark- and light-adapted conditions in superfused, isolated crucian carp retinas. It was revealed that application of 4 mmol/L glycine significantly suppressed the b-waves and the responses of ON-type bipolar cells and the effects were blocked by co-application of 20 μmol/L strychnine. In addition, glycine had no apparent action on the P　Ⅲ component (photoreceptor potential) isolated by application of 3 mmol/L glutamate. These results suggest that glycine may act on bipolar cells directly and thus modulate the activity of the ON pathway in the retina.
Key words: glycine; ERG b-wave; ON-type bipolar cell; modulate; glycine receptor

　　甘氨酸是脊椎动物中枢神经系统中一种重要的抑制性递质, 参与对运动和感觉信息的处理^[1]。 在视网膜中, 甘氨酸含量甚高, 并能由光、 高钾和兴奋性氨基酸刺激诱发释放^[2,3]。 在两栖类(蝾螈、 爪蟾), 已有研究表明, 甘氨酸在外层视网膜的信号传递, 特别是对OFF通路有明显的调制作用^[4], 而且在双极细胞的中心-周围拮抗感受野的形成起着重要的作用^[5]。 在金鱼视网膜, 免疫组化研究表明, 甘氨酸能神经元包括多种无长突细胞、 一种网间细胞等^[6,7]; 这些细胞在不同程度上与双极细胞和无长突细胞形成突触联系^[8,9], 提示甘氨酸有可能直接参与对双极细胞活动的调制。 本工作在分离灌流的视网膜上研究了甘氨酸对暗视和明视视网膜电图(ERG) b-波以及ON型双极细胞的作用, 并分析了其可能的作用部位及生理意义。

1　材料和方法
1.1　动物标本和灌流系统　　鲫鱼(Carassius auratus, Linne), 叉长13.5～18 cm, 从市郊鱼池捕获后饲养于室内水箱中, 循环水由气泵通气, 日照条件同自然状况。 实验前动物在暗室内暗适应1 h左右, 在暗红光下迅速摘取眼球, 切除包含角膜和晶状体的眼球前半部后, 将眼杯倒置于滤纸, 使视网膜与色素上皮层分离。 分离后的视网膜连同滤纸置于灌流小室(光感受器面向上)进行灌流。 灌流液在重力作用下或经蠕动泵(Rainin Rabbit-Plus^TM, 美国Rainin Instrument Co. Inc.)传输流入小室, 在光感受器一侧平稳流经视网膜。 灌流液的切换由多通开关实现。 小室容积0.8 cm³, 灌流速度2.5 m1/ min, 因此小室内的溶液可在30 s内完全替换。 正常灌流液(Ringer′s液)的组成如下(mmo1/L): NaCl 116, KCl 2.4, CaCl₂ 1.2, MgCl₂ 1.2, NaH₂PO₄ 1.0, NaHCO₃ 28, 葡萄糖10 (以上试剂均为国产）。 Ringer′s液在每次实验前用去离子水配制, 并调节pH值至7.7; 药物在实验前用新鲜Ringer′s液配制至所需浓度。 实验时灌流液通以含95% O₂和5% CO₂的混合气。 在这种实验条件下, 视网膜一般可维持良好状态达4～5 h。
1.2　光刺激系统与记录系统　　实验系统的光刺激器产生两平行光束(分别作刺激光和背景光)可同时投射至视网膜形成直径8 mm的圆形光斑。 光束的颜色和强度分别由干涉滤光片、 中性滤光片改变。 白光和单色光能量均由UDT光度计(UDT-114A, 美国United Detector Technology)测量。 在视网膜水平未衰减刺激光强度(695 nm, log I=0)为1.58×10¹⁴ photons/cm^2.s, 未衰减白色背景光强度(log I_B=0)为6.3 μW/cm²。 文中光的强度均分别以此为基准, 用相对对数单位表示。
　　ERG记录电极为Ag-AgCl细丝, 插人内含5% NaCl和1.2%琼脂的玻璃管, 玻璃管尖直径为0.5 mm, 与视网膜光感受器一侧的灌流液相接触; 参考电极为灌流小室底部的Ag-AgCl银片。 细胞内记录采用尖端小于0.5 μm的玻璃微电极, 由卧式拉制器(日本Narishige, PD-5)拉制, 内充灌4 mol/L KAc, 在Ringer′s液中测定阻抗为100 MΩ左右。 ERG记录和胞内反应分别经前置放大器(FZG-81, 上海生理研究所, 高频截止频率100 Hz～3 dB, 时间常数l s)和微电极放大器(MEZ8201, Nihon Kohden)显示于示波器, 由笔线记录仪(Graphtec, WR-3801, 频响0～70 Hz±5～10 dB)在实验过程中记录, 同时记录于数据记录仪(TEAC, R-80, 频响0～625±0.5 dB)。
　　双极细胞的鉴定按照以往形态和生理相关的研究所确定的标准^[10]。 区别视杆性和视锥性双极细胞的标准为: (l) 前者对光(500 nm)敏感度至少较后者高1.5对数单位; (2) 在较强连续闪光刺激下, 前者的光反应受到明显压抑^[11]。

2　结果
2.1　甘氨酸对暗视和明视ERG b-波的作用
　　在暗适应时, 鲫鱼ERG是一个单纯的b波, 遵循单变量原理, 只反映视杆系统的活动^[12]。 为了不破坏视网膜的暗适应状态, 实验过程中避免应用强光刺激, 两次闪光间隔定为12 s。 图1显示甘氨酸对暗视b波的作用。 在施加4 mmol/L甘氨酸后, 测试光(500 nm, log I=－4.51)所诱发的b波逐渐从120 μV(对照)减小至80 μV。 在同样实验条件下, b波压抑平均为24.3±11.7(±s, 下同)% (n=8)。 同时施加20 μmol/L甘氨酸受体拮抗剂士的宁, b波迅速回复至对照水平。 图2显示在正常Ringer′s液中和施加4 mmol/L甘氨酸后的平均b波振幅-强度(V-log I)曲线(n=5).对任一标本的所有数据点均以Ringer′s液中500 nm (log I=－3.79)闪光诱发的b波归一。 在甘氨酸作用下对不同强度闪光的反应均有所降低, 降低的比例十分接近。 因此若以其500 nm (log I=－3.79)闪光诱发的b波归一, 则V-log I 曲线(点线所示)与正常Ringer′s液中测得的V-log I 曲线几乎完全重合。

图1　 4 mmol/L 甘氨酸对暗视 ERG b-波的影响

Fig.1　Effect of 4 mmo1/L glycine on the ERG b-waves recorded in a dark-adapted retina
Test flash (500 nm, log I=－4.51) of 500 ms was presented at intervals of 12 s. The b-waves were suppressed by application of 4 mmol/L glycine and the effect was blocked by co-application of 20 mmol/L strychnine. The waveforms shown below the continuous trace were the responses, recorded at different times marked by A, B, C and displayed in a faster scale.

图2　　暗视ERG在正常Ringe′s液和施加4 mmo1/L甘氨酸后的平均b波振幅-强度(V-log I)曲线

Fig.2　Average b-wave V-log I relationships determined in normal Ringer′s (●) and after application of 4 mmol/L glycine (■) for dark-adapted retinas (n=5)
For each preparation all data were normalized in terms of the b-wave amplitude elicited by a flash of 500 nm (log I=－3.79) recorded in normal Ringer′s. Data represent means±SE (±s). When the data obtained after glycine application were normalized in terms of the response to the 500 nm flash (log I=3.79), the V-log I relationship (dashed line) coincided with that obtained in normal Ringer′s.

　　在作明视ERG记录时, 背景白光(log I_B=－2.20)开启, 较强的光刺激可清楚地区别a,b,d波。 测试光为700 nm (log I=－0.19), 为清楚区分b波和d波, 测试光时程延长至l s。 图3显示4　mmol/L甘氨酸对明视ERG的影响。 在施加4 mmol/L甘氨酸后, 在最初45 s内b波逐渐减小, 但d波略有增大; 之后d波也开始减小, 并渐趋稳定。 甘氨酸的压抑作用可以为20 μmol/L士的宁所翻转。 6例统计结果表明, b波和d波的平均压抑分别为(28.6±9.5)%和(22±10.2)%。

图3　 4 mmol/L甘氨酸对明视ERG b-波的影响

Fig.3　Effect of 4 mmol/L glycine on the ERG b-waves recorded in a light-adapted retina
Test flash (700 nm, log I=－0.19) of 1 s was presented at intervals of 4 s. The b-waves were suppressed by application of 4 mmol/L glycine and the effect was blocked by co-application of 20 μmol/L strychnine. The waveforms shown below the continuous trace were the responses, recorded at different times marked by A, B, C and displayed in a faster scale.

2.2　甘氨酸对ON型双极细胞的影响
　　一般认为, ERG b-波是ON型双极细胞活动的反映^[13,14], 我们进一步考察了甘氨酸对ON型双极细胞的作用。 图 4A 显示 4 mmol/L 甘氨酸对视杆性 ON 型双极细胞的作用。在Ringer′s液中细胞对测试光(500 nm, log I=－3.37)的反应最初是典型的全视野照射的反应特征, 即最初是ON-瞬变成分, 继而是一个小平台(感受野中心反应), 在撤光后有一个明显的超极化成分(感受野周围反应)。 在施加4 mmol/L甘氨酸后, 膜电位超极化约8 mV, ON反应迅速减小, 在45 s内从18 mV降至5 mV, 与此同时超极化成分也逐渐减小, 几乎完全消失。 同时施加20 μmol/L士的宁, ON反应和超极化成分逐渐回复。 在7例细胞上的结果表明, 4 mmol/L甘氨酸对ON反应的平均压抑为(74.9±19.6)% 。 甘氨酸对大多数(5/6)视锥性ON型细胞也显示相似的压抑作用, 图4B显示其中的一例。 在4 mmol/L甘氨酸作用下, ON反应和超极化成分均逐渐被压抑, 这种压抑作用可为20 μmo1士的宁所翻转。 但是在另一例(l/6)细胞, 甘氨酸对ON反应无明显压抑。

图　4　 4 mmol/L甘氨酸对视杆和视锥主导的ON型双极细胞的作用

Fig.4　Effect of 4 mmol/L glycine on the rod- and cone-dominant ON bipolar cells

A.The responses of a rod-dominant ON bipolar cell, elicited by a test flash (500 nm, log I=－3.37) of 500 ms presented at intervals of 7 s. B. The responses of a cone-dominant ON bipolar cell, elicited by a test flash (700 nm, log I=0.62) of 500 ms presented at intervals or 5 s. 4 mmol/L glycine suppressed the light responses in both the cases and the effects were blocked by co-application of 20 μmol/L strychnine.

　　甘氨酸对b波和ON型双极细胞的压抑作用均不能为GABA受体的拮抗剂(印防己毒素)所阻断。
2.3　甘氨酸对P　Ⅲ无明显作用
　　由于鲫鱼视网膜光感受器不易直接进行细胞内记录, 我们研究了甘氨酸对光感受器电位(P　Ⅲ)的影响。 在这一实验中, 我们先用3 mmol/L谷氨酸灌流, 压抑b波, 把ERG的P　Ⅲ成分分离出来。 结果表明, 4 mmol/L甘氨酸对明、 暗视P　Ⅲ均无明显作用。 图5 所显示的是4 mmol/L甘氨酸对明视P　Ⅲ的实验结果, 在3 min内P　Ⅲ几乎没有任何变化。

图5　 4 mmol/L甘氨酸对明视P　Ⅲ成分无明显作用

Fig.5　4 mmol/L glycine had no apparent action on the photopic ERG P　Ⅲ component
Test flash (700 nm, log I=－0.19) of 1 s was presented at intervals of 4 s. The waveforms shown below the continuous trace were the responses recorded at different times marked by A and B, and displayed in a faster scale.

3　讨论
　　本工作的结果表明, 甘氨酸对暗视、 明视ERG b-波均有压抑作用。最近对鳖ERG的研究显示, 50 μmol/L士的宁可以明显增加暗视和明视b波的幅度^[l5,16]。 这两种结果相互吻合。 近年的工作提示, 在相当大的程度上b波是ON型双极细胞活动的反映^[13,14], 因此甘氨酸对b波和ON型双极细胞具有相似的压抑作用是可预期的。 近年对大鲵视网膜第三级神经元的研究表明, 甘氨酸受体可能存在士的宁敏感和士的宁不敏感的两类^[17]。 鉴于本工作报道的甘氨酸的压抑作用可以为士的宁所翻转, 提示其作用是经士的宁敏感的受体所介导。 根据对大鲵视网膜双极细胞作用的研究, Cunningham和Miller曾提出γ-氨基丁酸(GABA)更多地参与 ON通路活动的调制, 而甘氨酸主要与OFF通路的调制有关^[4]。 但是我们的结果提示, 至少在鲫鱼视网膜, 甘氨酸也明显地参与对ON反应活动的调制。
　　双极细胞从几个不同的来源接受输入: 光感受器, 水平细胞, 无长突细胞和网间细胞等。 在光感受器上未发现有甘氨酸受体的存在^[18], 本工作的结果也显示甘氨酸对光感受器电位(P　Ⅲ)没有影响, 这提示我们报道的甘氨酸压抑作用并非是对光感受器作用的继发性结果。 在虎蝾螈视网膜, 甘氨酸促使GABA释放, 从而调制水平细胞的活动^[19]。 但甘氨酸对鲫鱼视网膜双极细胞的压抑作用似乎并非通过GABA受体所介导, 因为我们实验结果表明这种作用不能为印仿己毒素(GABA受体的拮抗剂)所阻断。 因此甘氨酸可能直接作用于双极细胞。 事实上, 免疫组化研究已表明, 金鱼的双极细胞确实存在甘氨酸受体阳性显示, 这些细胞接受甘氨酸能的无长突细胞的突触输入^[9]。 看来, 在正常生理条件下, 正是这些无长突细胞所释放的甘氨酸参与了对双极细胞活动的调制。

^*本项目获国家科委 “攀登计划” 《脑功能及其细胞和分子基础》、 国家自然科学基金会 (No.39670253)、 上海生命科学中心资助。
^*　*联系作者
^*This resemch was supported by grants of the Ministry of Science and Technology of China (Climbing Project), the National Natural Science Foundation of China (No.39670253), and the National Research Center of Life Sciences.
^**Corresponding author

作者单位：徐祥敏　杨雄里　中国科学院上海生理研究所, 中国科学院神经生物学开放实验室, 上海　200031

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1998-03-17收稿　　1998-05-18修回