移植神经营养素-4基因工程细胞
对脊髓前角神经元的保护作用

侍　坚　曲　伸　路长林　何小龙　王成海

摘　要　　用重组逆转录病毒介导的体外神经营养素-4(NT-4)基因转移方法, 制备高表达NT-4基因工程细胞并移植大鼠坐骨神经离断处。 尼氏染色和ChE染色的结果表明, 移植NT-4基因工程细胞对外周神经损伤所造成的运动神经元的退变有显著的改善作用, 而且这种作用可以维持三个月。
关键词: 神经营养素-4; 运动神经元; 外周神经损伤
学科分类号: Q78

PROTECTION OF SPINAL MOTORNEURONS OF
SECTION SCIATIC NERVE BY TRANSPLANTATION OF
NT-4 GENETICALLY EXPRESSION CELLS INTO
THE SIDE OF SECTION

SHI　JIAN,　QU　SHEN,　LU　CHANG-LIN，
HE　XIAO-LONG，　WANG　CHENG-HAI
(Department of Neurobiology, The Second Military Medical University, Shanghai 200433)

ABSTRACT

　The NT-4 genetically engineered cells were made by infecting L-6TG cell(a rat myoblast cell line) in vitro with a retroviral vector pN₂A containing the rat NT-4 cDNA. The bioactivities were determined by bioassay of PC12 cell survival rate. The rat with left sciatic nerve transaction was used as a model for treatment by implanting NT-4 genetically modified cell. The condition of motorneurons was assessed by Nissl stain and ChE stain. The results showed that: (1) the percentage of surviving Nissl-stained neurons on the lessened side of NT-4(+) grafts significantly increased as compared to that with NT-4(-) grafts 2～3 weeks and 3 months after sciatic nerve transaction, and (2) the grafted cells produced significant increase in the positive ChE stained area after sciatic nerve transaction in 1～3 weeks. Our observations indicate that adult motor neurons are still able to respond to neurotrophic factors and they may require the factors for survival.
Key words: neurotrophin-4; motorneurons; nerve injury

　　神经营养因子是一类能够促进神经细胞存活、 生长和分化的蛋白质。 神经营养因子不仅可以影响胚胎神经元的发育, 而且能够促进成熟神经元的存活与生长, 在神经损伤修复过程中具有重要作用^[1,2]。
　　神经营养素-4 (NT-4)是神经营养素家族成员之一, 它的成熟蛋白有123个氨基酸, 受体为TrkB^[3]。 它在中枢和外周分布很广, 对运动神经元、 基底前脑的胆碱能神经元与海马、 下丘脑、 延髓等处的神经元的生长、 分化具有促进作用^[4,5]。 最近的研究发现,　NT-4不仅对神经元有促进存活、 生长和分化作用, 而且对神经肌肉接头的形成有促进作用, 它能够诱导正常运动神经元出芽^[6], 因而NT-4对运动神经元的疾病有潜在的治疗作用, 如对神经损伤的修复, 对肌萎缩脊髓侧束硬化症的治疗等。
　　目前认为, 外周神经损伤时, 逆向运输的神经营养因子缺乏是造成神经元病变和死亡的原因之一^[7]。 NT-4对运动神经元有营养和促进存活的作用^[8], 因而应用NT-4对外周神经损伤所造成的运动神经元病变进行治疗有可能获得较好的治疗效果。 然而对于神经损伤和某些退行性疾病的治疗需要长期用药, 这是比较困难的, 而用移植基因工程细胞的方法则可以得到一次或几次给药长期有效的结果。

1　材料和方法
1.1　NT-4基因工程细胞　　把大鼠NT-4c DNA基因克隆到双拷贝逆转录病毒载体pN₂A中, 采用重组逆转录病毒介导的体外NT-4基因转移方法, 制备高表达NT-4的肌母细胞(L-6TG), 作为NT-4基因工程细胞, 表达NT-4蛋白经检测具有神经营养活性, 表达量为: 500 U/10⁶　cells/24　h。
1.2　动物与动物模型　　体重180～200 g的SD大鼠49只,随机分为3组,1组为损伤组, 2组为移植L-6TG细胞对照组, 3组为移植NT-4基因工程细胞组, 每组再分为3个时间点, 动物分组情况见表1。

表 1　动物分组情况
Table 1　Different groups of animals

Group	1 week	2 weeks	3 weeks	3 months
NT-4	3	3	4	6
L-6TG	3	3	3	6
Injury	6	3	3	6

　　把大鼠左侧坐骨神经从刚出孔处切掉0.5　cm, 作为外周神经损伤模型。 同时在坐骨神经离断处, 移植相应细胞, 损伤组不移植细胞。
1.3　观察指标　　3组动物术后正常饲养, 以2%戊巴比妥钠麻醉大鼠, 取脊髓做冰冻切片, 对冰冻切片进行尼氏染色和胆碱脂酶染色。
　　尼氏染色　　对术后1、 2、 3周和3个月各组动物脊髓L4～L6(每一动物取5片)冰冻切片进行尼氏染色, 观察神经元的形态变化情况。 神经元的计数是在Leica quantity 570图像分析系统(德国Leica公司)上进行的, 根据染色的灰度、 大小定下统一标准, 然后由计算机自动计数。
　　胆碱脂酶染色　　我们用亚铁氰化铜法对术后1、 2、 3周各组动物脊髓L4～L6冰冻切片(每一动物取5片)进行ChE染色, 然后在Leica quantity 570图像分析系统上对染色后的切片进行图像处理。 对同一批染色的切片, 根据染色灰度的情况定下统一标准, 然后由计算机自动计数, 统计阳性颗粒的面积。

2　结果
2.1　尼氏染色的结果
　　尼氏(Nissl)体系神经细胞胞体内含有的特异性嗜色质, 我们一般习惯于借尼氏体来辨认或鉴定神经细胞的存在和它们的分布及是否发生病理性改变。 术后2周, 损伤组坐骨神经切断侧(左侧)的脊髓前角深染神经元与对侧相比减少, 有一部分神经元染色变淡, 一些神经元轮廓不清楚(图1A、 B、 C, 见图版Ⅲ)。 NT-4基因工程细胞移植组损伤侧神经元染色与正常侧相比差别不大 (图1D、 E、 F, 见图版Ⅲ)。

图1　坐骨神经损伤后2周的脊髓腰段损伤组织和NT-4组尼染色

Fig.1　Nissl staining of lumbospine after sciatic nerve transaction of 2 weeks after injury
　　　and NT-4 groups
A is a picture of Nissl staining in injury groug (3.3×4);B and C are A's injury (left)and normal
(right)side (3.3×20).D is a picture of Nissl staining in NT-4 guoup (3.3×4);E and F are D's
injury (lrft) and normal (right)side (3,3×20).

　　坐骨神经切断1、 2、 3周和3个月后, NT-4基因工程细胞移植组、 L-6TG细胞移植组、 损伤组的脊髓前角外侧核大、 中神经元的数量及左右侧配对t检验结果, 见表2。 从中可以看出术后1、 2、 3周和3个月NT-4组尼氏染色阳性神经元的百分率分别为86.3、 84.8、 88.9和83.8％, 而对照组各时间点的百分率分别为82.5、 64.2、 60.5和63.9％, 两组之间除了第1周外, 均有显著性差异(P<0.05)。 各时间点L-6TG组和损伤组之间均无显著性差异。 这一结果表明, 移植NT-4基因工程细胞可以显著减轻因外周神经损伤造成的神经元变性, 而且这种作用可以维持3个月。

表 2　坐骨神经切断后不同时间点各组尼氏染色阳性神经元数目和百分率
Table 2　Number and percentage of Nissl stained neurons after sciatic nerve transaction at different times

Group		1 week	2 weeks	3 weeks	3 months
NT-4	Left	14.1±2.5	12.8±2.6	19.0±4.2	19.7±2.56^.
	Right	15.7±1.9	15.4±3.8	21.0±3.58	23.3±1.53
	Left/right×100%	86.3±4.58	84.4±5.6^#	88.9±6.2^#	83.8±5.1^#
L-6TG	Left	13.6±1.35	13.7±1.35^*	15.3±0.54^*	14.4±1.7
	Right	16.0±2.45	19.8±2.2	22.3±1.49	20.9±2.45
	Left/right×100%	86.0±5.75	65.4±3.03	64.4±4.9	65.8±7.8
Injury	Left	19.7±6.6	14.2±0.64^*	13.9±0.64^*	13.5±1.95
	Right	23.04±5.73	20.6±1.94	19.8±2.94	19.8±1.94
	Left/right×100%	82.5±6.56	64.2±3.5	60.5±0.83	63.9±8.6

^*P<0.05 vs right, ^#P<0.05 vs injury.

2.2　胆碱脂酶染色的结果
　　外周神经损伤后, 部分相关神经元死亡消失, 部分神经元呈现程度不同的逆行性变化。 胆碱脂酶(ChE)系神经细胞胞体中活性变化较明显的酶。 我们用亚铁氰化铜法显示胆碱脂酶, 借以辨认或鉴定神经细胞是否发生病理性改变。 术后2周, 脊髓正常侧前角外侧核ChE氏染色呈深黄色, 坐骨神经切断侧染色变淡, 见图2A、 B、 C (图版Ⅲ); NT-4基因工程细胞移植组损伤侧与正常侧相比差别不多, 见图2D、 E、 F (图版Ⅲ)。

图2　坐骨神经损伤后2周的脊髓腰段损伤组织和NT-4组胆碱脂染色

Fig.2 The ChE staining of lumbospine after sciatic nerve transaction of 2 weeks after
injury amd NT-4groups
A is picture of ChE staining in injury guoup (3.3 ×4); B and C are A's injury (left) and nomal
(right) side (3.3 ×20). D is a picture of ChE staining in NT-4 group (3.3×4); E and F are D's
injury (left)and normal (right)side (3.3×20).

　　坐骨神经切断后, 在每一时间点, 1、 2和3周, NT-4基因工程细胞移植组、 L-6TG细胞移植组、 损伤组的正常侧和离断侧(左右两侧)脊髓前角外侧核ChE染色阳性颗粒面积的百分率, 及各组百分率的t检验, 见表3。 我们可以看出术后1、 2、 3周NT-4组和对照组的百分率有显著性差异(P<0.01,P<0.05), 说明移植NT-4基因工程细胞可以减轻因外周神经损伤造成的神经元ChE活性减弱, 但这种作用早期更为明显。

表　3　坐骨神经离断后各组ChE染色阳性面积的百分率
Table 3　Percentage of the ChE stained areas at different times

Time	NT-4	L-6TG	Injury
1 week	62.6±5.2^**	56.8±5.8	33.5±8.8
2 weeks	79.0±6.0^*	64.6±6.2	60.9±5.6
3 weeks	73.1±3.5	70.7±3.7	63.4±2.3

　^*　P<0.05,^*　*　P<0.01 vs injury.

3　讨论
　　外周神经损伤后, 部分神经元死亡而消失, 部分存活神经元呈现程度不同的逆行性变化, 如胞核偏位、 粗面内质网解聚、 溶酶体增多及一些酶的活性发生变化, 其中以ChE活性变化最为明显, ChE位于粗面内质网中, 它与粗面内质网的结构完整和功能活动密切相关。 神经元损伤后, ChE活性减弱, 提示粗面内质网的数量减少和功能消退。 脊髓L4～L6前角外侧核的ChE酶阳性反应颗粒以神经元中的最明显, 且上述核团大部分神经元的轴突进入到坐骨神经中。 本实验观察的ChE染色阳性面积, 基本能反映坐骨神经损伤后神经元的退变情况。
　　Friedman等的实验发现, 切断成年大鼠坐骨神经后1周, 给予NT-4 12 μg/d, 能够使胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫组化染色显著增加, 达到正常侧的79％; 而给予生理盐水的只有正常侧的38％^[11]。 切断新生大鼠面神经, 6天共给予NT-4 20 μg, 可使面神经核的神经元(Nissl染色)达到正常侧的73％, 而给予生理盐水的只有27％^[12,13]。 本实验切断大鼠坐骨神经后, 观察了3周内ChE组化染色阳性面积的变化情况, 移植NT-4基因工程细胞的动物, 1周可达正常侧的62.6%, 2周可达79％, 3周达到73.1%; 而损伤组1、 2、 3周分别为33、 60.9与63.4％。 因此, 结合损伤组的情况来判断, 治疗作用最明显的不在第2、 3周, 而在第1周, 这和许多研究结果表明的神经损伤后应用神经营养因子时间越早效果越好的结论相符。
　　分析损伤组各时间点的情况, 坐骨神经切断1周ChE染色就达到最低点, 以后有所增加。 统计结果表明, 1周和2、 3周的ChE染色的百分比(左/右)之间有显著性差异(P<0.05), ChE染色逐渐增加, 说明ChE活性有所恢复。 这可能是坐骨神经切断时间延长后, 动物机体产生代偿作用。
　　尼氏小体在光镜下为嗜碱性小块或小颗粒, 不同神经元在一定固定液作用下其所含尼氏体的形态不同, 如脊髓前角的运动神经元, 尼氏小体呈虎斑状。 尼氏小体仅存在于神经元胞体和大树突干内, 它由大量平行排列的粗面内质网和夹杂其间的可被碱性染料染色的核糖核蛋白构成。 粗面内质网和核蛋白体是结构蛋白和分泌蛋白的合成中心。 神经元内如含大量粗面内质网与核糖核蛋白体, 则说明神经元内蛋白合成机能旺盛。 当神经元受到损害时, 如出现轴突断裂、 尼氏小体逐渐分解以至消散, 这种现象称为染色质溶解, 此时神经元的尼氏染色将变淡或消失。
　　本实验发现坐骨神经切断后的第1、 2、 3周, 损伤侧尼氏染色阳性神经元分别为正常侧的82.5％、 64.2％和60.5％。 这一结果表明, 尼氏染色阳性神经元的数目在3周内不断减少, 但减少的速度变慢, 如1、 2周的周递减率为18.3％, 2、 3周时为3.7％。 但神经元并不是一直减少下去, 坐骨神经切断3个月后, 损伤组的损伤侧尼氏染色阳性神经元是正常侧的63.9％, 神经元数目没有继续减少。 说明坐骨神经切断3周后, 神经元就基本稳定, 神经元的死亡不再增多。
　　NT-4基因工程细胞移植组, 在1、 2、 3周损伤侧尼氏染色阳性细胞均为正常侧的80％以上, 相互之间没有显著性差异。 最令人兴奋的是, 3个月时NT-4组损伤侧阳性神经元也在正常侧的80％以上, 而此时损伤组仅为63.9％。 说明NT-4基因工程细胞对神经元有保护作用, 而且作用时间较长。
　　坐骨神经离断后, 在损伤处移植NT-4基因工程细胞, 我们观察了胆碱酯酶组化染色和尼氏染色两项指标, 发现它对脊髓前角外侧核中、 大神经元有明显的保护作用, 而且这种保护作用可持续3个月之久。 这一结果, 对于NT-4治疗作用的研究以及基因治疗方法用于临床是很有意义的。

作者单位：侍　坚　曲　伸　路长林　何小龙　王成海　第二军医大学神经生物学教研室，　上海　200433

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　1997-12-30收稿　　1998-06-08修回