小鼠脑内NO/NOS-cGMP信号系统
与吗啡依赖形成的机制^*

方　芳　曹　清　宋福津^?王艳红　刘景生

摘　要　　本文观察了吗啡依赖小鼠脑组织cGMP含量、 钙依赖性及非钙依赖性NOS活性的变化、 蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)对NOS活性的磷酸化调节以及一氧化氮合酶(NOS)抑制剂对吗啡依赖形成的影响。 结果发现: (1)小脑、 纹状体、 海马及大脑皮质cGMP含量明显下降; (2)纹状体及大脑皮质钙依赖性NOS活性明显升高, 而IP₂₀(PKA抑制剂)可抑制此变化, 小脑及海马钙依赖性NOS活性及以上各脑区非钙依赖性NOS活性无明显变化; (3)纹状体、 大脑皮质中与NOS分子量相当的150 kD蛋白质的体外磷酸化水平低于对照, IP₂₀ 可抑制此变化; (4) NOS抑制剂可抑制小鼠对吗啡依赖的形成; (5)纳洛酮拮抗组小鼠未见上述变化。 结果表明, 吗啡依赖小鼠脑组织普遍存在cGMP水平下降, 纹状体、 大脑皮质钙依赖性NOS活性的增加可能与吗啡依赖有关, 且受PKA对其磷酸化调节。 NOS活性增加与cGMP含量的下降相矛盾, 提示NO/NOS在吗啡依赖中的作用可能是通过一种不同于产生cGMP信号的机制进行的。
关键词: 吗啡; 依赖; 一氧化氮合酶(NOS); cGMP; 磷酸化
学科分类号: Q426

EVIDENCE FOR INVOLVEMENT OF NO/NOS-cGMP
SIGNAL SYSTEM IN MORPHINE DEPENDENC

FANG　FANG，　CAO　QING，　SONG　FU-JIN，
WANG　YAN-HONG，　LIU　JING-SHENG
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical
Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005)

ABSTRACT

　　The present study was undertaken to observe changes in cGMP contents, calcium-dependent and non-calcium-dependent NOS activities in brain regions isolated from morphine-dependent mice as well as the effect of NOS inhibitor(L-NMMA) on the development of this dependence. It was found that (1) cGMP contents in cerebellum, striatum, hippocampus and cerebral cortex were significantly decreased. (2) Calcium-dependent NOS activity was noticeably increased in striatum and cerebral cortex, which was inhibited by PKA inhibitor. No similar changes were found in cerebellum and hippocampus. Changes of non-calcium-dependent NOS activity did not occur in morphine-dependent mice brain. (3) In the striatum and cerebral cortex of morphine-dependent mice, the level of 150 kD protein phosphorylation in vitro was noticeably decreased, which was inhibited by IP₂₀(PKA inhibitor). (4) NOS inhibitor injected(icv) 15 min prior to daily morphine injection could prevent the development of morphine dependence. (5) All the changes above were not observed in mice treated with naloxone 30 min prior to daily morphine injection. Our data suggest that the reduction of cGMP contents and the increase of calcium-dependent NOS activity in striatum and cerebral cortex isolated from morphine-dependent mice may be mediated by opioid receptors and involved in the development of morphine-dependence. Why the increase of NOS activity was in association with the reduction of cGMP contents remains to be answered and it implies that the effect of NO/NOS involved in morphine-dependence may be produced through other mechanisms other than those producing cGMP signal. NOS phosphorylation in some other brain regions, which may be regulated by PKA, probably contributes to the increase of NOS activity in morphine-dependent mice.
Key words: morphine; dependence; cGMP; nitric oxide synthase ; phosphorylation

　　阿片类物质耐受和依赖的生化机制仍不十分清楚。 过去20年研究多集中在阿片受体上, 但尚无一种受体理论能有效地解释阿片类药物耐受和依赖机制, 近年来阿片作用的受体后机制受到重视。 目前普遍认为, 腺苷酸环化酶/环磷酸腺苷/蛋白激酶A(AC/cAMP-PKA)信号系统的上调可能是阿片耐受和依赖的一个重要机制^[1,2]。 影响胞内cAMP水平的因素往往也可引起cGMP的变化。 有研究发现, cGMP的变化也可能与吗啡耐受和依赖有关^[3,4]。 近年由于NMDA受体及NO研究的迅猛发展, 使得cGMP系统的研究领域得以扩展。 NO是一种重要的信使物质, 可与cGMP一起构成细胞信号传导系统, 介导神经递质的释放、 基因转录, 甚至具有神经毒性。 有研究表明, NO/NOS可能与阿片耐受和戒断反应有关^{[5, 6]}, 但对阿片依赖中脑组织NO/NOS的变化还缺乏直接证据, 而且其作用机制以及与cGMP的关系也不清楚。 本文观察了吗啡依赖小鼠一些脑组织中cGMP含量、 钙依赖性和非钙依赖性NOS活性的变化、 PKA对其调节及NOS抑制剂对吗啡依赖形成的影响。

1　材料和方法
1.1　动物　　雄性昆明小鼠, 体重18～22 g, 购自中国医学科学院实验动物研究所。
1.2　主要试剂　　硫酸吗啡（morphine sulfate, Mor, Puninsula公司)。 盐酸纳洛酮(naloxone hydrochloride, Nal)、 还原型尼克酰胺脱氢酶(NADPH)、 四氢生物喋啶(BH₄) 、 左旋呱氨酸(L-Citrulline)、 N^ω-Monomethyl-L-Arginine(L-NMMA)、 钙调素(CaM)、 IP₂₀(protein kinase A inhibitory peptide)、 PKA催化亚单位(Sigma公司)。 Dowex AG 50 w×8(Na⁺型, 100～200 mesh, Fluka公司)。 γ-³²P-ATP(1.85×10¹⁴ Bq/mmol, 北京市亚辉生物医学工程公司)。 ³H-cGMP (8.14×10¹¹ Bq/mmol, 北京原子能研究所)。 L-[2,3-³H]-Arginine (1.36×10¹² Bq/mmol, Dupont-NEN公司)。
1.3　药物处理　　(1)吗啡递增给药组(morphine group): 用我室以往建立的方法^[7], 即以递增剂量皮下注射(sc)吗啡共7 d, 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90 mg/kg, 每日2次, 间隔12 h, 建立吗啡依赖模型。 (2)对照组(control group): 每日sc等量生理盐水。 (3)纳洛酮拮抗组(Na+Mor group): 吗啡给药处理同吗啡递增给药组, 只是在注射吗啡前30 min先sc纳洛酮, 用量为相应吗啡浓度的1/10。 (4) IP₂₀(PKA抑制剂)组(Mor+IP₂₀ group): 用一根自制的聚乙烯管(预先充满2 μl生理盐水)插入脑室, 固定于颅骨及皮下缝合固定。 通过注射1％美兰染料来确定插管是否入脑室。 术后24～36 h, 取活动正常、 反应灵活、 脑室注射(icv)生理盐水无任何异常反应的小鼠用于实验。 吗啡给药处理同吗啡递增给药组, 于每次sc吗啡前15 min通过插管缓慢注入IP₂₀ 2 μg/2 μl。 (5)NOS抑制剂组(Mor+NOS-I): 脑室插管同IP₂₀组, 吗啡处理同吗啡递增给药组, 于每次sc吗啡前15 min通过插管缓慢注入L-NMMA 2 μg/2 μl。
1.4　小鼠戒断症状观察　　第7天末次给药后2 h, sc纳洛酮5 mg/kg, 立即将小鼠放至一个高35 cm、 直径30 cm的圆台上, 观察30 min内小鼠跳跃反应, 同时观察给与纳洛酮后2 h其它一些戒断体征, 以判定小鼠躯体依赖性的产生。
1.5　NOS活性测定　　参照 Bredt^[8]及Mayer^[9]等方法并加以改进。 小鼠末次给药后2 h断头处死取出脑组织, 加入预冷的缓冲液(50 mmol/L HEPES, pH 7.4, 0.32 mol/L 蔗糖, 1 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L PMSF, 1 mmol/L DTT, 1 μmol/L leupeptin, 2 μmol/L pepstatin A, 1% β巯基乙醇)匀浆, 4℃离心(20 000 g, 60 min), 上清液用于NOS测定。 测定时, 反应总体积为100 μl, 含50 mmol/L HEPES, pH 7.4, 0.1 mmol/L NADPH, 30 μmol/L BH₄, 10 nmol/L CaM, 1.25 mmol/L CaCl₂, 1 mmol/L EGTA (测定非钙依赖性NOS活性时以3 mmol/L EGTA取代CaM和CaCl₂), 7.4×10³ Bq ³H-L-Arg及适量测定样品。 于37℃水浴反应15 min后加入2 ml预冷的缓冲液(20 mmol/L HEPES, pH 5.5, 0.2 mmol/L EGTA, 2 mmol/L EDTA, 1 mmol/L L-citrulline)终止反应。 反应液经0.7～1 ml Dowe×50 w×8(Na⁺型)阳离子交换树脂层析柱, 收集2 ml流出液和2 ml蒸馏水洗脱液, 取1 ml加入甲苯-Triton X-100 (2∶1, v/v)闪烁液7 ml, 测定放射性强度, 结合蛋白质浓度计算出NOS活性, 以每分钟每毫克蛋白质生成的 ³H-L-citrulline的pmol数表示, 即pmol/(min^.mg protein)。
1.6　cGMP含量测定　　在脑组织中加入预冷的10%三氯醋酸匀浆, 于4℃ 3?000 r/min离心10 min, 上清液用4倍体积的水饱和乙醚洗提4次, 水相在60℃水浴上吹干。 测定时吹干的样品溶于适量的50 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 6.2)。 采用放射免疫分析法测定cGMP。
1.7　脑组织蛋白的反磷酸化测定(back-phosphorylation assay)　　依参考文献^[10,11]并加以改良。 利用反磷酸化测定技术了解脱磷酸化底物含量的高低, 推算体内底物蛋白/酶的磷酸化程度, 即: 离体测定组织中所需要掺入的³²P量越少（SDS-PAGE放射自显影条带越浅）, 说明体内磷酸化状态的相应底物越多, 反之则越少。 反应体积50 μl, 含20 mmol/L Tris(pH 7.5), 5 mmol/L MgCl₂, 100 μmol/L EGTA, 2 μmol/L cAMP, 100 μmol/L ATP, 10^-4 U PKA 催化亚单位, γ-³²P-ATP 7.4×10⁴ Bq, 于25℃加入适量样品(样品制备同活性测定)反应5 min后置于冰浴, 加入2×SDS加样缓冲液50 μl, 于沸水中加热5 min后进行SDS-PAGE分析(积层胶5%, 分离胶8%)。 电泳结束后于凝胶干燥机上干胶。 将干燥过的凝胶置于暗盒, 压上X光片, 于－70℃曝光2～3 d。 结果用光密度扫描仪分析显影条带。
1.8　数据处理　　数据用Pharmacologic Calculation System 4.1版软件进行计算统计学处理, 结果以±s表示, 采用单因素方差分析, 组间差异用双侧t检验比较, 差异显著性以P<0.05和P<0.01表示。

2　结果
2.1　吗啡依赖小鼠脑组织cGMP含量变化
　　末次吗啡给药后2 h, 断头取脑组织测定小脑、 纹状体、 海马、 大脑皮质等脑区的cGMP含量。 结果显示, 吗啡依赖小鼠的小脑、 纹状体、 海马、 大脑皮质等脑组织cGMP含量均明显低于对照组小鼠(P<0.01), 分别下降了50%、 45%、 54%、 58%(图1)。 纳洛酮拮抗组cGMP含量未见明显变化。

图　1　　吗啡依赖小鼠脑组织cGMP含量变化

Fig.1　Concentration of cGMP in the brain regions from morphine-dependent mice
Data are peresented as ±s (n=5). ^*　P<0.05, ^**　P<0.01 as compared with control group.s

2.2　吗啡依赖小鼠脑组织NOS活性的变化及PKA对其调节
　　吗啡依赖小鼠纹状体、 大脑皮质的钙依赖性NOS活性分别高于对照组60%(P<0.01)、 50%(P<0.01), 而小脑及海马的钙依赖性NOS活性变化不大(P>0.05)。 icv IP₂₀的小鼠钙依赖性NOS活性明显低于吗啡依赖小鼠（图2）。 吗啡依赖小鼠各脑区中非钙依赖性NOS活性未见明显变化(P>0.05)(图3)。 纳洛酮拮抗组未出现上述变化。

图　2　　吗啡依赖小鼠脑组织钙依赖性NOS活性的变化

Fig.2　Ca²⁺-dependent NOS activity of cytosol fractions in the brain regions from morphine-dependent mice
Data are presented as ±s. n=5. ^*　P<0.05, ^**　P<0.01 as compared with control. ^#　P<0.05, ^##　P<0.01 as compared with morphine group.

图　3　　吗啡依赖小鼠脑组织非钙依赖性NOS活性的变化

Fig.3　Non-Ca²⁺-dependent NOS ac-tivity of cytosol fractions in the brain regions from morphine-dependent mice Data are presented as±s. n=5.

2.3　PKA对吗啡依赖小鼠脑组织150 kD蛋白的磷酸化调节
　　吗啡依赖小鼠纹状体、 大脑皮质中150 kD大小的蛋白质其体外磷酸化水平明显低于对照, 说明该蛋白的体内磷酸水平升高。 icv IP₂₀的小鼠脑组织中该分子量蛋白的体外磷酸化水平明显高于吗啡依赖小鼠。 表明IP₂₀可抑制吗啡依赖时该蛋白的体内磷酸化（图4）。

图　4　PKA对吗啡依赖小鼠脑组织150 kD蛋白的磷酸化调节

Fig.4　Phosporylation of 150 kD protein in brain from morphine-dependent mice regulated by PKA in vitro
A. Lane 1, control striatum; lane 2, Mor striatum; lane 3, Mor+IP₂₀ striatum; Lane 4. control cerebral cortex; lane 5, Mor cerebral cortex; lane 6, Mor+IP₂₀ cerebral cortex; lane 7, protein molecular weight standards. B. The band corresponding to 150 kD was analyzed by scanning densitometry. Results from three separate experiments are presented as ±s. ^*　P<0.05, ^**　P<0.01 as compared with control group. ^#　P<0.05 as compared with morphine group.

2.4　NOS抑制剂对小鼠形成吗啡依赖过程的影响
　　每日sc吗啡前15 min, icv NOS抑制剂, 末次给吗啡后sc纳洛酮, 发现小鼠跳跃反应发生率明显低于单独吗啡递增给药组(表1), 而且未见有其他戒断症状出现。

表 1　NOS抑制剂对小鼠吗啡依赖形成的影响

Table 1　Effect of NOS inhibitor (NOS-I) on the development of morphine dependence in mice

Treatment	Average number of jumps per mouse
Control group	0
Morphine group	7.88±1.20^**
Mor+NOS-I group	0.50±0.27^△^△

±s, n=8. ^**　P<0.01 vs control group. ^△　△ 　P<0.01 vs morphine group.

3　讨论
　　cGMP是一重要胞内信使物质, 参与调节多种细胞功能, 如Ca²⁺内流、 递质的释放及摄取, 细胞膜的超极化或去极化等。 有研究发现, 吗啡耐受和依赖大鼠纹状体中cGMP水平下降^[3]时, 脑室内注射二丁酰cGMP能抑制大鼠的一些戒断症状^[4], 提示cGMP的变化可能与吗啡耐受和依赖有关。 本研究发现, 吗啡依赖小鼠的小脑、 纹状体、 海马及大脑皮质等脑组织中cGMP水平显著降低, 表明在吗啡依赖时脑组织中可能普遍存在cGMP水平的下调。 而cGMP水平的降低一方面可通过调节cGMP依赖的蛋白激酶而影响特异蛋白的磷酸化, 从而影响细胞功能; 另一方面由于cGMP能通过刺激水解cAMP的磷酸二酯酶(PDE)活性而直接调节cAMP的水平。 因此我们推测, 吗啡依赖时cGMP水平的降低可能导致对水解cAMP的PDE作用减弱, 从而使cAMP水平升高, 这可能是吗啡依赖时AC/cAMP系统上调的一个重要原因。
　　有报道^[5,6], NOS抑制剂可抑制大鼠对吗啡镇痛作用的耐受, 并减少一些戒断症状的产生。 表明NO/NOS可能与阿片耐受和戒断反应有关。 但上述研究中, NOS抑制剂是通过腹腔注射的, 故无法区分是中枢还是外周NO在抑制吗啡耐受及戒断中起作用。 另外, 尚不清楚阿片依赖时中枢NOS活性的确切变化及其所受的调节。 我们研究发现, 吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质中钙依赖性NOS活性明显升高, 而在这些脑区及小脑和海马中非钙依赖性NOS活性无明显变化, 表明纹状体、 大脑皮质的钙依赖性NOS活性的升高可能与吗啡依赖有关。 我们在每天注射吗啡前15 min给小鼠注射(icv)NOS抑制剂L-NMMA, 发现小鼠未产生对吗啡的依赖, 这进一步表明中枢一些脑区NOS活性的升高可能参与了吗啡依赖的形成。 但NOS活性升高的原因并不清楚。 由于阿片依赖时神经元存在AC/cAMP信号系统的上调^[1,2], 而NOS分子也存在PKA的磷酸化位点^[12], 所以我们用IP₂₀(PKA的选择性肽抑制剂^[13])进一步研究了PKA对NOS活性的调节。 结果发现, IP₂₀可抑制吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质中钙依赖性NOS活性的升高, 并能抑制与NOS分子量相当的150 kD蛋白质的体外磷酸化水平的降低。 提示在吗啡依赖脑组织中NOS活性的升高有可能与PKA对其磷酸化调节有关。 但NOS活性的升高也可能通过另一途径产生。
　　问题是, 既然吗啡依赖时纹状体及大脑皮质中钙依赖性NOS活性增高, 而已知NOS作用下产生的NO又可激活邻近突触前膜及突触后膜部位的可溶性鸟苷酸环化酶, 刺激cGMP的产生, 那么吗啡依赖时相应脑组织cGMP水平应是增加的。 但本研究结果却并非如此。 我们推测, NO/NOS对吗啡依赖的作用可能是通过一种不同于产生cGMP的信号机制进行的, 但需进一步研究证实。 总之, 深入了解NO与cGMP在阿片类药物作用中的各种内在关系, 将有助于进一步阐明阿片镇痛以及产生耐受依赖、 戒断的生化机制, 为阿片耐受和依赖的防治开辟新的道路。

^*国家自然科学基金资助项目 (No.39770852和39470803)　
^*This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.3977028 and 39470803)

作者单位：方　芳　曹　清　宋福津^?王艳红　刘景生　中国医学科学院、 中国协和医科大学基础医学研究所药理室, 北京协和医院病理科, 北京　100005

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　　1998-01-25收稿　　1998-04-17修回