皮质醇对离体牛蛙交感神经节B细胞
胆碱能突触传递的快速作用^*

易必达^**?马　蓓　邢宝仁

摘　要　　在离体灌流的牛蛙交感神经节标本上, 电刺激节前纤维, 细胞内记录B细胞的电活动, 观察给予皮质醇对B细胞突触传递的快速作用。 主要结果有: (1)电刺激节前纤维, 细胞内记录170个B细胞的动作电位, 给予皮质醇后0.5～3 min内, 52个B细胞的突触传递发生脱漏甚至完全阻断, 有明显的量效关系。 甾体激素胞内受体阻断剂RU38486可部分阻断这种作用。 (2)蛋白合成抑制剂放线菌酮不能阻断皮质醇的快速阻断作用。 (3)阿托品阻断M受体后, 皮质醇对B细胞突触传递的快速阻断作用增强。 上述结果提示, 皮质醇通过非基因组机制对牛蛙交感神经节B细胞的突触传递产生快速阻断作用。
关键词: 皮质醇; 牛蛙交感神经节; 快速作用; 突触传递
学科分类号: R338.8; Q577

RAPID EFFECTS OF HYDROCORTISONE ON
THE CHOLINERGIC SYNAPTIC TRANSMISSION OF B
NEURONS IN BULLFROG SYMPATHETIC GANGLIA^?

YI　BI-DA^*　*，　MA　BEI，　XING　BAO-REN
(Department of Physiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
^*　?Department of Physiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004)

ABSTRACT

　Rapid effects of hydrocortisone 21-hemisuccinate (F-suc) on cholinergic synaptic transmission of B neurons in bullfrog sympathetic ganglia (BFSG) were studied with intracellular recording technique in vitro. The main results are as follows: (1)F-suc blocked cholinergic synaptic transmission of 52 B neurons within 0.5～3 min, which was concentration-dependent and partially suppressed by the cytoplasm receptor antagonist of steroid hormones, RU38486; (2)　after protein synthesis was suppressed by actidione, the above effect persisted; and (3)the effect of F-suc could be potentiated by atropine. All these results suggest that the F-suc induced rapid effects of cholinergic synaptic transmission of B neurons in BFSG may be mediated by non-genomic mechanisms.
Key words: hydrocortisone 21-hemisuccinate; bullfrog sympathetic ganglia; rapid effect; synaptic transmission

　　传统观点认为, 甾体激素与细胞内高亲和力特异受体相结合, 通过基因组机制, 对机体组织的生长、发育、分化和功能活动具有广泛的作用, 其特点是缓慢而持久。 近20年来, 大量实验证据表明, 甾体激素还能通过非基因组机制来调节机体组织细胞的功能活动。 如糖皮质激素对递质受体的调制作用等, 其潜伏期短, 在数秒到数分钟即发生效应, 作用时间短, 撤除激素后作用迅速消失^[1～5]。 我们过去的实验证明, 糖皮质激素对谷氨酸和GABA受体的电生理反应有调制作用^[6], 提示甾体激素可能对突触传递过程有作用。 但这些实验是用递质灌流神经节标本, 作用范围广, 与正常的突触传递有很大区别。 为了探讨糖皮质激素对突触传递的快速作用和生理意义, 我们选择牛蛙第Ⅹ椎旁神经节为标本, 胞内记录B细胞的动作电位, 充分利用B细胞只接受单根B纤维支配的特点, 观察皮质醇对B细胞突触传递的影响。

1　材料和方法
1.1　标本制备和给药方法　　市售牛蛙(Kana catesbeiana), 雌雄均有, 体重200～250 g, 用探针破坏大脑和脊髓后, 打开腹腔, 移除内脏, 在解剖显微镜下取出两侧椎旁交感神经链, 仔细去掉所附结缔组织和脂肪组织, 置于Ringer′s液中2 h, 待生理特性稳定后使用。
　　标本置于灌流小室中(容量约0.5 ml), 用细金属小针把第Ⅹ交感神经节固定于室底的橡胶垫上, 第Ⅵ和第Ⅶ之间的神经干置于附近的双极刺激电极上。 Ringer′s 液采用重力恒压灌流, 灌流速度为0.8～1.2 ml/min, 用串联三通开关选择灌流药物。
1.2　记录方法　　细胞内记录使用玻璃微电极, 内充3 mol/L KCl, 尖端电阻30～60 MΩ, 经Ag/AgCl电极与Axoclamp-2A微电极放大器探头相连(Axon Instruments Inc., Foster City, USA)。 微电极经微操纵器(SM-21, Nippon Pulse Motor Co., Japan) 步进推进。 微电极放大器采用桥平衡方式, 经微电极向细胞内注入电流(0.8 nA, 30 ms), 细胞膜电位变化经微电极放大器放大后在示波器上显示。 在微电极尖端进入细胞内以后, 向细胞内注射阶跃电流(－0.3～0.2 nA, 50 ms), 膜电位变化经高输入阻抗直流放大器放大10倍后, 由计算机用Scan-Synaptic Current Analysis Program (V4.2d, USA) 采样、 存贮, 计算神经元的电特性。 部分神经元由电刺激器(SDQ－4型三道电子刺激器, 蚌埠市技术研究所)经刺激隔离输出恒压方波(1～8 V, 0.2 ms, 0.33 Hz)到第Ⅵ第Ⅶ交感神经节之间的神经干, 达到阈刺激后, 即可在所记录的突触后B细胞上产生动作电位, 用笔式记录仪(LMS-2B型二道生理记录仪, 成都仪器厂)细胞内连续记录B细胞动作电位。
1.3　药品　　皮质醇 (Sigma 公司) 用Ringer′s液配成0.01、　0.1和1 μmol/L。 RU38486, 法国Russel Uclaf公司惠赠, 用Ringer′s液配成10 μmol/L 备用。 放线菌酮 (actidione, Fluka公司), 用Ringer′s液配成100 μmol/L 备用。 阿托品 (Sigma公司) 用Ringer′s液配成1 μmol/L 备用。 Ringer′s液成分(mmol/L): NaCl 115, KCl 2.0, CaCl₂ 2.0, NaHCO₂ 2.4, 葡萄糖 5.0。

2　结果
　　B细胞的静息电位－52.8±10.1 mV (n=40), 输入阻抗33.1±25.3 MΩ, 动作电位70±12.3 mV, 超射值20.9±10.1 mV。 皮质醇对上述电特性无显著影响。
2.1　皮质醇对B细胞突触传递的快速作用
　　单个方波刺激节前神经纤维, 可引起突触后B细胞产生一次动作电位, 每刺激一次,在二道记录仪上可记录到一个动作电位, 刺激与反应一一对应^[7]。 灌流1 μmol/L F-suc 0.5～3 min, 在突触前刺激不变的条件下, 突触后52/170个B细胞的动作电位出现脱漏, 突触传递受到影响。 图1a,b是其中一例。 4/170个B细胞动作电位个数表现出增加, 即一次突触前神经干上的单个刺激, 在突触后B细胞产生的一次动作电位的后超极化复极化时, 偶然又产生一次动作电位(图1c、f)。 在二道记录仪记录(图1c)中两次动作电位重叠在一起, 表现为幅度增大; 在计算机记录(图1f)中两个动作电位分开。

图　1　皮质醇对B 细胞突触传递的快速作用

Fig. 1　Rapid effect of F-suc on synaptic transmission of B neurons

Weak (a) and strong (b) blockage of synaptic transmission of B neurons by F-suc (1 μmol/L). F-suc potentiated synaptic transmission (c, f). AP of B neuron was induced by stimulating presynaptic fiber (d). After synaptic transmission was blocked by F-suc, stimulating presynaptic fiber only induced EPSP without AP (e). a, b, c. Recorded by a two-channel, pen-writing recorder. d, e, f. Recorded by a computer. d=a′, e=b′,f=c′.

2.2　皮质醇对B细胞突触传递快速作用有量效关系
　　分别用0.01、 0.1 和1 μmol/L皮质醇灌流神经节, 观察不同浓度皮质醇对B细胞突触传递的快速作用。 皮质醇浓度越大, 其阻断作用越强。 表现为出现阻断的B细胞比例增加, 阻断发生的潜伏期短, 阻断的持续时间延长 (表1, 图2)。
　　使用行χ列表的χ²检验,χ²＝16.25>13.28, P<0.01。提示不同浓度皮质醇对B细胞的作用有非常显著差异,即皮质醇对B细胞突触传递的抑制作用有明显的剂量依赖关系。

图　2　　不同浓度皮质醇对B 细胞突触传递的快速作用

Fig.2　Block effect of F-suc on synaptictransmission of B neurons at different concentrations a, b and c were recorded from thesame B neuron.

表 1　不同浓度皮质醇对B细胞突触传递的快速作用

Table 1　Rapid effects of F-suc at different concentrations on synaptic transmission of B neurons

Concentration /μmol^．L^－1	n	Block	Potentiation	No change
0.01	40	9	1	30
0.1	37	10	3	24
1	137	45	3	89

　

2.3　RU38486对皮质醇快速作用的影响
　　在给予1 μmol/L皮质醇后发生突触传递阻断的12个B细胞中, 经灌流冲洗, 在突触传递恢复后, 给予10 μmol/L RU38486 3 min, 再给予皮质醇。 其中6个B细胞的阻断效应消失, 皮质醇不再引起突触传递的阻断; 另外6个B细胞不受影响, 仍表现阻断效应(图3)。

图　3　RU38486 对皮质醇快速作用的影响

Fig. 3　Effects of RU38486 on rapid effect of F-suc

The rapid effect of F-suc was prevented by the presence of RU38486 in the neuron (a), while RU38486 had no effect in the neuron (b).

2.4　放线菌酮不能阻断皮质醇的快速作用
　　预先用含有100 μmol/L 放线菌酮的Ringer′s 液孵育牛蛙交感神经节30 min以上, 观察灌流1 μmol/L 皮质醇对B细胞突触传递的影响。 实验在34个B细胞上进行, 其中15/34出现突触传递的阻断效应, 19/34无变化。 与未经放线菌酮处理的B细胞相比较, 两者无显著差异(χ²＝1.05<3.84, P>0.05), 提示放线菌酮对皮质醇快速阻断B细胞突触传递过程无影响。
2.5　阿托品对皮质醇快速作用的影响
　　灌流1 μmol/L皮质醇, 不管B细胞的突触传递有无变化, 经用Ringer′s 液充分灌洗后, 用1 μmol/L阿托品灌流1～2 min, 再用含有1 μmol/L阿托品的1 μmol/L皮质醇灌流3 min, 记录B细胞突触传递的变化。 结果见表2。

表 2　阿托品对皮质醇快速作用的影响

Table 2　Effects of atropine on rapid effects of F-suc on synaptic transmission of B neurons

	n	Block	Potentiation	No change
F-suc	95	29	3	63
Atropine+F-suc	95	40	0	55

　　从表2中可看到, 使用阿托品后, 原来表现阻断的29个B细胞仍表现阻断作用, 而表现增强的3个B细胞不再表现增强, 无变化的63个B细胞中有11个出现阻断效应。 经统计学处理发现, 阿托品处理前后, 皮质醇对B细胞的阻断作用有极显著差异(χ²＝19.01, P<0.001)。 提示阿托品阻断M受体后, 可以加强皮质醇对B细胞突触传递的阻断作用。
3　讨论
　　牛蛙离体交感神经节标本, 在用Ringer′s液灌流时, 可长时间成活并保持兴奋特性。 B细胞的突触结构和神经递质相对较单纯, 支配第Ⅹ交感神经节中B细胞的节前纤维从第Ⅳ、第Ⅴ和第Ⅵ脊神经进入交感链。 刺激交感神经链第Ⅵ和第Ⅶ神经节之间的神经干, 可引起B细胞的动作电位^[8] 。 一般每一个B细胞只接受一条节前纤维的支配, 神经递质为乙酰胆碱, 与B细胞突触后膜上的烟碱型受体相结合, 引发兴奋性突触后电位(EPSP), EPSP总能达到阈值, 在B细胞引起动作电位^[9]; 同时乙酰胆碱还作用于B细胞突触后膜上的毒蕈碱受体,引发一个慢兴奋性突触后电位(s-EPSP),此电位可能与B细胞的兴奋性有关^[10]。 因此, 椎旁神经节是研究甾体激素对神经元突触传递过程快速作用较理想的标本材料。
　　皮质醇对牛蛙交感神经节B细胞突触传递的快速作用, 是通过非基因组机制实现的，　其作用潜伏期短, 一般在灌流给予0.5～3 min 内即发生, 使用Ringer′s 液灌流后作用迅速消失, 细胞内蛋白合成抑制剂放线菌酮不能阻断这种作用, 这些是不能用基因机制解释的。 皮质醇对B细胞突触传递的这种阻断作用, 与所灌流皮质醇的浓度有关, 随着给予皮质醇浓度的增加, 发生阻断作用的B细胞比例增加, 发生阻断的潜伏期变短, 阻断持续时间延长, 阻断程度加大。 在同一细胞上, 对低浓度皮质醇表现阻断的B细胞, 对高浓度皮质醇也表现出阻断; 但有些对低浓度皮质醇不表现阻断的B细胞, 可对较高浓度皮质醇表现出阻断效应。 糖皮质激素的胞内受体阻断剂RU38486可部分阻断这种作用。 以上结果提示, 皮质醇对B细胞突触传递的快速作用可能是通过B细胞膜上的特异受体介导的。
　　皮质醇通过什么环节影响牛蛙交感神经节B细胞的突触传递过程, 是关系到皮质醇对神经系统作用的最基本问题。　我们实验室前一段的工作发现, 糖皮质激素可以快速压抑B细胞的f-EPSP^[11], 又可增加B细胞的s-EPSP的幅度, 提高B细胞的兴奋性^[12], 两者均有明显的量效关系。 因此皮质醇对B细胞突触传递的影响, 可能是作用在突触后而不是突触前, 是对f-EPSP的抑制和对s-EPSP的增强综合作用的结果。 实验中使用阿托品阻断B细胞上的M受体, 使s-EPSP变小, B细胞的兴奋性降低。 因此, 原来单独给予皮醇质不出现突触传递抑制的B细胞(63/95)中, 经阿托品处理后, 再给予皮质醇时又有11个出现突触传递的阻断。 这也支持皮质醇的作用是在突触后。
　　已有的资料表明, 皮质醇对神经系统的快速作用具有复杂多样特性^[13], 主要是改变神经元的活动和突触传递的过程。 在我们的实验中, 给予皮质醇对B细胞突触传递以阻断效应为主。 提示在应激状态下, 体内糖皮质激素浓度升高, 通过对交感神经节中B细胞突触传递过程的阻断, 参与神经节局部的负反馈调节。

^*本工作得到军队九．五医药卫生基金资助(No. 96Z035)
^*Supported by the Medicine Funds 1995′s of the Army (No.962035)

作者单位：易必达^?马　蓓　邢宝仁　第二军医大学生理教研室, 上海 200433；
**贵阳医学院生理教研室, 贵阳 550004

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1998-03-09收稿　　1998-05-14修回