培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞产生
巨噬细胞集落刺激因子及其受体的表达^*

朱鼎良　GOGUSEV J^*　*　MARCHE P^*　*　*

摘　要　　本研究采用培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs), 结果如下: (1)用生物活性检测法发现VSMCs无血清条件培养液可刺激巨噬细胞集落形成, 其作用能被抗巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)抗体抑制; (2)用免疫细胞化学技术证明VSMCs存在MCSF受体; (3)用Northern blot技术证明VSMCs有MCSF及其受体的mRNA表达, 血清刺激使两者表达明显增强。 本研究首次报道了培养大鼠主动脉VSMCs能合成并分泌具有生物活性的MCSF, 而且该细胞存在MCSF受体。 上述结果提示, MCSF可能以自分泌或旁分泌方式调节VSMCs功能, 为研究MCSF对于VSMCs的增殖作用及其机制提供合适的细胞模型。
关键词: 血管平滑肌细胞; 巨噬细胞集落刺激因子; 巨噬细胞集落刺激因子受体
学科分类号: Q28; Q463

MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR
PRODUCTION AND c-fms EXPRESSION IN CULTURED
RAT AORTIC VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS^*

ZHU　DING-LIANG，　GOGUSEV　JEAN^**,　MARCHE　PIERRE^***
(Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital,
Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025,
^*　*INSERM U90, Paris 75015, France, ^*　*　*CNRS URA 1482, Paris 75015, France)

ABSTRACT

The resulats of this study are as follows. (1) As measured by a bioassay, a macrophage colony-stimulating activity was detected in the serum-free conditioned medium of rat aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs), which could be subdued by the addition of specific anti macrophage colony-stimulating factor (MCSF) antibody. (2) The presence of MCSF receptor was confirmed by immunocytochemistry using a specific anti c-Fms antibody. (3) The presence of mRNAs for MCSF and c-fms (which encoded MCSF receptor) was determined by Northern blot analysis. Their expressions were detectable in quiescent VSMCs and markedly increased after addition of serum. These data demonstrated for the first time the production of MCSF and the presence of MCSF receptor in cultured rat VSMCs. It is suggested that MCSF might modulate VSMCs functions via both autocrine and paracrine mechanisms. Rat VSMCs appear to be a suitable cell model for studying the cell proliferation effect of MCSF.
Key words: vascular smooth muscle cell; macrophage colony-stimulating factor; macrophage colony-stimulating factor receptor

　　血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖是动脉粥样硬化、 血管再狭窄和高血压等常见血管病变的共同细胞病理机制, 有关VSMCs增殖机制的研究已引起广泛重视^[1,2]。 现已明确, 血管细胞, 如内皮细胞、 VSMCs以及浸润于血管壁内的巨噬细胞和淋巴细胞, 能产生多种生长因子及细胞因子。 在上述组织局部衍生因子的共同作用下, 血管细胞增殖、 迁移、 细胞外间质代谢改变, 最终导致血管壁病变^[1]。 在众多的细胞因子中, 巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, MCSF, 或CSF-1) 最初被认为具有调节单核/巨噬细胞增殖、 分化等功能^[3]。 最近一些研究表明, 从人、 兔动脉粥样硬化病变处分离得到的VSMCs, 有MCSF基因表达^[4], 并有其受体存在^[5], 提示MCSF可能在动脉粥样硬化血管损伤机制中起重要作用。
　　高血压与动脉粥样硬化有共同发病机制, 最近有人提出MCSF参与是其中一个重要共同环节^[6]。 有报道提示, MCSF可能与自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)心肌肥厚有关^[7]。 本研究发现, 培养大鼠主动脉VSMCs能合成并分泌MCSF, 而且该细胞存在MCSF受体, 这为进一步研究MCSF对VSMCs的增殖作用及其机制提供了一个合适的细胞模型。

1　材料和方法
1.1　材料　　细胞培养液和胎牛血清(FCS)购自Gibco公司, 培养器皿购自Costar公司, 人重组MCSF和抗MCSF多克隆抗体购自Genzyme公司, 抗c-Fms多克隆抗体购自Santa-Cruz公司, 其它试剂购自Sigma公司。 L6α1成肌细胞株由法国国家科研中心(CNRS) 的Leibovitch教授惠赠。
1.2　细胞培养　　取10周龄Wistar Kyoto (WKY) 大鼠胸主动脉, 去除血管内膜和外膜后, 将中膜剪成1 mm²大小的组织块, 贴片于培养皿底部, 用含15%　FCS的DMEM培养液培养细胞。 细胞生长融合后, 用0.125%胰蛋白酶消化传代。 细胞在光镜下呈典型的峰-谷状表现, 电镜下显示胞浆内含有大量肌原纤维, 免疫细胞化学染色检查抗α-actin、 抗myosin抗体阳性染色。 实验采用第4～8代培养细胞。
1.3　VSMCs条件培养液　　VSMCs 在用含10% FCS的DMEM液中培养3～4 d后, 弃去培养液, 用无血清培养液洗2次, 以去除可能粘附在细胞表面上的血清, 然后用DMEM培养液继续培养2 d, 收集上清液, 离心、 过滤后备用。
1.4　MCSF生物活性检测　　按文献报道方法^[8], 根据骨髓细胞液中巨噬细胞在琼脂培养基中受待测物刺激后形成的巨噬细胞集落数目来计算刺激活性。 巨噬细胞取自成年C57小鼠骨髓, 单核/巨噬细胞集落与粒细胞集落在培养7 d后分别用α-naphthyl acetate 酯酶和chloroacetate酯酶染色加以区别并计数。
1.5　受体免疫细胞化学检测　　VSMCs培养在Lab-Tek载片(Nunc公司)上, 3 d后先用PBS洗细胞, 然后用冷甲醇/丙酮固定细胞, 在与抗c-Fms抗体孵育后, 免疫活性用过氧化物酶-抗过氧化物酶系统显色。 用兔非免疫IgG代替一抗作非特异性对照。
1.6　Northern blot测定mRNA表达　　用异硫氰酸胍法抽提细胞总RNA。 取10μg总RNA走1%琼脂糖/2.2 mol/L甲醛凝胶电泳, 将RNA转移到Hybond C 硝酸纤维膜。 对固定于膜上的RNA用含50%甲酰胺、 2×SSC、 5×Denhardt试剂、 0.1%　SDS及200 μg/ml鲑鱼精DNA的缓冲液，　在42℃进行6 h的预杂交。 在上述预杂交液中加入[³²P]标记的cDNA探针(2×10⁶ c.p.m./ml), 在42℃下继续温育16～24 h。 55℃用0.1×SSC溶液洗膜, 然后用Hyperfilm-MP (Amersham)进行放射自显影。
　　MCSF (1.4 kb), v-frms (1.3 kb)和β-actin (2.2 kb) c DNA探针由 Leibovitch教授惠赠。 采用Amersham公司的Multiprime DNA Labelling System, 用[α-³²P] dCTP标记探针。

2　结果
2.1　MCSF生物活性检测
　　DMEM培养液无论是否含血清(10%　FCS)对巨噬细胞集落形成均无刺激作用。 作为阳性对照, 人重组MCSF(500 U/ml)可强烈刺激单核/巨噬细胞集落形成, 而其刺激粒细胞集落形成的作用很弱。 VSMCs无血清条件培养液(用DMEM培养液作1∶4稀释)对于单核/巨噬细胞集落形成有明显的刺激作用, 后者可被抗MCSF抗体(1 μg/ml)特异抑制 (见表1)。

表 1　VSMCs无血清条件培养液刺激巨噬细胞集落形成

Table 1　Macrophage colony formation stimulated by MCSF and VSMCs serum-free conditioned medium

	Murine colonies
	Monocyte/macrophage	Granulocyte
DMEM	ND	ND
DMEM+10% FCS	1±1	1±1
DMEM+MCSF	205±12	5±1
VSMCs sup.	21±6	8±1
VSMCs sup+anti MCSF	7±2	ND

Colony formation of murine bone marrow cells was measured in the presence of human recombinant MCSF (500 U/ml) and VSMCs serum-free supernatant (VSMCs sup, 1∶4 dilution). Anti MCSF antibody: 1 μg/ml. ND: not detectable. Values are ±s of three separate colony forming assays.
2.2　MCSF mRNA 表达
　　用Northern blot技术测定MCSF的 mRNA表达, 以静止的VSMCs(即用无血清DMEM培养细胞48 h后)作为基础对照(control)。 已知L6α1大鼠成肌细胞能合成MCSF, 在用血清刺激后1 h的测定结果作为阳性对照。 结果见图1, 在静止的培养大鼠VSMCs, MCSF mRNA的基础表达水平很低。 细胞受到10% FCS刺激后, MCSF mRNA表达在1 h达到最高值, 以后其表达虽有所降低, 但在刺激后24 h仍高于基础水平。 而β-actin 基因表达在本实验各种不同条件下都保持不变。
2.3　c-fms mRNA表达
　　用Northern blot技术测定c-fms mRNA表达的结果见图1, VSMCs及L6α1大鼠成肌细胞在用血清刺激后, 都有c-fms mRNA表达, 且均高于基础对照水平。

图　1　　VSMCs和L6α1细胞MCSF, c-fms 及β-actin基因表达

Fig.1　MCSF, c-fms and β-actin gene expression in VSMCs and L6α1 cells
Following the stimulation of cells by 10% fetal calf serum (FCS), the kinetics of expression of MCSF, c-fms and β-actin genes were evaluated by Northern blot analysis. Results are the representative of three experiments.

2.4　MCSF受体的免疫细胞化学检测
　　用抗c-Fms抗体对VSMCs进行免疫细胞化学检测。 清晰显示VSMCs呈阳性染色(图2上半部)。 而用兔非免疫IgG做对照, 得到完全阴性的结果(图2下半部)。

图　2　免疫细胞化学技术检测MCSF受体

Fig.2　Immunocytochemical detection of MCSF receptor expression
MCSF receptor, the protein encoded by c-fms, was detected by immunocytochemistry in VSMCs using rabbit polyclonal anti-Fms antibody (upper panel). Negative staining obtained using non-immune serum is shown for comparison (low panel). The photograph (representative of two experiments) is shown 　at a magnification of ×180 (upper panel) and ×270 (lower panel).

3　讨论
　　MCSF是一种糖蛋白, 它在体内的主要生理功能为调节单核/巨噬细胞的增殖、 分化、 生存及生成。 此外, 它还调节胎盘功能、 促进骨吸收。 已知多种细胞能合成MCSF, 如成纤维细胞、 内皮细胞、 激活的单核细胞、 成肌细胞、 鼠L929细胞等^[3]。 MCSF受体是由原癌基因c-fms编码的一种酪氨酸激酶型受体, 它不仅存在于单核/巨噬细胞, 也见于某些其它类型的细胞^[3]。 VSMCs能否产生MCSF, 是否有其受体存在, 结果报道不一。 最近有人报道, 在兔和人的动脉粥样硬化病变处分离到的VSMCs中, 检测到MCSF mRNA及其蛋白^{[4, 9]}, 在兔动脉粥样硬化病变处分离到的VSMCs中发现有MCSF受体^[5]。 但在正常人、 兔VSMCs未能证明有MCSF存在^[9], 在正常人主动脉培养VSMCs也未能证明有MCSF受体^[4]。
　　本研究采用Northern blot技术证实, 培养大鼠主动脉VSMCs有MCSF基因表达。 本文结果还显示: 培养大鼠主动脉VSMCs 的条件培养液具有刺激单核/巨噬细胞集落形成作用, 而且这一作用能被抗MCSF抗体所抑制。 上述结果提示: (1)VSMCs 条件培养液的作用确系MCSF所为, 培养大鼠主动脉VSMCs能合成并分泌MCSF; (2)VSMCs产生的MCSF具有其生物活性, 即能刺激单核/巨噬细胞集落形成。
　　本文还发现, 培养大鼠主动脉VSMCs有c-fms mRNA表达, 用抗c-Fms (c-fms编码蛋白) 抗体进行细胞免疫化学检测, 在蛋白水平上进一步证明该类细胞存在MCSF受体。 有关培养大鼠主动脉VSMCs能合成并分泌具有生物活性的MCSF以及该细胞存在MCSF受体的报道, 据我们所知尚属首次。
　　MCSF不仅对于单核/巨噬细胞, 而且对其它细胞, 如人内皮细胞等也有促增殖作用^[11]。 Bussolino等报道MCSF能以自分泌方式调节L6α1大鼠成肌细胞增殖^[10]。 由于培养大鼠主动脉VSMCs存在MCSF受体, 它又能分泌MCSF, 因而MCSF能否以自分泌方式调节这类VSMCs增殖值得进一步研究。 我们正在进行这方面的研究, 并探讨MCSF在高血压VSMCs增殖中的作用机制, 有关研究已取得进展。

^*国家自然科学基金(No.39670315)资助项目和法国国家科研中心(CNRS)/中国国家自然科学基金会资助对外交流与合作项目(No.39711151202)
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39670315) and the Direction des Relations Internationales, Centre National de la Recherche Scientifique, France (No.39711151202)

作者单位:朱鼎良　GOGUSEV J^**　MARCHE P^***　上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所, 上海 200025;^*　*法国国家健康医学研究院, 90研究单位, 巴黎 75015; ^*　*　*法国国家科研中心, 1482研究单位, 巴黎 75015

参考文献

　[1]　Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993, 362: 801～809．
　[2]　Pauletto P, Sartore S, Pessina AC. Smooth-muscle cell proliferation and differentiation in neointima formation and vascular restenosis. Clin Sci, 1994, 87: 467～479．
　[3]　Stanley ER. Colony stimulating factor-1 (Macrophage colony-stimulating factor). In: Thomson A ed, Cytokine handbook, 2nd ed. London: Academic Press, 1994, 387～418．
　[4]　Clinton SK, Underwood R, Hayes L, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene expression in vascular cells and in experimental and human atherosclerosis. Am J Pathol, 1992, 140: 301～316．
　[5]　Inaba T, Yamada N, Gotoda T, et al. Expression of M-CSF receptor encoded by c-fms on smooth muscle cells derived from arteriosclerotic lesion. J Biol Chem, 1992, 267: 5693～5699．
　[6]　Alexander PW. Hypertension and the pathogenesis of atherosclerosis. Hypertension, 1995, 25: 155～161．
　[7]　Haller H, Bchrend M, Park JK, et al. Monocyte infiltration and c-fms expression in hearts of spontaneously hypertensive rats. Hypertension, 1995, 25: 132～138．
　[8]　Gogusev J, Barbey S, Nezelof C. Modulation of C-myc， C-myb, C-fos, C-sis and C-fms proto-oncogene ex～pres～sion and of CSF-1 transcripts and protein by phorbol diester in human malignant histocytosis DEL cell line with 5q 35 break point.　Anticancer Res, 1993, 13: 1043～1048．
　[9]　Rosenfeld ME, Yla-Herttuala S, Lipton BA, et al. Macrophage colony-stimulating factor mRNA and protein in atherosclerotic lesions of rabbits and humans. Am J Pathol, 1992, 140: 291～300．
　[10]　Borycki AG, Smadja F, Stanley R, et al. Colony-stimulating factor 1 (CSF-1) is involved in an autocrine growth control of rat myogenic cells. Exp Cell Res, 1995, 218: 213～222．
　[11]　Bussolino F, Wang JM, Defilippi P, et al. Granulocyte- and granulocyte-macrophage-colony stimulating factors induce human endothelial cells to migrate and proliferate. Nature, 1989, 337: 471～473．

1998-03-11收稿　　1998-05-20修回