间歇性低氧对大鼠心室肌细胞
短暂外向电流的影响^*?

周　军　田　鸣^**　张　翼　周兆年***

摘　要　　利用全细胞膜片箝方法研究间歇性低氧后左、 右心室肌细胞短暂外向电流(Ito)的变化, 以探讨间歇性低氧增强心肌电稳定性的离子机制。 大鼠间歇性暴露于低氧环境 28 d (H28, 6 h/d)后, 右心室肌细胞的Ito密度较常氧对照组明显增加(16.18±4.61比6.32±1.35 pA/pF, P<0.05), 而左心室肌细胞Ito密度与对照组无明显差异。 间歇性低氧暴露 42 d (H42)动物, 其左、 右心室肌细胞Ito密度与对照组无明显差异。 Ito激活、 失活和恢复动力学变化主要表现为H42组左、 右心室肌细胞的稳态失活曲线明显向负电压方向移位。 左心室细胞的半数失活电压(－38.9±2.3)mV与对照组(-32.8±5.9)mV比较, 具有显著性差异(P<0.01); 右心室细胞的半数失活电压(-41.9±4.5)mV与对照组(-33.5±3.5)mV比较, 具有显著性差异(P<0.001)。 据此可推断, Ito密度的改变可反映心室在低氧早期阶段的不同动力学反应。 失活动力学改变参与间歇性低氧心脏保护机制。
关键词: 间歇性低氧; 短暂外向电流; 膜片箝技术; 适应; 心脏
学科分类号: Q463

EFFECTS OF INTERMITTENT HYPOXIA ON TRANSIENT
OUTWARD CURRENT IN RAT VENTRICULAR MYOCYTES^*

ZHOU　JUN，　TIAN　MING^**，　ZHANG　YI，　ZHOU　ZHAO-NIAN^***
(Shanghai Institute of Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031)

ABSTRACT

To explore the ionic basis of the strengthening effect of intermittent hypoxic adaptation (IHA) on the electric stability of heart, the effects of intermittent hypoxia on the transient outward current (Ito) in rat ventricular myocytes were investigated by using whole-cell patch-clamp recording techniques. After 28-day (H28) exposure (6 h/d)to intermittent hypoxia, the density of Ito in the right, but not in the left, ventricular myocytes was dramatically increased as compared with the normoxia control (16.18±4.61 vs 6.32±1.35 pA/pF, P<0.05), while the Ito density of the myocytes isolated from both sides of ventricles in 42-day-exposure group (H42) did not show significant difference. Except for a more negative shift of the steady-state inactivation curves (half-inactivation voltages: -38.9±2.3 vs -32.8±5.9 mV in the left ventricle and -41.9±4.5 vs -33.5±3.5 mV in the right ventricle) in the H42 group, all the other parameters for activation, inactivation and recovery kinetics of Ito of each group remained unchanged. It is speculated that the change in the current density of Ito may be responsible for the different hemodynamic responses of the ventricles to the early stage of hypoxia. The alteration in inactivation may participate in the cardioprotective effect of IHA.
Key words: intermittent hypoxia; transient outward current; patch-clamp technique; adaptation; heart

　　缺血性心脏疾患在临床颇为多见, 缺氧作为心血管系统的危害因子之一也为人所共知。 但近年来大量实验表明, 间歇性暴露于适当的低氧环境可激发机体的适应机制, 进而产生有利的影响。 间歇性低氧适应有明显的心脏保护作用, 如减轻应激、 缺血对心肌的损伤, 增强心肌电稳定性, 及预防和对抗某些心律失常的发生等^[1]。 但其机制仍不清楚。
　　短暂外向钾电流(Ito)是引起心肌细胞复极化的重要离子流之一, 参与形成动作电位复极化1期^{[2, 3]}。 尤其在大、 小鼠心肌细胞, 该电流作为其主要的外向复极电流, 对动作电位的形态和时程具有决定性影响。 近年的实验资料表明, 许多病理生理过程的改变(如高血压心肌肥厚、 心衰、 糖尿病、 甲亢等)均可影响离子通道尤其是Ito在心肌的表达^[3,4], 提示Ito可能为心肌细胞对外界环境变化作出反应的敏感因子之一。 由此, 我们对间歇性低氧适应过程中大鼠心室肌细胞的Ito的变化进行了初步观察, 以探讨间歇性低氧对心脏保护作用的部分离子机制。

1　材料与方法
1．1　间歇性低氧动物模型的制备　　雄性SD大鼠, 体重250 g 左右, 随机分为3组: 低氧28 d 组(H28)、 低氧42 d 组(H42)和对照组。 实验组动物分别按每天6 h置于人工低压氧舱, 暴露于海拔3?500 m低压低氧环境28 d和42 d, 然后进行实验。 另组动物除始终暴露于常氧条件外, 其余居住环境与实验组相同作为对照。
1.2　心室肌细胞的分离　　通过酶解方法得到单个大鼠心室肌细胞^[5]。 大鼠经戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉, 快速开胸取出心脏, 在冰冷无钙液(A)中剪除周围结缔组织。 将心脏置于langendorff灌流装置上, 经主动脉逆行灌流(灌流压70 cm H₂O)。 首先用A液灌流心脏5 min, 然后改用含50 μmol/L Ca²⁺和0.03%胶原酶、 1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的A液反复灌流约5 min。 待流出液变粘稠, 心肌变得柔软松弛时, 取下心脏, 剪除心房, 在含250 μmol/L Ca²⁺和1％ BSA的A液中分别剪碎左、 右心室肌组织, 用开口光滑的吸管缓慢吹打几次, 温孵10 min。 经细尼龙网过滤, 将细胞滤液的钙浓度逐步提高到1.0 mmol/L, 室温下保存待用。 灌流液均用100％ O₂饱和, 灌流系统恒温在37℃。
1.3　膜片箝全细胞记录　　实验采用标准膜片箝全细胞记录方法^[6], 在室温下(23～25℃)进行。 吸取上述细胞悬液, 滴入细胞浴槽, 置于倒置显微镜(Olympus CK2, Japan)工作台上, 待细胞沉降贴壁后, 用台氏液持续灌流, 流速1.5～2.0 ml/min。 通过微操纵器(Narishige, Japan)使阻抗为2～4 MΩ、 内充电极内液的玻璃微电极与细胞膜表面形成高阻抗封接(giga-seal), 继而施加负压吸破细胞膜, 补偿电容电流和电极串联阻抗, 形成全细胞记录(whole-cell recording)。 信号经Ag/AgCl电极引导, 由膜片箝放大器(CEZ 2300, Nihon Kohden, Japan)放大。 于一386型微机运行pClamp 5.6 (Axon Instuments, USA) 程序, 通过一A/D、 D/A转换界面(Axon TL-1, USA)控制刺激的发放和信号采集。 电流信号经1 kHz滤波后存储于计算机硬盘中。 为记录外向钾电流, CoCl₂ 2.0 mmol/L, TTX 20 μmol/L被加入台氏液中以分别阻断钙、 钠通道电流。 电流密度以膜电流除以膜电容表示, 后者通过clampfit程序对一10 mV短促(10 ms)刺激引发的电容电流积分后除以对应电压而求得。
1.4　溶液和药品　　A液(mmol/L): NaCl 100, KCl 10, MgSO₄ 5, KH₂PO₄ 1.2, taurine 10, glucose 10, MOPS 10, pH 7.2 。 台氏液(mmol/L): NaCl 137, KCl 5.4, MgCl₂ 1.0, CaCl₂ 1.8, HEPES 10, glucose 10, pH 7.4 。 电极内液(mmol/L): KCl 140, MgCl₂ 2, EGTA 11, HEPES 10, K₂ATP 5, CaCl₂ 1, pH 7.2 。 河豚毒素(TTX, 河北省水产研究所产品)。 胶原酶(collagenase type Ⅱ)、 牛血清白蛋白 (BSA)、 HEPES、 EGTA、 K₂ATP均为Sigma公司制品。
1.5　数据处理及统计分析电生理学资料用pClamp 6.1.4、 微软Excel 及Origin 4.1 (Microcal, USA)进行分析处理、 统计作图。 所有的实验数据均以±s表示,数据处理采用t检验。

2　结果
2.1　Ito电流密度的变化
　　Ito用去极化脉冲激发, 电流大小以外向电流峰值与平台间差值表示。 为尽可能减少TTX不敏感性内向电流对所记录的Ito的影响, 我们采用预脉冲(prepulse)刺激的方法^[6], 即在阶跃脉冲前给一持续 15 ms 从保持电位(holding potential HP)－80 mV至－20 mV的预脉冲刺激, 以失活I_Na。 然后再给予去极化阶跃脉冲刺激(首先从HP至－60　mV, 阶跃10 mV, 持续250 ms, 直至50 mV为止), 刺激频率为0.2 Hz。 s
　　间歇性低氧H28、 H42两组的左心室肌细胞的Ito密度均无明显变化。 但H28组的右心室肌细胞的Ito密度(16.2±4.6 pA/pF, n=9)与对照组(6.3±1.4 pA/pF, n=9)相比显著增加(P<0.05, 图1,2), 电流的电压依赖特性似无明显改变。 而H42组的右心室肌细胞的Ito密度(7.6±1.2 pA/pF)与对照组相比无明显差异(P>0.05)。

图　1　间歇性低氧后大鼠心室肌细胞Ito的变化

Fig.1　Alteration of  Ito in rat ventricular myocytes after exposure to intermittent hypoxia for 28 days (H28) and 42 days (H42)
N. The control.

图　2　间歇性低氧后大鼠心室肌细胞Ito的I-V关系曲线变化

Fig.2　I-V relationship of Ito density in ventricular myocytes isolated from the rats after exposure to intermittent hypoxia for 28 days (H28) and 42 days (H42)
A. Left ventricle. B. Right ventricle.^*　P<0.05 vs control, ^#　P<0.05 vs H28.

2.2　Ito的激活和失活动力学
　　参照前文^[6], 用标准双脉冲模式记录细胞Ito的稳态激活和失活, 将其电压-电流(I-V) 关系曲线用Boltzman方程I/I_max=1/1{±Exp[(V-V1/2)/s]}拟合, 求出决定曲线形状的两个重要参数, 即半数激活(失活)电压(V1/2)和斜率因子(s), 前者主要反映曲线的位置, 而后者则决定曲线的坡度。
　　在H28组, 左、 右心室肌细胞的Ito稳态激活与失活曲线的s和V1/2与对照组比较均无明显差异。 H42 组Ito的稳态激活亦无明显改变, 但左、 右心室肌细胞失活曲线的V1/2均明显较对照组为负, 失活曲线左移(图3)。 左心室细胞的半数失活电压(V1/2)为-38.9±2.3 mV (n=11), 与对照组-32.8±5.9 mV (n=11)比较, 具有显著性差异(P<0.01), 右心室细胞的V1/2为-41.9±4.5 mV (n=10), 与对照组-33.5±3.5 mV (n=7)比较, 具有显著性差异(P<0.001)。

图　3　间歇性低氧后大鼠心室肌细胞Ito稳态激活和失活动力学的变化

Fig.3　Alteration in the steady-state activation and inactivation of Ito in rat ventricular myocytes after exposure to intermittent hypoxia (IH)

2.3　Ito的恢复动力学
　　Ito从失活态恢复并再被激活是决定Ito功能特征的关键参数之一, 具有重要的生理、 病理意义^[3,4], 并与动作电位时程的频率依赖性延长有关, 因此我们对H28、 H42两组动物左、 右心室肌细胞Ito的恢复动力学也进行了分析。 细胞被施以同时程(500 ms)但不同时间间隔的双去极化脉冲刺激, 频率0.1 Hz。 将后一脉冲所得电流与前一脉冲所得者之比值对应时间间隔作图, 然后用单指数曲线进行拟合, 求出时间常数τ。 结果并未发现间歇性低氧暴露组动物心肌细胞Ito从失活态恢复的时间常数有何变化(图4): H28、 H42及对照组τ (左室) 分别为41.7±8.1(n=7), 43.9±4.1(n=10)和47.5±7.3 ms(n=10) (P>0.05); 右室分别为: 46.3±5.2(n=9), 54.0±4.8 (n=10)和48.3±5.5 ms(n=8) (P>0.05)。

图　4　间歇性低氧后大鼠心室肌细胞Ito的恢复动力学

Fig.4　Recovery kinetics of Ito in rat ventricular myocytes after exposure to intermittent hypoxia
A. Control traces from a representative.B. Left ventricle. C. Right ventricle.

3　讨论
　　本实验首次观察了间歇性低氧后大鼠心室肌细胞Ito的动态变化, 显示间歇性低氧28 d后, 右心室肌细胞Ito密度显著增加, 而在间歇性低氧42 d, Ito 密度又趋于正常。 电流大小及密度的改变显然非电压依赖特性的变化所至, 因其I-V关系和稳态激活失活动力学并未改变。 我们推测, 低氧28 d Ito密度增加, 可能由于早期暴露低氧后肺血管反应性收缩, 循环阻力增加引起右心室负荷改变所致, 或是心脏本身对低氧的直接反应。 这与某些文献^[8,9]报道的压力负荷所致之肥厚心肌及缺血心肌Ito的功能表达增加相符, 但也有不少研究表明这些因素可使Ito表达减少^{[10, 11]}。 究竟缘何有此相反发现, 是否与动物种属、 实验条件或分析方法相关, 尚未可知^[4]。
　　因间歇性低氧时缺氧的程度远较连续性低氧为轻,适度暴露较长时间后,动物可基本“适应”,肺循环血管阻力甚至可趋于恢复或逐渐降低^[1],这是间歇性低氧用于防治心血管系统疾病和支气管哮喘的理论基础之一,也可解释H42组动物右心室肌细胞Ito密度的回复。
　　有趣的是, 尽管间歇性低氧暴露42天后, 动物心室肌细胞Ito的密度已与正常无别, 但其稳态失活曲线在左、 右心室均趋左移(约6～8 mV)。 不难推测, 在同一膜电压下, 由于失活减少, 外向电流将相对增加, 结果促进膜复极, 有利于防止早后除极的发生。 是否此推论乃间歇性低氧适应对心脏的电稳定性产生重要影响的机制之一, 以及这一变化确切的生理重要性及原因, 尚待进一步探讨。 另外, 如能同时观察间歇性低氧适应对其它与动作电位形成密切相关的离子电流的影响及动作电位本身的改变, 将对揭示此时的心肌细胞电生理特性并推测间歇性低氧适应机制具有重大意义。

^*国家自然科学基金项目 (No.39500052)
^*　*徐州医学院麻醉生理研究所, 徐州 221002
***联系作者. Tel: 64313251-8500；　Fax: 64746305；　E-mail:znzhou@sever.shcnc.ac.cn
^*This work was supported by National Natural Science Foundation of Chin(No.39500052).
^*　*Present address: Institute of Anesthesiological Medicine, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002
^*　*　*Correspondence author. Tel: 64313251-8500；　Fax: 64746305；　E-mail:znzhou@sever.shcnc.ac.cn

作者单位：周　军　田　鸣　张　翼　周兆年　中国科学院上海生理研究所, 上海 200031

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1998-04-22收稿　　1998-06-03修回