人SOD₁基因在大鼠血管平滑肌细胞的
表达及对抗氧自由基损伤的作用^?*

郑新程　安　威¹　白景香²　毛松华　伍贻经s

摘　要　　本实验构建含人铜锌超氧化物歧化酶(hSOD₁)基因的逆转录病毒载体, 将其导入离体培养的鼠血管平滑肌细胞(VSMCs), 观察hSOD₁基因表达及其抗氧自由基损害作用。 结果表明: (1)载体构建策略和方法正确, hSOD₁基因可在靶细胞中高效稳定表达; (2)转化hSOD₁的VSMCs可对抗大剂量氧自由基对细胞的直接损伤作用; (3)小剂量氧自由基刺激VSMCs增殖, 而转化hSOD₁的VSMCs增殖反应受到抑制。 本研究结果提示, 外源性表达的SOD可能通过抗自由基损伤和抑制内皮细胞增殖两方面作用阻止动脉粥样硬化的形成。
关键词: 超氧化物歧化酶; 基因; 血管平滑肌细胞; 自由基
学科分类号: Q78

EXPRESSION OF HUMAN SUPEROXIDE DISMUTASE GENE
IN RAT VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS AND
ITS ANTI-OXIDATIVE EFFECT^?*

ZHENG　XIN-CHENG，AN　WEI，BAI　JING-XIANG²，
MAO　SONG-HUA，WU　YI-JING
(Department of Pathophysiology, Beijing Medical University, Beijing 100083;
¹Department of Cell Biology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054;
²Department of General Surgery, The People′s Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100035)

ABSTRACT

　　A retroviral vector containing human superoxide dismutase (SOD) cDNA was constructed and transfected into rat vascular smooth muscle cells (VSMCs). The expression of exogenous hSOD₁ in the VSMCs was analyzed with Northern and Southern blot. The protection of the transfected and/or non-transfected VSMCs from free radical produced by the xanthine/xanthine oxidase (X/XO) system was investigated. The results showed that the construction strategy of the vector was correctly performed and the expression of hSOD₁ in the transfected cells was highly detectable. The cell damage of X/XO could be alleviated with expression of hSOD₁ in the transfected cells, as compared to control. In addition, proliferation of the transfected VSMCs resulted from oxidative stress was suppressed. It is suggested that the expression of gene-transferred hSOD₁ is able to prevent the formation of atherosclerosis, partially due to its cell protection and inhibition of the proliferative embolization.
Key words: superoxide dismutase (SOD); gene; vascular smooth muscle cells; free radical

　　大量的研究结果表明, 氧自由基(oxygen-free radicals, OFRs)介导的脂质过氧化损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)发病的主要诱因之一^[1]。 氧自由基一方面攻击血管内皮细胞, 使其完整性受到损害。 破损处所沉积的血小板被激活后, 释放出血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF), 后者促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)高度增殖。 增殖的VSMCs与单核细胞和成纤维细胞一道向血管内膜迁移并在此积聚, 造成血管内径狭窄^[2]。 另一方面, 氧自由基亦可使内皮细胞的内分泌功能受到损害, 阻止其合成前列环素(PGI2), 内源性舒张因子(EDRF)等, 影响血管的正常舒张功能^[3]。 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是体内氧自由基的特异性清除剂。 据报道, As的发生与SOD活性降低有关^[4]。 据此, 我们构建含人Cu-Zn SOD(hSOD₁)基因的载体, 将其导入VSMCs, 得到稳定高效转化细胞, 观察其基因表达的抗氧自由基损伤作用, 为As基因治疗的可行性研究提供理论依据。

1　材料与方法
1.1　含hSOD₁基因载体的构建　　将hSOD₁ cDNA(美国Bionike公司王凯华教授惠赠)正向插入到逆转录病毒载体XM-6的5′LTR启动子下游, 得到重组体XM-6/SOD(图1), 以酶切法判定插入方向正确与否^[5]。

图　1　含人铜锌SOD基因逆转录病毒重组体的构建

Fig.1　Illustration of the construction of a retroviral vector containing hSOD₁ gene
hSOD₁ gene inserted into Hind Ⅲ and Bgl Ⅱ sites of the XM-6 vector.

1.2　载体的包装及滴度测定^[6]　　利用脂质体(lipofectin, Boehringer Mannheim公司生产)介导的基因转移方法将XM-6及XM-6/SOD DNA导入包装细胞系PA317。 经G418 (GIBCO公司生产) 400 μg/ml筛选10～12 d, 可见阳性克隆, 选取6～8个克隆继续培养。 至汇合时,　吸取培养基, 以4 000 r/min离心5 min, 取上清, 以NIH3T3为靶细胞, 测定上清中病毒滴度。 将滴度大于5×10⁵ cfu/ml克隆保存于－70℃备用。
1.3　VSMCs细胞培养、　鉴定及转染　　取第2～3代正常血压WKY大鼠胸主动脉中层VSMCs细胞(北京医科大学生物物理系惠赠), 以含10%小牛血清的DMEM培养基培养。 应用小鼠抗SMC-α-actin的单克隆抗体 (Sigma公司生产) 进行VSMCs免疫荧光及免疫组化染色, 旨在鉴定细胞培养中是否混有成纤维细胞, 以NIH3T3细胞作阴性对照。 接种2.5×10⁵个生长状态良好的VSMCs于50 ml培养瓶中培养, 待细胞长至汇合率达50%～70%时弃去培养基, 加入病毒上清液5 ml及8 μg/ml polybrene, 培养6 h, 更换成正常培养基继续培养。 24 h后加入G418 400 μg/ml筛选, 10～20 d出现阳性克隆。 继续将克隆扩大培养, 得到XM-6及XM-6/SOD的两种转化VSMCs细胞。

图 2　hSOD₁基因在VSMCs基因组中的整合及表达

Fig.2　Cloning and expression of hSOD₁ gene in VSMCs genome

Southern blot (left): genomic DNA of VSMCs (lane 1), VSMC/XM6 (lane 2) and VSMC/XM6-SOD (lane 3) were digested with XbaⅠ; genomic DNA of VSMC/XM6-SOD (lane 4) was digested by XbaⅠ+Hind Ⅲ, Northern blot with hSOD₁ probe (right, upper) and 18S RNA probe (right, lower): VSMCs (lane 1), VSMCs/XM6 (lane 2) and VSMCs/XM6-SOD (lane 3).

1.4　Southern和Northern杂交^[7]　　以酚-氯仿法提取上述两种细胞基因组DNA, 取15 μg DNA, 经限制性内切酶消化, 0.8%琼脂糖凝胶电泳, 将凝胶中的DNA转印至尼龙膜, 以随机引物法将α-³²P-[dCTP]标记于hSOD₁ cDNA, 制备探针(标记试剂为Promega公司生产)。 以异硫氰酸胍(GTC)裂解上述两种细胞并以酚-氯仿一步抽提法提取总RNA(GIBCO公司生产)。 取20 μg RNA经1.0%甲醛变性, 琼脂糖凝胶电泳, 再将凝胶中的RNA转印至尼龙膜。 hSOD₁基因探针分别与两膜杂交并进行放射自显影。
1.5　细胞活性检测　　本实验所用细胞均以台盼蓝染色排阻法测定活率, 只有活率大于90%才用于实验。 以不同浓度外源性氧自由基发生系统作用后(分组见后), 取各组细胞培养基上清0.1 ml, 测定台盼蓝摄取率, 并依Bradford^[8]法定蛋白, 参照Wroblewski^[9]的方法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH), 作为细胞受损指标。
1.6　细胞膜流动性的测定　　贴壁生长的细胞经胰酶消化后制成细胞悬液, 加入二苯基己三烯(diphenyl hexatriene, DPH)使终浓度为2×10^－6 mol/L, 25℃孵育30 min, 1?000 r/min离心5 min, 收集细胞沉淀, 以3 ml PBS (pH 7.4)制成悬液, 用荧光分光光度仪(MCF-4, Hitachi公司生产), 在362 nm激发波长、 432 nm发射波长下测定荧光值。
1.7　细胞周期的测定　　贴壁生长的细胞经胰酶消化后制成细胞悬液并计数细胞。 取1 ml样品(细胞10⁶个), 以2.5倍体积无水乙醇于－20℃过夜固定, PBS (pH7.4)洗3遍, 将细胞定容在1 ml PBS。 加入100 μl RNase A (10 ng/ml), 在37℃孵育30 min, 加50 μl碘化丙锭(PI) 染色, 以流式细胞仪(Becton & Dickinson公司生产)分析细胞周期。

2　结果
2.1　VSMCs的鉴定
　　大鼠VSMCs在显微镜下呈梭形或长梭型, 可重叠生长达多层, 高低起伏, 呈典型的“谷与峰”样生长。 经荧光染色后, 可见胞浆中含有丰富的黄绿色丝状物, 免疫组化染色后, 整个胞浆被黄棕色颗粒所覆盖, 且每个细胞均被染成黄棕色, 而对照组NIH3T3细胞均未出现以上结果, 说明培养的VSMCs未混杂有成纤维细胞 (本组照片未示)。
2.2　hSOD₁基因在VSMCs基因组中的整合及表达
　　Southern杂交结果显示: 转染XM-6/SOD VSMCs的基因组DNA经XbaⅠ单酶切和XbaⅠ+Hind Ⅲ双酶切后, 分别在3.2 kb及1.8 kb位置呈现杂交带,说明逆转录病毒所携带的hSOD₁基因已经整合到VSMCs基因组中, 且hSOD₁基因插入正确。 正常VSMCs及转染XM-6空载体的VSMCs基因组DNA未见杂交信号, 说明其不含有外源性hSOD₁基因片段。 Northern杂交结果显示, 正常VSMCs和仅转染XM-6以及转染XM-6/SOD₁的VSMCs均有杂交带出现,转染hSOD₁基因的VSMCs杂交信号明显强于其它两种细胞, 说明除内源性SOD基因的表达外,在转染hSOD₁基因的VSMCs中尚存外源性hSOD₁基因表达。以18S RNA探针作内标准显示,三种VSMCs细胞的杂交信号强度一致,说明各样本RNA量基本一致。
2.3　转化VSMCs抗氧自由基的损伤作用
　　用6种不同浓度的外源性氧自由基发生系统黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(xanthine/xanthine oxidase, X/XO)攻击对照组VSMCs及转化组VSMCs, 2 h后测定细胞LDH释放、台盼蓝摄取率及膜流动性的变化。 结果显示, 随X/XO浓度的增加, 对照组VSMCs及转化组VSMCs细胞损伤加重, 表现为LDH释放量及台盼蓝摄取率增高, 膜流动性降低, 呈剂量依赖关系。 然而, 在相同浓度X/XO条件下, 转化组 VSMCs 与对照组相比, LDH漏出量减少(图3), 台盼蓝摄取率降低(图4), 膜流动性降低幅度减小(图5), 显示外源性SOD表达后具有明显的抗自由基致VSMCs损伤作用。

图　3　　不同浓度外源性氧自由基作用后细胞LDH的释放量

Fig.3　Effects of different concentrations of exogenous oxygen-free eadicals (OFRs) on LDH release
The OFRs were generated by X/XO system. The concentrations of XO correspondent to various X values were 1, 5, 10, 20, 50 and 100 IU/L, respectively. Data are shown as x±s_x. ^*　P<0.05; ^**　P<0.01; ^***　P<0.001 vs VSMCs group (ANOVA).

图　4　　不同浓度外源性氧自由基作用后的细胞胎盘蓝摄取率

Fig.4　Effects of different concentrations of exogenous OFRs on cellular trypan blue uptake rate
The generation of OFRs and combination dosage of X/XO were the same as in Fig.3. Data are shown as ±s. ^*　P<0.05; ^*　*　P<0.01; ^*　*　*　P<0.001 vs VSMCs group (ANOVA).

s

图　5　　不同浓度外源性氧自由基作用后细胞膜流动性改变

Fig.5　Effects of different concentrations of exogenous OFRs on cell membrane fluidity
The OFRs were generated by X/XO system. The combined concentrations of X/XO were 0/0, 0.05/5 , 0.1/10 (X mmol/L vs XO IU/L). Data are shown as ±s_. ^*　P<0.05; ^*　*　P<0.01;  ^*　*　*　P<0.001 vs VSMCs group (ANOVA).

2.4　转化VSMCs的抗增殖作用
　　在贴壁生长的VSMCs培养液中分别加入低浓度外源性氧自由基发生系统(X与XO浓度为0.03 mmol/L和3 IU/L), 2、12、24和48 h后收集细胞, 以流式细胞仪测定S期细胞比率。 结果如表1所示。 氧自由基刺激后48 h内, 两组细胞S期比率均升高, 提示细胞内DNA合成增加, 细胞呈增殖反应。 但是, 转化VSMCs组S期细胞比率增高幅度明显不及对照组VSMCs。 时至48 h转化VSMCs组S期细胞比率仅比刺激前升幅近70%, 而对照组则升幅达350%, 具有明显统计学差异。 本结果说明, 转化hSOD₁的VSMCs具有抗低剂量外源性氧自由基的促增殖作用。

表 1　外源性氧自由基对细胞S期比率的影响

Table 1　Effects of exogenous OFRs on cell S phase ratio (%±s)

Time /h	S phase ratio
	VSMCs	VSMCs /SOD
0	7.9±2.9	7.1±2.7
2	29.1±2.2	9.3±2.9
12	31.8±1.6	16.3±1.4
24	43.3±2.1	26.2±1.9
48	29.9±2.8	12.2±2.9

3　讨论
　　本实验将hSOD₁基因导入VSMCs后, 观察其抗氧自由基损伤作用, 目的在于探讨通过局部表达某些特异性保护蛋白基因(如SOD, 过氧化物酶, MAO等), 进行As基因治疗的可行性研究。
　　以逆转录病毒为载体构建重组基因, 再经包装细胞PA317包装, 产生具有攻击增殖旺盛靶细胞的重组病毒颗粒, 几乎成了目前基因治疗肿瘤实验之首选^[10]。 本实验采用这一策略, 旨在提高转基因靶细胞对目的基因的表达率。 实验所用的逆转录病毒载体为N2系列, 其5′-LTR可对插入的外源性基因进行有效表达^[11]。 利用这一特点, 我们将含hSOD₁的重组病毒以脂质体介导法, 导入大鼠VSMCs。 结果证明, 不仅目的基因hSOD₁得以高效表达, 且插入片段不影响筛选基因(Neo^R)的功能。 说明本载体构建策略正确。
　　X及XO是目前常用的外源性氧自由基发生系统, 所产生的超氧阴离子自由基()可攻击细胞, 使其损伤^[12]。 本实验结果表明, 受损细胞膜质脂过氧化加强, 膜的稳定性受到破坏, 膜的流动性显著降低。 而转基因的VSMCs表达hSOD₁后, 其抗氧自由基损伤能力明显提高。 在低浓度X/XO和中浓度X/XO条件下, 转基因组细胞损伤程度对比未转基因组明显减轻, 提示hSOD₁具有直接细胞保护作用。 一般认为, 外源性氧自由基损伤血管内皮细胞的同时, 可引起VSMCs的应激反应^[13]。 应激反应造成的细胞增殖又进一步使血管管径狭窄, 加重阻塞程度。 因此, 能否抑制平滑肌细胞受损后的应激性增殖, 成为治疗As的又一关键步骤。 实验中观察到, 低剂量氧自由基有直接刺激VSMCs增殖的作用, 转hSOD₁基因VSMCs在刺激后24 h内, S期细胞比率增高的趋势明显降低。 作为DNA合成主要时相的S期一般位于细胞周期中第6～12小时^[14], 95%以上的DNA均在此期合成。 本实验测得S期细胞比率增高趋势减弱, 充分说明转hSOD₁细胞DNA合成受到抑制, 细胞的增殖能力大为减弱。 究其机制, 可能与hSOD₁的直接细胞保护作用有关。 有报道证明, 细胞的应激反应程度与细胞损伤状况有关。 在一定的范围内, 损伤越重, 增殖越强。 而表1中所用的X/XO为低浓度自由基, 所产生的轻度细胞损害, 可被外源性hSOD₁所对抗。 其结果为受损细胞功能不致丧失, 无需通过代偿性增生来加以取代。
　　应该指出, 氧自由基的清除是一个复杂的过程^{[15, 16]}, 单纯用SOD难以奏效。 在SOD作用下, 歧化成H₂O₂, 后者可与生成^.OH, 而H₂O₂与^.OH都是活性氧自由基的家族成员。 文中图3, 4, 5的结果反映出外源性hSOD₁作用在一定程度内有效, 其原因可能与众多氧自由基参与细胞毒性损伤有关, 如能在SOD基础上, 辅以过氧化物酶进行治疗, 疗效或许更为明显。 对此, 我们将做深入研究。

^*国家自然科学基金资助 (No.39670308)
¹ 联系作者
^*This work was supported by National Natural Science Foundation of China(No.39670308).
^*?　*?Correspondence author

作者单位:郑新程　安　威¹　白景香²　毛松华　伍贻经　北京医科大学病理生理教研室, 北京 100083;¹首都医科大学细胞生物系, 北京 100054;²北京医科大学人民医院普外科, 北京 100035

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1998-03-20收稿　　1998-05-25修回