一氧化氮／内皮素在大鼠胃粘膜
损伤中的作用及电针的调整效应*

孙　勇　许冠荪?**?　刘维平　许能贵

摘　要　　用酒精灌胃引起大鼠胃粘膜损伤模型, 观察内皮衍生因子 (NO/ET) 的含量变化和电针对胃粘膜损伤调整作用。 结果发现: 酒精灌胃后, 胃粘膜血流量 (GMBF)、 跨壁电位差、 血NO含量降低 (P<0.01), 血浆ET含量和胃粘膜损伤指数 (LI) 增高 (P<0.01)。 L-精氨酸(L-Arg) 或硝普钠 (SNP) 灌注预处理后(iv), NO含量和GMBF明显升高 (P<0.01), ET含量和LI指数下降(P<0.01)。 电针(EA)足三里穴位加强了以上效应, 且EA效应被预先静脉灌注的NO生物合成抑制剂N-亚硝基左旋精氨酸 (L-NNA) 所抑制。 L-NNA　的抑制效应又可被与其同时灌注的L-Arg所翻转。 结果提示: NO有抗胃粘膜损伤作用, 电针对胃粘膜保护作用的主要效应分子可能是NO。
关键词: 胃粘膜损伤; 一氧化氮; 内皮素; 电针
学科分类号: Q482

THE ROLE OF NO/ET AND THE EFFECT OF ELECTRO-
ACUPUNCTURE ON INJURIED GASTRIC MUCOSA IN RATS?*

SUN　YONG，　XU　GUAN-SUN**　?，　LIU　WEI-PING,　XU　NENG-GUI
(Physiology Research Laboratory, The Institute of Acupuncture and Meridian,
AnHui College of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038)

ABSTRACT

　　The aim of the present work is to observe changes in endothelium-derived factorsnitric oxide(NO)and endothelin(ET), with special reference to the regu．lative role of electroacupuncture(EA)in injured gastric mucosa of rat by ethanol. It was found that gastric mucosal blood flow(GMBF), transmucosal potential difference(PD)and the content of NO in the serum all decreased (P<0.01), while the content of ET in the plasma and the lesion index(LI) of gastric mucosa increased(P<0.01). After administration of L-Arg and SNP, the content of NO and GMBF increased significantly(P<0.01), whereas the content of ET and LI decreased (P<0.01). These effects were enhanced by EA at ZuSanLi (ST-36) points, which, however, were inhibited by NO biosynthetic inhibitorL-NNA. The latter effect could be reversed by concurrent administration of L-Arg. The above results suggest that NO plays a critical part in protecting gastric mucosa against injury, which is also responsible for the protective effect of EA on injury of gastric mucosa.
Key words: gastric mucosal injury; nitric oxide (NO); endothelin (ET); electroacupuncture (EA)

　　内皮衍生因子(NO/ET)是众所周知的内皮依赖的血管舒张和收缩因子, 它们的生物活性相互拮抗。 本实验旨在观察它们在酒精灌胃引起胃粘膜损伤中所起的作用以及NO前体、供体和L-NNA对胃粘膜损伤之影响, 为探求新的保护胃粘膜药物提供实验依据, 并且观察电针对胃粘膜的保护作用及探讨其可能的机制。

1　材料和方法
1.1　动物与分组　　Wistar大鼠, 体重150～250　g, 雌雄不拘, 实验前禁食12 h, 自由饮水。 随机分为10组: (1)正常对照组(control), 胃内灌注1 ml生理盐水。 (2) 模型组(model, M), 70% 酒精灌胃致胃粘膜损伤。 (3)(4)(5)组分别用L-精氨酸 (L-Arg)、 硝普钠(SNP)、 N-亚硝基左旋精氨酸 (L-NNA)于造模前15 min预处理 (iv), 观察各指标的改变。 麻醉大鼠并固定, 分离大隐静脉。 用PE-10聚乙烯管插入大隐静脉, 用电子微量泵分别将L-Arg (150 mg/kg)、 SNP (200 μg/kg) 和N-亚硝基左旋精氨酸 (30 mg/kg) 输入。 L-Arg与SNP用蒸馏水分别配制成30 g/L、 40 mg/L; L-NNA用PBS缓冲液配制成600 mg/L。 灌注速度为0.5 ml/min, 灌注量根据体重来计算。 (6)(7)组在L-NNA大隐静脉灌注前, 分别给药L-Arg、SNP, 以观察对模型组各项指标的影响。 (8)(9)(10) 3组分别用来观察电针(EA)疗效、　L-NNA对EA疗效的影响, 以及L-NNA与L-Arg同时给药对EA的影响。
1.2　药品　　L-精氨酸(L-Arg), 华美生物工程公司生产; 硝普钠(SNP), 北京制药工业研究所实验药厂生产; N-亚硝基左旋精氨酸(L-NNA), Sigma公司产品。
1.3　造模　　用戊巴比妥钠麻醉(30～40 mg/kg, ip)动物。 沿腹正中线切开, 暴露胃, 将PE-10聚乙烯管插入胃内固定, 输入管连接蠕动泵恒速输入70％乙醇(37℃, 0.5～0.6 ml/min) 1 ml, 腹部缝合, 30 min后即可进行各项指标检测[1]。
1.4　胃粘膜血流量(GMBF)测定　　用氢气清除法[2]。 造模后的动物腹部拆线, 将铂金丝(直径100　μm) 电极置于胃粘膜层, 参考电极置于切口处皮下, 把两极连于XJY-1型组织血流量微机检测仪(中国合肥机械电子工业部43所生产〕。 给大鼠吸入10％左右的低浓度氢气约20 s, 打印机按自编程序打印出GMBF曲线, 并计算大鼠GMBF ml/(min.100 g)。
1.5　跨壁电位差(PD)测定　　用Ag-AgCl电极直接测定法[3], 略加修改。 有效电极放于粘膜层, 参考电极置于浆膜层, 并读取数值, 即为粘膜浆膜层间的电位差(mV）。
1.6　损伤指数 (LI）评定　　将大鼠处死, 向胃内注入10 ml 10%福尔马林, 取出胃并置同一浓度福尔马林中充分固定。 沿胃大弯剪开, 轻轻洗去胃内容物, 按Guth指数评定法[4] 计算出胃粘膜损伤指数。
1.7　血一氧化氮(NO)测定　　眼球取血2 ml快速离心分离血清, 于－20℃冰箱保存, 测定按Green[5]法进行。
1.8　血浆内皮素(ET)检测　　采用东亚免疫技术研究所提供的ET试剂盒检测。
1.9　电针参数　　选用双侧足三里穴(ST-36, 膝部外下方), 用PCE-88A程控电针治疗仪给予电针刺激, 频率20 Hz, 单脉冲波宽0.5 ms, 电流强度2 mA, 连续30 min, 以实验大鼠肢体轻微抖动为度。
1.10　统计学处理　　实验结果均采用均值±标准误(xx1.gif (881 bytes)±sxx1.gif (881 bytes))表示。 组间差异显著性比较采用Student′s t检验。

2　结果
2.1　在酒精引起的大鼠胃粘膜损伤中, NO前体、 供体及生物合成抑制剂对各项观察指标的影响　　

表 1　L-Arg、 SNP及L-NNA对酒精引起的大鼠胃粘膜损伤的LI、 GMBF、 PD和NO的影响

Table 1　Effects of L-Arg, SNP and L-NNA on LI, GMBF, PD and NO in ethonal injured stomach mucosa of rats

 

Group

n

LI　

GMBF　　　
/ml.(min.100 g)－1　

PD 　
／mV 　

　　NO
　／μmol.L－1

Control

10

　　0

138.20±4.37

20.82±0.99

21.12±1.89

Model (M)

10

45.80±3.20

　69.60±6.09

11.85±0.82

12.48±1.54

L-Arg+M

　9

32.40±3.20**

106.22±5.34**

17.73±0.22**

15.32±1.32*

SNP+M

　8

30.00±3.08**

104.03±7.57**

17.89±0.39**

14.99±0.98*

L-NNA+M

10

55.80±2.76**

　56.86±5.16**

　6.98±0.32**

　8.37±0.27*

L-NNA+L-Arg+M

　9

46.20±3.00

　72.00±5.90

12.00±0.91

12.60±1.39

L-NNA+SNP+M

　9

44.90±2.90

　70.20±6.00

12.08±0.85

12.39±1.40

 


*　P<0.05, **　P<0.01, vs model.

　　实验动物造模前15 min给予L-Arg (150 mg/kg, iv)预处理后, LI较模型组明显降低(P<0.01), GMBF、 　PD、 　NO明显升高(P<0.01); 若灌注的是SNP (200μg/kg,iv), 显示结果相同。 若同时注入L-NNA (30～40 mg/kg, iv), L-Arg或SNP效应消失; 若单独灌注L-NNA, 则LI较模型组明显增高 (P<0.01), GMBF、 PD、 NO明显降低 (P<0.01或P<0.05)。 这些结果提示, L-Arg、 SNP对受损胃粘膜有保护作用, 而L-NNA对胃粘膜有间接损伤作用。
2.2　内皮衍生因子在酒精引起的胃粘膜损伤中的作用
　　在模型组中, ET均值(540±101) pg/ml较对照组(349±26) pg/ml明显增高(P<0.01), 而NO含量(12.48±1.54) μmol/L 较对照组(21.12±1.89) μmol/L明显降低(P<0.01)。 模型组给予L-NNA (3 mg/kg, iv)预处理, 与单独模型组相比NO含量(8.37±0.27) μmol/L 明显下降 (P<0.01), 而ET含量明显上升(668±98) pg/ml (P<0.01), LI (55.80±2.76)显著上升(P<0.01), 此现象可被与L-NNA同时注入的L-Arg (150 mg/kg, iv)所翻转。 这些结果显示: NO/ET比值下降, 胃粘膜损伤程度加重。

52.gif (5537 bytes)


图　1　NO/ET在酒精引起的胃粘膜损伤中的含量变化

Fig.1　Changes in the content of NO/ET in ethonal injured stomach mucosa of rats
**　P<0.01, vs model.

2.3　电针对酒精引起的大鼠胃粘膜损伤的各项指标的影响

表 2　电针对酒精引起的大鼠胃粘膜损伤时ET、 GMBF、 NO、 PD及LI的影响

Table 2　Effects of electroacupuncture on ET, NO, GMBF, PD and LI in injured stomach mucosa by ethonal

 

Group

LI　　

GMBF　　
／ml.(min.100　g)－1　

NO　
／μmol.L－1

ET　
／pg.ml－1

　PD
　／mV

Model (M)

45.60±3.20

69.90±6.09

12.48±1.54

540±101

11.85±0.82

M+EA

31.40±3.30*

92.55±5.35.

18.65±0.69**

401±81**

15.84±0.40**

L-NNA+M+EA

41.80±2.12＃

73.57±5.43＃

12.37±1.78＃

668±98＃

11.87±0.41＃

L-NNA+L-Arg

31.00±1.20

95.00±3.78

19.24±0.54

411±79

16.00±0.39

　+M+EA

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


n=10. *　P<0.05, **　P<0.01, vs model; ＃　P<0.01, vs M+EA．

　　乙醇(1 ml)灌胃后, 于足三里穴给予电针刺激30 min, NO明显升高 (P<0.01), GMBF也升高 (P<0.05), 而ET非常显著下降 (P<0.01), LI明显下降 (P<0.05); 若电针前以L-NNA(30 mg/kg, iv)预处理, GMBF、 PD和NO均较模型组明显降低 (P<0.01), 而LI及ET则明显升高。 若在L-NNA预处理同时给予L-Arg (150 mg/kg, iv), 则L-NNA效应消失。 这表明, 电针有助于受损胃粘膜的修复。

3　讨论
　　胃粘膜完整性的维持主要取决于损伤因子与防御因子和修复因子之间的动态平衡。 从理论上讲, 胃粘膜损伤因子增加或防御和／或修复能力减弱, 都会影响粘膜完整性。 粘膜是否完整可从微循环、 粘膜完整性及形态学三方面来考查。 我们采用GMBF、 PD及LI三个参数作为粘膜是否受损的指标。 70％酒精灌胃后, GMBF明显下降, 粘膜损伤, 反映胃粘膜完整性的PD也显著下降。 外源性NO前体L-Arg及其供体SNP静脉注入后, GMBF明显上升(P<0.01), 胃粘膜损伤明显减轻; 使用NO生物合成抑制剂L-NNA后粘膜损伤加重。 似表明NO对受损胃粘膜的保护作用是通过L-Arg-NO途径来实现的。 NO的这种作用是通过扩张血管、 增加组织血供而产生。 从实验结果还发现, 酒精灌胃后, 血浆ET含量明显升高, 粘膜损伤程度加重。 酒精可促进胃动脉血管内皮释放ET, ET增强胃粘膜对乙醇或应激等引起损伤的敏感性。 众所周知, ET是至今为止发现的缩血管活性最强的内皮衍生因子, NO/ET是血管活性物质中的两个主要因子, 它们是内皮依赖的舒张因子和收缩因子的主要成分, 生物学活性也是相互拮抗的。 大多数内皮依赖的舒张血管作用可由NO介导, ET与NO之间存在负反馈调节。 它们之间保持动态平衡, 维持一定的比例, 调节血管张力和结构重组[6]。 NO/ET比值升高, 血管舒张; 比值下降, 血管痉挛。
　　实验结果观察到, 在足三里穴给予电针, NO含量明显升高, 粘膜损伤程度减轻。 这种效应可被L-NNA阻断, 而被L-Arg所翻转。 似表明电针对受损胃粘膜的保护作用是通过释放NO来升高GMBF实现的。 针刺足三里穴对胃粘膜保护作用似可通过下列三条途径实现[8]。 (1)电针足三里穴可使胃粘膜和血管平滑肌产生和释放NO, 直接扩散到靶细胞, 进入胞内的NO与鸟苷酸环化酶(GC)中的铁离子结合使之激活, 产生cGMP, 发挥舒张血管平滑肌的作用。 (2) 电针足三里穴可使胃粘膜释放NO到达靶细胞, 使胃的平滑肌细胞膜电位发生超级化; 启动Ca2+ 依赖的钾离子通道, 产生舒张胃和血管平滑肌的效应。 (3) 电针足三里穴所产生和释放的NO也可介导某些生物活性物质, 如血管活性肠肽(VIP)、 降钙素基因相关肽(CGRP)、 前列腺素(PGs)和 生长因子(GFs)等发挥生物效应。 针刺作用究竟是通过哪条途径或以哪条途径为主, 尚需从不同的NO合酶(N0S)的激活途径来深入研究 。

　　本文实验部分得到中国科学院上海生理研究所顾正中教授的热心指导与帮助, 特致谢忱。

国家攀登计划 (JL-93012) 资助项目
*　*?联系作者　206　
*?Supported by the National Climbing Project of China (JL－93012)
*?　*?Correspondence author

作者单位:孙　勇　许冠荪?刘维平　许能贵　安徽中医学院针灸经络研究所生理研究室, 合肥 230038

参考文献

　[1]　Masuda E, Kawano S, Nagano K, et al. Endogenous nitric oxide modulates ethanol-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology, 1995, 108: 58～64.
　[2]　Livinston EH, Tenny RF, Leung W, et al. Computerized curve fitting in the analysis of hydrogen gas clearance curves. Am J Physiol, 1989, 257: G668～G675.
　[3]　Merino GE, Ascher NV, Borner JW, et al. Electric potential of gastroduodenal mucosa measured by endoscopy. Surg Gynecol Obstet, 1977, 144: 8～10.
　[4]　Guth PH. Topical aspirin plus HCl gastric lesion in rats. Gastroentrrology, 1979, 76 (1): 88～93.
　[5]　Green LC, Tannenbaum SR, Glodman P. Nitrate synthesis in the germfree and convertional rat. Science, 1981, 212: 56～58.
　[6]　Feng XD (冯晓东), Cai YN (蔡英年). Endothelium-derived factors and hypoxic pulmary hypertension. Basic Med Sci Clin (基础医学与临床), 1996, 16 (1): 6～10 (in Chinese with English abstract).
　[7]　Donna-Marie, Mc Caffer TY, John S, et al. Inducible nitric oxide synthase plays a critical role in resolving intestinal inflamation. Gastroenterology, 1997, 112: 1022～1027.
　[8]　Xu GS (许冠荪), Wang ZJ(王振玖), Zhu SL (朱舜丽) et al. NO participates in the protective effect of acupuncture on the injured gastric mucosa. J Anhui TCM College (安徽中医学院学报), 1996, 3: 36～38 (in Chinese with English abstract).

　1998-01-21收稿　　1998-05-04修回