孕酮对人早孕子宫蜕膜细胞
活性肾素分泌的调节*

闫建设　郭椋昊　刘　疆　王　红**

摘　要　　子宫蜕膜是肾素产生的主要部位, 肾素包括活性与非活性肾素, 活性肾素可使血管紧张素原水解生成血管紧张素Ⅰ, 继而调节血管紧张素Ⅱ的表达。 实验表明: (1)妊娠早期(孕5～9周), 人子宫蜕膜活性肾素的含量随妊娠周龄增加而升高, 孕8周时可达63.37±12.84 AⅠ ng/gww^.h^-1; (2)早孕子宫蜕膜组织活性肾素占总肾素量的1/4; (3)孕酮可调节蜕膜细胞活性肾素的合成与分泌。 人早孕子宫蜕膜组织中存在高水平的活性肾素, 性类固醇激素可调节蜕膜细胞活性肾素的表达, 可以认为, 子宫局部肾素-血管紧张素系统在妊娠过程中发挥了重要作用。
关键词: 孕酮; 肾素; 妊娠; 子宫蜕膜
学科分类号: Q492.5

MODULATION OF THE SECRETION OF ACTIVE RENIN IN
HUMAN DECIDUAL CELLS BY PROGESTERONE^?*

YAN　JIAN-SHE，　GUO　LIANG-HAO，　LIU　JIANG，　WANG　HONG**
(State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology,
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080)

ABSTRACT

　　Uterine decidua is a major source of renin, both active and inactive. Active renin cleaves angiotensinogen to produce angiotensinⅠ and exerts its effect on the expression of angiotensinⅡ in the local tissue. Our experiments showed that (1) in the decidua of early pregnancy the contents of active renin increased gradually with advancing pregnancy, and at 8th week of gestation the level of active renin reached to a maximum (63.37±12.84 ) AⅠ ng/gww*h^－1; (2) active renin accounted for about 1/4 of the total renin; and (3) the synthesis and secretion of active renin were regulated by progesterone in incubated decidual cells. These data indicate that a high level of active renin in decidual tissue at early pregnancy plays an important role in the uterine renin-angiotensin system during pregnancy.
Key words: progesterone; renin; gestation; human decidua

　　肾素(renin)是肾脏近小球旁器分泌的一种糖蛋白, 有蛋白水解酶的活性。 在循环血液中, 肾素可以使血管紧张素原(angiotensinogen)C端两个亮氨酸之间的肽键断裂生成血管紧张素Ⅰ(angiotensinⅠ, AⅠ), AⅠ在血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)作用下生成有生物活性的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AⅡ)。 自1966年Bing等人^[1]在家兔子宫中发现肾素以来, 在肾外组织如: 脑、 心脏、 血管、 卵巢、 睾丸和子宫等部位都观察到它们可以自身合成和分泌肾素, 通过自分泌、 旁分泌和胞内分泌的作用, 调节局部AⅡ的生成并发挥生理功能。
　　妊娠期间孕妇血液中非活性肾素(inactive renin or prorenin)明显升高^[2,3], 研究者认为非活性肾素来自卵巢和子宫蜕膜^[4,5]。 Shaw等人^[6]选择子宫外孕妇女的子宫蜕膜, 确切地证明妊娠早期人子宫蜕膜有肾素活性及肾素mRNA的表达,他提出人子宫蜕膜是产生肾素的重要部位。
　　胚泡着床和妊娠维持涉及到胚泡与母体子宫内膜之间复杂的相互作用。 已有实验证明子宫局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)调节子宫内膜蜕膜化反应^[8]、 子宫血管通透性和血流量^[9], 以及子宫血管新生^[10]。
　　近来的研究表明, 人子宫内膜及内膜血管均存在性类固醇激素受体^[11], 也有较丰富的AⅡ^[10]。　本文研究了妊娠早期人子宫蜕膜活性肾素含量的变化及孕酮对活性肾素分泌的调节, 以期说明性类固醇激素作用于子宫内膜的性类固醇激素受体, 调节肾素合成与分泌, 影响AⅡ的表达, 导致内膜血管功能变化, 为子宫内膜血管床调节机制提供实验依据。

1　材料和方法
1.1 　实验材料　妊娠早期人子宫蜕膜组织(孕5～9周)取自健康妊娠流产者, 孕周龄依孕妇主诉与医生诊断确定。 新鲜蜕膜组织用冷生理盐水洗净后收入含199培养液的取材瓶中, 立即放入冰壶中带回实验室。 在冰浴中将组织分成约100 mg 重的组织块, 将水吸干、 称重、 编号, 立即保存于－20℃ 冰箱中。
1.2　试剂与药品　　A　Ⅰ放射免疫测定药盒由北京北方生物技术公司生产, 苯甲基磺酰氟(PMSF)、 牛血清白蛋白、 噻唑蓝、 孕酮与雌激素均购自Sigma公司, 胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂为中国科学院上海生物化学所东风生化技术公司产品, F12 与DMEM培养剂购自GIBCO, 胶原酶购自宝灵曼公司(Boehinger Mannheim)。
1.3　双侧去肾大鼠血浆的制备　　雄性SD大鼠, 体重250～300 g, 购自中国科学院动物研究所饲养室。 在乙醚麻醉下行双侧肾脏切除术 48 h 后断头取血。 将血放入肝素化的离心管中离心(3?000 r/min, 30 min, 4℃), 分离出血浆。 将所有动物的血浆收集在一个容器中, 混匀, 分装于试管中, －20℃储存, 用作测定肾素活性的底物。
1.4　活性肾素的测定参照Nahamaru等人^[13]的方法提取人子宫蜕膜中的肾素, 简述如下。 蜕膜组织在冰浴中解冻, 按组织湿重与提取液之比1∶6(重量∶体积)加入提取液(0.01 mol/L PBS, pH 7.2)。 组织匀浆后, 离心(37?000 g, 30 min, 4℃), 收集上清液, 储存于－20℃冰箱中, 用于测定活性肾素的含量。
　　肾素的活性是用在特定条件下其水解底物生成产物(A　Ⅰ)的速度来表示。 在孵育管中依次加入0.1 mol/L PBS (pH 6.5)、 组织提取液、 底物 (NPXP), 总孵育体积为600 μl (内含6 mmol/L EDTA 和1 mmol/L PMSF)。 混匀后平分为A、 B两管, A管在冰浴中, B管在37℃恒温振荡水浴中孵育1 h, 然后将反应管立即置于－20℃, 终止反应, 其产物A　Ⅰ的含量用放射免疫分析方法测定。 B管与A管生成的AⅠ量之差即为样品活性肾素的含量(单位: ng A　Ⅰ/gww^.h^-1)。
1.5　非活性肾素的测定参照Dzau等人^[14]的方法, 略加改进, 其原理为非活性肾素可被胰蛋白酶激活转化成活性肾素, 用1.4的方法可以测定组织总肾素含量, 总肾素含量与活性肾素量之差即为该组织非活性肾素的含量。
　　方法简述如下: 将组织提取液180 μl 和胰蛋白酶20 μl (10^-4～4 mg/ml, 含0.5% BSA)加入孵育管中, 在37℃恒温振荡(90次/min)水浴中孵育1 h, 立即加入20 μl 胰蛋白酶抑制剂(10 mg/ml)终止反应, 测定各孵育管中组织提取液的肾素活性。
1.6　人子宫蜕膜细胞培养　　实验选用妊娠6～7周的人子宫蜕膜, 组织首先用含2％葡萄糖的磷酸缓冲液(pH 7.4)洗3～4次, 剪成约1 mm³ 大小的组织块。 用0.1%胶原酶在37℃消化2～4 h, 然后加入deoxyribonuclease Ⅰ (1∶80)继续消化15 min, 用120目不锈钢筛过滤, 弃去未消化的组织, 收集滤液, 离心(1?500 r/min, 7 min), 弃去上清, 收集细胞。 把细胞放入20～30 ml 0.84%氯化铵溶液中, 在冰浴放置15 min 使红血球裂解, 再用FD培液(F12∶DMEM＝1∶1)洗2次去除裂解的红血球。 所得蜕膜细胞经2％胎盼蓝(trypan blue)染色, 检查活细胞的比例与计数。 所得细胞加入含7％胎牛血清的FD培液中, 种植于24孔细胞培养板上, 每孔种5×10⁵个细胞, 培养在37℃、 含5％　CO₂的培养箱中。
　　细胞培养2 d 后更换培养液。 对照组加入FD培液, 实验组加入含10^-9～10^-6 mol/L孕酮的FD培养液, 继续培养。 在连续培养12 d 期间, 每2天换一次培液, 培液均收集并保存于－20℃, 用于测定细胞活性肾素的分泌量, 同时观察细胞生长情况。
1.7　数据处理　　肾素活性以平均值±标准误差 (±s) 表示。 各组之间变异的比较采用 t检验, P<0.05 被认为有显著差异。

2　结果
2.1　妊娠早期人子宫蜕膜组织活性肾素含量的变化
　　按孕周龄将蜕膜分成5组: (1)孕5周组, 4例; (2)孕6周组, 18例; (3)孕7周组, 5例; (4)孕8周组, 6例; (5)孕9周组, 6例。 如表1所示, 在妊娠5周的蜕膜中已检测到活性肾素, 其含量为23.22±6.95 ng A　Ⅰ/gww^.h^-1,妊娠7周时活性肾素明显增加, 其含量达 46.84±11.8 ng A　Ⅰ/gww^.h^-1, 与孕5周组比有明显差异(P<0.05)。 妊娠8周时活性肾素水平可达63.37±12.84 ng A　Ⅰ/gww^.h^-1, 与孕5周组比有极显著差异(P<0.01), 此后开始下降, 维持在孕5～6周时的水平。

表 1　妊娠早期人子宫蜕膜活性肾素含量的变化

Table 1　Changes of active renin in human decidua during first trimester of gestation

Weeks of gestation	n	Renin activity (±s) ng A　Ⅰ /gww^.h^-1	P value　 vs 5 W
5	4	23.22±6.95	-
6	18	22.37±3.53	>0.05
7	5	46.84±11.18	<0.05
8	6	63.37±12.84	<0.01
9	6	24.47±6.36	>0.05

2.2　妊娠早期人子宫蜕膜中活性肾素与非活性肾素的比例
　　以加入孵育液中的胰蛋白酶浓度为横坐标, 被胰酶活化后人早孕蜕膜肾素活性增加的百分率即肾素活性改变率为纵坐标作图(见图1)。 观察到, 当胰酶浓度为10^-4～10^-2 mg/ml时, 蜕膜提取液中非活性肾素被转变为活性肾素的量随酶浓度增加变化不显著; 当胰酶浓度增加到0.1 mg/ml时, 随酶浓度增加, 组织非活性肾素被转变为活性肾素的量成正比增加; 当胰酶浓度达2 mg/ml时, 非活性肾素被转化量达最大值, 此时所测蜕膜组织肾素活性为蜕膜组织中活性肾素与胰酶使非活性肾素转变为活性肾素的总和, 即为总肾素量。
　　测定妊娠早期人子宫蜕膜组织活性肾素与非活性肾素占总肾素的比例, 结果如表2所示。 结果表明, 活性肾素占(24.4±2.7)%, 非活性肾素占(75.6±2.7)% (n＝3)。

图　1　胰酶浓度对人早孕子宫蜕膜非活性肾素活化的影响

Fig.1　Effect of trypsin concentration on renin activity in human decidua during early pregnancy

2.3　人早孕蜕膜细胞活性肾素的基础分泌
　　培养的蜕膜细胞, 每2天更换一次培养液, 测定每2天培液中活性肾素的含量。 每次换培液时, 观察细胞生长情况。 蜕膜细胞培养中, 基质细胞是主要细胞类型, 上皮细胞少于10%, 连续培养12 d, 细胞生长良好, 形态无异常变化, 细胞活性肾素分泌量仍维持较高水平。 从图2可以看出, 培养的前4天细胞分泌活性肾素量较低, 第6天以后分泌量明显增加, 第8天达峰值, 与第2天相比有极显著差异(P<0.001), 第8天后活性肾素分泌量有所降低, 直到第12天仍比第2天时高, 两者之间有显著差异(P<0.01)。

图　2　人早孕子宫蜕膜细胞活性肾素的基础分泌

Fig.2　The active renin secretion in human decidual cells at early pregnancy
n=4. ^**　P<0.01,^***　P<0.001, compared with d 2.

表 2　人早孕子宫蜕膜组织中活性肾素与非活性肾素的比率

　 　Table 2　Concentrations of active and trypsin activated renin (ng A　Ⅰ/gww^.h^-1) in
human decidual tissue at early pregnancy

Group	Active	%^*	Trypsin-activated	%^#
1	13.55	20.6	52.25	79.4
2	26.32	23.1	87.72	76.9
3	16.65	29.6	39.68	70.4

^*Average 24.4±2.7; ^#average 75.6±2.7.

2.4　孕酮对蜕膜细胞活性肾素分泌的影响
2.4.1　作用时间曲线　　对照组仅加入FD培液, 实验组加入10^-6 mol/L孕酮, 分别测定蜕膜细胞活性肾素分泌量与培养时间的关系。 从图3可以看出, 实验组活性肾素含量在第4天即开始升高, 第8天达峰值, 此后虽稍有下降, 但仍有较高水平的分泌。 比较相同时间点实验组与对照组活性肾素的含量。 结果表明: 第4天时实验组与对照组比有显著差异(P<0.05); 第6天与第8天时实验组活性肾素水平虽然高于对照组, 但无显著差异; 第10天时对照组活性肾素含量开始降低, 此时两组相比有显著差异(P<0.05); 培养至第12天, 两组活性肾素分泌量有极显著差异(P<0.01)。

图　3　　孕酮对蜕膜细胞肾素分泌的影响

Fig.3　Effect of progesterone (10^-6 mol/L) on secretion of active renin in decidual cells at 4, 10 and 12 days of cultivation
n=4. ^**　P<0.05, ^***P<0.01, compared with control.

2.4.2　作用剂量效应　　实验组加入10^-9～10^-6 mol/L孕酮, 测定给予孕酮后第2～8天(即连续培养的第4～10天)培液中活性肾素的含量, 结果见图4。 细胞培养2 d 后, 加入不同剂量的孕酮。 给予孕酮后第2天(即连续培养第4天), 低剂量孕酮对蜕膜细胞活性肾素分泌无明显作用, 高剂量孕酮则有刺激作用, 加入10^-7与10^-6 mol/L孕酮的实验组与对照组比有显著差异(P<0.05)。 给予孕酮后第4、 6天(即连续培养的第6、 8天), 蜕膜细胞活性肾素水平仍高于对照组, 但两者之间无明显差异。 给予孕酮后第8天(即连续培养的第10天), 此时高剂量孕酮(10^-6 mol/L)显著刺激蜕膜细胞活性肾素的分泌, 与对照组相比有显著差异(P<0.05)。

图　4　不同孕酮浓度对蜕膜活性肾素分泌的影响

Fig.4　Effect of 10^-9～10^-6 mol/L progesterone on active renin release in decidual cells at early pregnancy
n=4. ^**　P<0.05, compared with control.

3　讨论
　　肾素活性的大小是用其催化血管紧张素原生成A　Ⅰ的反应速度来表达的。 肾素活性测定受到多种因素的影响, 实验中我们严格控制反应温度和孵育液的pH值, 同时测定了反应时间对产物浓度的影响及底物浓度对反应速度的影响, 选择了最佳反应时间与过量底物浓度, 保证了肾素活性测定的准确性。 由于非活性肾素在深低温条件下可以被激活转变为活性肾素^[15], 实验中被测样品只冻融一次。
　　许多研究都证明了哺乳动物子宫中存在肾素, 并认为子宫肾素的生理生化性质与肾脏产生的肾素相似^[16], Vallarino等人^[17]却发现子宫肾素和肾源性肾素的米氏常数和等电点不同。 Dzau^[14] 等人运用亲和层析柱纯化子宫肾素, 并证明子宫肾素与肾脏产生的肾素是同源的。 妊娠期间子宫肾素明显升高, 而肾源性肾素的水平却没有变化。 对妊娠早期人子宫蜕膜肾素的研究很少, 活性肾素在妊娠早期的动态变化也不清楚。 蜕膜组织中有活性与非活性肾素, 只有活性肾素具有蛋白水解酶的活性, 可以特异地使血管紧张素原水解生成血管紧张素Ⅰ, 启动子宫局部 RAS 的一系列生化反应。 本实验结果表明: 妊娠早期人子宫蜕膜有高水平的活性肾素, 从妊娠5～8周蜕膜活性肾素的含量逐渐增加, 妊娠8周时达峰值, 以后逐渐降低。
　　人子宫内膜中活性肾素占总肾素的10％^[19]。 我们的实验结果表明, 妊娠早期(妊娠6～7周)子宫蜕膜活性肾素含量占总肾素的24.4%, 说明妊娠导致子宫局部肾素合成与分泌变得活跃。 早孕子宫蜕膜中肾素的生理作用还不清楚, 由于肾素含量的变化可以调节组织AⅡ的水平, AⅡ在子宫基质细胞蜕膜化^[8]和血管新生^[10]中发挥着重要作用; 此外, 子宫肾素还参与对子宫血流量和PGs合成的调节^[20]。
　　人早孕子宫蜕膜组织中有高水平的肾素, 蜕膜细胞在离体培养条件下也可以合成与分泌活性肾素, 我们近来的工作(未发表资料)又观察到人早孕蜕膜组织中有免疫活性的 AⅡ 和 AⅡ 受体。 人子宫内膜和蜕膜中是否存在一个完整的局部 RAS 已引起研究者们的关注。
　　子宫内膜血管不同于成体内大部分血管, 具有对生殖激素作用的敏感性和在激素作用下的易变性, 胚泡着床和妊娠过程中子宫内膜血管将发生断裂与新生。 孕酮是维持妊娠最关键的生殖激素之一, 研究孕酮对蜕膜细胞活性肾素合成与分泌的调节, 对了解性类固醇激素如何调节子宫血管床是必要的。 从结果看, 孕酮的调节作用和细胞活性肾素基础分泌水平密切相关, 当细胞活性肾素基础分泌量较低时, 孕酮显著刺激活性肾素的合成与分泌, 当活性肾素基础分泌量较高时, 孕酮的作用变得不明显。 孕酮的作用是调节蜕膜细胞活性肾素, 使其维持在一个较高而又相对稳定的水平。 此结果证明, 孕酮与子宫局部RAS的作用密切相关, 孕酮对子宫蜕膜活性肾素分泌的调节有利于保证子宫局部血管功能的稳定性。
　　实验中还观察到, 只有高剂量的孕酮才明显刺激蜕膜细胞活性肾素的合成与分泌, 高剂量孕酮可以下降性调节孕酮受体^[21]。 Wang JD等人^[22]运用免疫组织化学方法证明: 人早孕子宫蜕膜基质细胞中典型发生蜕膜化的细胞, 胞浆中有丰富的胎盘催乳素(PRL)染色颗粒, 细胞核中孕酮受体表达量较低; 而那些没有蜕膜化的基质细胞, 细胞核呈现孕酮受体的强阳性染色, 细胞浆中却没有检测到PRL。 PRL是子宫内膜基质细胞发生蜕膜化反应的重要指标, 可见孕酮受体下降性调节与基质细胞蜕膜化同时发生, 当蜕膜细胞孕酮受体降低时, 活性肾素水平明显升高。 基质细胞活性肾素水平升高是否可以作为基质细胞蜕膜化的指标之一,　还应进一步探讨。

　　庄临之教授指导蜕膜细胞培养, 焦丽红老师协助技术工作, 特此致谢。

^*?国家自然科学基金 (No.39690761) 和美国洛氏基金会 (RF94025^#30) 资助项目
^**?联系作者
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39690761) and Rockefeller Foundation Grant (RF94025^#30)
^**?Correspondence to Prof. Wang Hong． State Key Lab of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Academia Sinica, 19 Zhongguacun Road, Haidian District, Beijing 100080, China. Fax: 011-8610-6256-5689.

作者单位:闫建设　郭椋昊　刘　疆　王　红　中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室, 北京 100080

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1998-04-03收稿　　1998-06-09修回