组胺对大鼠小脑皮层
浦肯野细胞的兴奋作用*

田　乐　温云卿　李红召　熊化保^*　*　王建军^*　*　*

摘　要　　在离体大鼠小脑脑片上观察了组胺对小脑皮层第Ⅹ小叶浦肯野细胞的作用。 组胺(3～100 μmol/L)主要引起浦肯野细胞的兴奋反应(94.4%, 51/54), 在少数细胞上也观察到组胺所引起的放电抑制现象(5.6%, 3/54)。 用低Ca²⁺/高Mg²⁺人工脑脊液灌流脑片, 不能取消浦肯野细胞对组胺的兴奋反应(n=4)。 H₂受体对抗剂ranitidine (0.1 ～5 μmol/L) 能够阻断浦肯野细胞对组胺的兴奋反应(n=20), 而H₁受体对抗剂triprolidine (0.5～5 μmol/L)不能够(n=9)或仅轻微地(n=4)阻断浦肯野细胞对组胺的兴奋反应。 这些结果提示, 组胺可能主要通过H₂受体的介导对浦肯野细胞起兴奋性调节作用, 下丘脑-小脑组胺能神经通路可能参与了小脑的某些躯体的和非躯体的功能调节。
关键词: 组胺; 小脑浦肯野细胞; 下丘脑-小脑组胺能纤维; 小脑脑片
学科分类号: Q426

THE EXCITATORY EFFECTS OF HISTAMINE ON
CEREBELLAR CORTICAL PURKINJE CELLS IN THE RAT^*

TIAN　LE，　WEN　YUN-QING，　LI　HONG-ZHAO，
XIONG　HUA-BAO^*　*，　WANG　JIAN-JUN^*　*　*
(Department of Biological Science and Technology, Nanjing University, Nanjing 210093;
^*　*Department of Molecular Neurobiology, Brain Research Institute, Niigata University, Japan)

ABSTRACT

　　The effects of histamine on Purkinje cells (PCs) in lobule Ⅹ of cerebellar cortex were investigated in rat cerebellar slices. Histamine elicited PCs′ responses predominately excitatory (94.4%, 51/54), only few inhibitory (5.6%, 3/54). The excitatory re～sponse could not be abolished by perfusing the slices with low Ca²⁺/high Mg²⁺ medium. The excitatory response of PCs to histamine could be blocked by histamine H₂ receptor antagonist ranitidine, but not by H₁ receptor antagonist triprolidine readily. These results suggest that histamine exerts an excitatory effect on the PCs via H₂ receptors. Presumably, hypothalamo-cerebellar histaminergic fibers participate in the regulation of somatic and non-somatic functions of the cerebellum.
Key words: histamine; cerebellar Purkinje cell; hypothalamo-cerebellar histaminergic fibers; cerebellar slice

　　组胺作为一种神经递质或调质的概念已经确立。 免疫组织化学的研究表明, 中枢组胺能神经元的胞体主要集中在下丘脑的结节乳头核, 其纤维广泛地投射到不同脑区^[1]。 在小脑中也发现有来自于下丘脑的组胺能神经纤维, 它们广泛地分布于小脑皮层和小脑核团, 以蚓部和绒球小结叶最为密集, 从而构成了下丘脑-小脑组胺能神经通路^[1,2]。 放射配体标记和分子生物学研究证实, 大鼠小脑皮层及小脑核团均存在组胺H₁和H₂受体^[1,3]。 目前, 对组胺能传入纤维在小脑机能活动中的作用还不清楚。 我们先前的工作证明, 组胺可以调制小脑苔状纤维传入系统接替神经元颗粒细胞的电活动^[4]。 本实验旨在观察组胺对小脑皮层主神经元浦肯野细胞(Purkinje cell, PC)电活动的影响和介导组胺对PC作用的受体机制, 以了解下丘脑-小脑组胺能纤维在小脑皮层机能活动中的作用。
　　15只SD大鼠(体重200～300 g)在乙醚麻醉下被断头并取出小脑。 小脑组织块经冷冻人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)冲洗后, 用振动切片机切取350～400 μm厚蚓部矢状脑片。 将脑片移入记录浴槽中孵育30 min后开始实验。 记录浴槽中持续地灌流ACSF[(33±0.2）℃, pH7.4, 流量2～3 ml/min], 并通以95% O₂和5% CO₂混合气。 ACSF中各溶质的浓度(mmol/L)分别为: NaCl 124, KCl 5, MgSO₄ 1.3, KH₂PO₄ 1.2, NaHCO₃　26, CaCl₂ 2.4, glucose 10。 在部分实验中使用了低Ca²⁺/高Mg²⁺ ACSF灌流脑片, 以阻断突触前神经纤维的递质释放, 此液的Ca²⁺浓度为0.25 mmol/L, Mg²⁺为4.0 mmol/L^[4]。
　　用玻璃微电极(内充2 mol/L NaCl, 直流阻抗2～3 MΩ)在小脑皮层第Ⅹ小叶细胞外记录PC的单位电活动。 待细胞的自发放电稳定之后, 向记录浴槽灌流组胺(美国RBI公司, 3～100 μmol/L, 持续1 min), 并观察PC放电活动的变化。 在部分对组胺产生反应的细胞上, 进一步观察高选择性的组胺H₁受体对抗剂triprolidine(美国Sigma公司, 0.5～5 μmol/L)和高选择性的组胺H₂受体对抗剂ranitidine(RBI公司, 0.1～5 μmol/L)对组胺所引起的PC放电活动变化的影响。 在使用这两种组胺对抗剂的实验中, 受体对抗剂要在灌流组胺前预先持续地灌流脑片15 min。 所有药物均用ACSF新鲜配制。 PC的放电信号经放大并由窗口甄别器转换成标准矩形脉冲后, 输入计算机作刺激后时间直方图(采样bin宽1 s), 以评价药物对细胞的作用。 数据的统计学处理用t测验。

图　1　　PC对组胺的兴奋反应以及ranitidine和triprolidine对PC兴奋反应的阻断作用

Fig.1　Excitatory responses of a PC to histamine and antagonistic effects of ranitidine and triprolidine on the histamine-induced excitatory responses
A. Excitatory responses of the PC to histamine in normal ACSF． B and C. Responses of the PC to histamine when the slice was equilibrated with ACSF containing ranitidine and triprolidine respectively． D. Dose-response curve showing the effects of histamine on the discharge rate of PC perfused with normal ACSF and the ACSF containing histamine receptor antagonists． The horizontal bars and numerals above each histogram indicate the 1 min period and the concentration (μmol/L) of histamine application respectively．

1.　PC的自发放电活动及其对组胺的反应
　　28张脑片上记录的56个PC单位电活动呈规则的紧张性自发放电, 频率为5.08～41.58 Hz。 此外, 也有少数细胞呈现阵发性放电活动。
　　上述56个PC在给予组胺(3～100 μmol/L)后, 有54个细胞 (96.4%, 54/56)的放电活动发生变化。 在这54个细胞中, 51个(94.4%, 51/54)产生兴奋反应(图1A), 其余3个(5.6%, 3/54)出现放电抑制现象(图2)。 还在4个产生兴奋反应的PC上观察了它们在低Ca²⁺/高Mg²⁺ ACSF环境中的自发放电和对组胺的反应。 结果表明, 这4个细胞的自发放电频率及其对组胺的反应与它们在正常ACSF环境中的情况相比无统计学差异(图3)。

图　2　PC对组胺的抑制反应
Fig.2　Inhibitory responses of a PC to histamine

图　3　PC在正常和低Ca²⁺/高Mg²⁺ ACSF环境中对组胺的兴奋反应

Fig.3　The excitatory responses of a PC to histamine in normal and low Ca²⁺/high Mg²⁺ ACSF
The arrow indicates the moment when normal ACSF was replaced by low Ca²⁺/high Mg²⁺ medium．

2.　H₁和H₂受体对抗剂对组胺兴奋PC效应的阻断作用
　　我们进一步观察了高选择性的H₁受体对抗剂triprolidine和高选择性的H₂受体对抗剂ranitidine对组胺所引起PC兴奋反应的作用。 结果表明, ranitidine(0.1～5 μmol/L)可以显著地阻断PC对组胺的兴奋反应(n=20); 而triprolidine (0.5～5 μmol/L)仅可轻微地(n=4)或不能阻断(n=9)PC对组胺的兴奋反应。 如图1A～D所示, PC对浓度为5,10和30 μmol/L的组胺产生剂量依赖性兴奋反应(A和D); 而预先用ranitidine(0.2 μmol/L)处理脑片后, 该细胞对组胺的兴奋反应显著减小(P<0.05, B和D); 但用triprolidine(2 μmol/L)处理脑片后, 细胞对组胺的兴奋反应仅略有减小, 与对照实验相比未发生显著变化(C和D)。
　　我们先前的研究证明组胺可以调制小脑颗粒细胞的电活动^[4], 本研究进一步揭示组胺对小脑皮层PC的电活动主要起兴奋性调制作用, 提示下丘脑-小脑组胺能纤维在小脑的机能活动中起重要作用。 由于局部神经元环路在脑片制备中依然存在, 必须排除组胺经其它突触前神经元间接引起PC活动变化的可能性。 早已知道, 细胞外的低Ca²⁺/高Mg²⁺环境能够阻断神经细胞间的突触传递过程, 但低Ca²⁺/高Mg²⁺ACSF灌流液脑片不能取消PC对组胺的兴奋反应, 说明这些兴奋反应是由组胺对PC的直接作用所引起的。 另外, 我们也观察到少数PC(5.6 %, 3/54)对较高浓度的组胺出现放电活动的抑制(比较图1和图2), 但由于出现抑制反应的细胞数量太少, 我们未能利用低Ca²⁺/高Mg²⁺ ACSF和组胺受体对抗剂对这些细胞的抑制反应作进一步的分析, 因而组胺通过抑制性中间神经元间接引起PC放电活动减少的可能性尚不能排除。
　　我们的实验揭示, ranitidine可以显著地阻断PC对组胺的兴奋反应, 而triprolidine对组胺引起PC兴奋反应却无明显的阻断效应, 说明组胺对PC的兴奋作用主要是由H₂受体介导的。 我们的结果显然与H₁和H₂受体分别介导神经元对组胺的兴奋和抑制反应的一般认识相悖, 但我们和其他作者的研究表明, 组胺可以通过H₂受体的介导引起前庭内侧核细胞和延髓细胞的兴奋^[5,6]。 一些细胞内记录的研究揭示, H₂受体的激活可引起前庭内侧核细胞Ca²⁺激活的K⁺电导减小^[7,8]。 在海马CA1区锥体细胞上也观察到组胺可通过激活H₂受体而引起细胞膜的轻微去极化、 动作电位后超极化期的缩短和锋电位频率适应现象的丧失^[9]。 因此, 由H₂受体的激活而导致PC膜电位的去极化和放电频率的增加是可理解的。
　　组胺能传入纤维在小脑活动中的机能意义目前还不清楚。 形态学研究表明, 下丘脑-小脑组胺能纤维是以多层纤维(multi-layered fibers)弥散地分布于小脑皮层的三个亚层和小脑核团之中, 它们不与小脑神经元发生直接的突触联系^[2]。 根据组胺能传入纤维的这些形态学特征及其下丘脑的起源, 我们认为它们不负责向小脑传递特异性信息, 而可能像其它来自于脑干的小脑胺能传入纤维(如5-HT能)那样仅对小脑神经元的膜电位和基础放电水平起精细的调节作用^[10]。 显然, 组胺对PC的兴奋效应将有助于提高PC对苔状和爬行纤维特异性传入的反应敏感性, 从而影响小脑的感觉运动整合过程。 此外, 新近的神经解剖学研究揭示小脑与下丘脑之间存在交互的直接神经连接^[2], 我们新近的研究表明小脑-下丘脑通路参与了机体的内脏活动调节^[11], 因此下丘脑-小脑组胺能神经通路也可能作为小脑和下丘脑之间神经环路的一个组成部分而与机体的躯体-内脏反应整合活动密切相关。

^*?国家自然科学基金 (No.39570246,39770249)、 国家教委留学回国人员科研基金(No.95-135)和江苏省自然科学基金(No.BK97045)资助项目
^*?*　?现在地址: Department of Molecular Neurobiology, Brain Research Institute, Niigata University, Japan
^*　*?*　?通讯作者
^*This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (No.39570246, 39770249), a grant from the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No.BK97045), and a grant for scholars returning from overseas from the Education Ministry of China (No.95-135).
^*　*　* Corresponding author

作者单位:田　乐　温云卿　李红召　熊化保^*　*　王建军^*　*　*　南京大学生物科学与技术系, 南京 210093

参考文献

　[1]　Schwartz JC, Arrang JM, Garbrag M, et al. Histaminergic transmission in the mammalian brain. Physiol Rev, 1991, 71: 1～51.
　[2]　Dietrichs E, Haines DE, Rose GK, et al. Hypothalamocerebellar and cerebellohypothalamic projections: circuits for regulating nonsomatic cerebellar activity? Histol Histoph, 1994, 9: 603～614.
　[3]　Vizuete ML, Traiffort E, Bouthenet ML. Detailed mapping of the histamine H₂ receptor and its gene transcript in guinea-pig brain. Neuroscience, 1997, 80: 321～343.
　[4]　Tang XH, Wang JJ, Li WC, et al. Effects of histamine on the electrical activity of rat cerebellar cortical granule cells. Chin Sci Bull (科学通报), 1996, 41: 1992～1995.
　[5]　Wang JJ, Dutia MB. Effects of histamine and betahistine on rat medial vestibular nucleus neurones: possible mechanism of action of anti-histaminergic drugs in vertigo and motion sickness. Exp Brain Res, 1995, 105: 18～24.
　[6]　Jones H, Bradley PB, Roberts F. Histamine-induced excitation of spontaneously active medullary neurones in the rat brain is mediated by H₂-receptors. Neuropharmacology, 1985, 24: 1231～1239.
　[7]　Phelan KD, Nakamura J, Gallagher JP. Histamine depolarises rat medial vestibular nucleus neurons recorded intracellularly in vitro. Neurosci Lett, 1990, 109: 287～292.
　[8]　Serafin M, Khateb A, Vibert N, et al. Medial vestibular nucleus in the guinea-pig: histaminergic receptors: I. An in vitro study. Exp Brain Res, 1993, 93: 242～248.
　[9]　Haas HL, Greene RW. Effects of histamine on hippocampal pyramidal cells of the rat in vitro. Exp Brain Res, 1986, 62: 123～130.
　[10]　Gardette R, Crepel F. Differential modulation by serotonin of the responses induced by excitatory amino acid in cerebellar nuclei neurons and Purkinje cell. In: Trouillas P, Fuxe K, eds. Serotonin, the Cerebellum and Ataxia. New York: Raven Press, 1993, 225～236.
　[11]　Pu YM, Wang JJ, Wang T, et al. Cerebellar interpositus nucleus modulates neuronal activity of lateral hy～poth～alamic area. NeuroReport, 1995, 6: 985～988.

1998-04-01收稿　　1998-06-07修回