中脑导水管周围灰质内注射抗阿片肽血清
对神经降压素增强电针镇痛的影响

白　波　王　宏　刘文彦　宋朝佑*

摘　要　　本工作以钾离子透入引起大鼠甩尾反应作为痛反应指标, 观察纳洛酮(NX)和抗阿片肽血清对大鼠中脑导水管周围灰质(PAG)内微量注射神经降压素(NT)增强电针镇痛作用的影响。 结果显示: (1)PAG内微量注射NT后, 大鼠电针镇痛效应明显提高; (2)PAG内注射大剂量NX, 可以显著减弱NT增强电针镇痛效应; (3)PAG内微量注射抗甲-脑啡肽血清和抗β-内啡肽血清后, NT增强电针镇痛的作用明显降低; 而PAG内微量注射抗强啡肽A1-13 血清, 对于NT增强电针镇痛的作用并无明显影响。 提示: PAG内NT在针刺镇痛过程中发挥重要作用, NT增强电针镇痛的作用与甲-脑啡肽和β-内啡肽有较密切的关系。
关键词: 神经降压素; 中脑导水管周围灰质; 电针镇痛; 抗甲-脑啡肽血清; 抗β-内啡肽血清; 抗强啡肽A1-13 血清
学科分类号: Q426; R338.2

EFFECT OF ANTI-OPIOID PEPTIDE SERA
ON THE ENHANCEMENT OF ELECTROACUPUNCTURE
ANALGESIA INDUCED BY NEUROTENSIN IN PAG OF RATS

BAI　BO，　WANG　HONG，　LIU　WEN-YAN，　SONG　CHAO-YOU*
(Laboratory of Neurophysiology, Jining Medical College, Jining 272113；
*Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)

ABSTRACT

　　With the use of potassium iontophoresis induced tail-flick for measuring the pain threshold, the effects of injecting neurotensin (NT), naloxone (NX), anti-met-enkephalin serum (AMEKS), anti-β-endorphin serum (AEPS) and anti-dynorphin A1-13 serum (ADYNS) into periaqueductal gray (PAG) on electroacupuncture (EA) analgesia in rats were investigated. NT administration enhanced EA analgesia remarkably. Pre-injection of NX, AMEKS and AEPS into PAG could significantly attenuate the enhancement of EA analgesia induced by NT , but not by administration of ADYNS. The results indicate that NT in PAG is responsable for the enhancement of EA analgesia. The effect of NT may be partly mediated by met-enkephalin and β-endorphin.
Key words: neurotensin; periaquedutal gray; electroacupuncture analgesia; anti-met-enkephalin serum; anti-β-endorphin serum; anti-dynorphin A1-13 serum

　　近年来, 国内外有关神经降压素(neurotensin, NT)在中枢神经系统中参与镇痛和针刺镇痛过程的研究积累了大量资料[1～3]。 本实验室以往的工作也证实: 大鼠中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)内的NT在镇痛和电针(EA)镇痛过程中起重要作用[2,4]。 有资料显示, PAG内含有丰富的NT神经纤维、 NT受体, 和内源性阿片肽神经末梢及其受体的分布相伴行。 但对镇痛和电针镇痛时PAG内NT与内源性阿片肽系统之间关系的研究尚未见报道。 本工作向大鼠PAG内微量注射纳洛酮(NX)、 抗甲-脑啡肽血清(AMEKS)、 抗β-内啡肽血清(AEPS)和抗强啡肽A1-13血清(ADYNS)等, 观察它们对PAG内NT增强电针镇痛作用的影响, 探讨PAG内的NT和内源性阿片肽在痛觉调制过程中的关系。
　　实验用健康雄性Wistar大鼠(体重190～230 g)。 采用戊巴比妥钠(35 mg／kg)腹腔内注射麻醉。　根据L.J.Pellegrino鼠脑定位图谱, 借助江湾Ⅱ型脑立体定向仪, 按照坐标A-6.4、 LR0.5、 H5.0, 埋置外径0.6 mm的不锈钢导管, 之后用“502”胶和牙科水泥固定。 术后3～5 d 进行实验。 注射时将不锈钢注射管插入导管内, 尖端伸出管外1 mm, 注入药液1.0 μl, 3 min注射完毕。
　　按照常规方法固定大鼠30 min后, 开始实验。 用WQ-9E型钾离子透入痛阈测量仪测痛, 以引起大鼠甩尾的最小电流强度(mA)为痛反应值, 间隔1 min的3次痛反应的平均值作为痛阈(pain threshold, PT), 每10 min测定痛阈一次, 取电针或给药前两次痛阈的平均值作为基础痛阈。 将电针后各次痛阈和基础痛阈相比, 计算痛阈变化率(%)。 以30 min电针期间3次痛阈变化值的均数和停针后30 min内3次痛阈变化值的均数, 作为衡量电针镇痛的平均针刺效应(简称“平均针效”)。 利用WQ-6F电针仪电针大鼠双侧“足三里”, 给予疏密波(f1, 2 Hz; f2, 12 Hz), 强度以引起两后肢轻微颤动为准(1～3　V)。
　　实验结束后, PAG内注射等体积的氨基黑B10, 按照常规方法灌流、 取脑、 固定、 切片。 镜下观察, 凡定位点偏离PAG的标本, 其实验结果均弃之不用。
　　NT为美国Peninsula Lab产品, NX为美国Sigma公司出品。 AMEKS、 AEPS、 ADYNS以及正常兔血清(NRS)均为第二军医大学神经生物学教研室制备。 AMEKS、 AEPS、 和ADYNS的滴度分别为1∶5 000、 1∶30 000和1∶30 000, 相互间无交叉反应。
　　各组数据以均值±标准误(xx1.gif (881 bytes)±sxx1.gif (881 bytes))表示, 两组间显著性差异用t检验进行统计学处理。
　　实验结果如下:
1.　NT对电针镇痛的影响
　　右侧 PAG内注入100 ng NT 10 min后, 电针大鼠双侧“足三里”(NT-EA组), 在30 min电针期间平均针效为(196.96±11.43)%, 停针后30 min内为(102.71±9.06)%, 与 NS-EA 组相比, 均有非常明显的增高(P<0.01)。 注入25 ng和50 ng NT后电针期间, 大鼠平均针效分别为(57.25±8.44)%(P>0.05)和(110.38±10.28)%(P<0.01), 停针后30 min内平均针效分别为(25.49±6.21)%(P>0.05)和(52.26±10.82)%(P<0.01)。
2.　NX对NT增强电针镇痛作用的影响
　　右侧 PAG内注入10 μg NX后, 立即注入100 ng NT, 10 min后电针大鼠双侧“足三里”(NX-NT-EA组), 在30 min电针期间大鼠平均针效为(48.68±11.39)%, 停针后30 min内其平均针效为(24.72±9.34)%, 电针期间和停针后大鼠平均针效均明显低于 NT-EA 组(P<0.01)。 但 NX-NT-EA 组与 NX-NS-EA组相比, 电针期间和停针后, 大鼠平均针效仍有明显的增加(P<0.05～0.01)。
3.　AMEKS对NT增强电针镇痛作用的影响
　　PAG 内注入0.5 μl AMEKS 40 min后, 再注入NT(100 ng), 10 min后电针“足三里”(AMEKS-NT-EA组), 在30 min电针期间平均针效为(56.07±7.72)%, 停针后30 min内平均针效为(30.19±6.88)%, 与 NRS-NT-EA组相比, AMEKS-NT-EA 组在电针期间和停针后平均针效均有非常明显降低(P<0.01), 但是 AMEKS-NT-EA 组平均针效明显高于 AMEKS-NS-EA组(P<0.01)(图1)。

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图　1　AMEKS 对PAG内注射NT增强电针镇痛的影响

Fig.1　Effect of AMEKS on NT electroacupuncture analgesia induced by injecting NT into PAG of rats
□: NRS-NS-EA group(n=8), a.gif (165 bytes)?: NRS-NT-EA group(n=8),■: AMEKS-NT-EA group(n=8),b.gif (148 bytes) : AMEKS-NS-EA group(n=8).**　P<0.01 compared with NRS-NT-EA group; ##　P<0.01 compared with AMEKS-NS-EA group. NT, 100 ng; AMEKS, 0.5 μl.

4.　AEPS对NT加强电针镇痛作用的影响
　　PAG 内注入0.5 μl AEPS 40 min后, 再注入NT(100 ng), 10 min后电针“足三里”(AEPS-NT-EA组), 在30 min电针期间其平均针效为(54.67±7.55)%, 停针后30 min内平均针效为(33.92±4.56)%, 和NRS-NT-EA组相比, AEPS-NT-EA组在电针期间和停针后平均针效均有非常明显的降低(P<0.01), 但它与AEPS-NS-EA组相比, 平均针效增加非常显著(P<0.01)(图2)。

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图　2　　AEPS 对PAG内注射NT增强电针镇痛的影响

Fig.2　Effect of AEPS on enhancement of the electroacupouncture analgesia induced by injecting NT into PAG of rats
□: NRS-NS-EA group (n=8), a.gif (165 bytes)?: NRS-NT-EA group (n=8),■: AEPS-NT-EA group (n=8), b.gif (148 bytes)?: AEPS-NS-EA group (n=6).**　P<0.01 compared with NRS-NT-EA group; ##　P<0.01 compared with AEPS-NS-EA group. NT, 100 ng; AEPS, 0.5 μl.

5.　ADYNS 对NT加强电针镇痛作用的影响
　　PAG 内注入0.5 μl ADYNS 40 min后, 再注入NT(100 ng), 10 min后电针大鼠双侧“足三里”(ADYNS-NT-EA组), 在30 min电针期间其平均针效为(96.4±9.06)%, 停针后平均针效为(52.33±8.22)%, 和 NRS-NT-EA组相比动物平均针效无显著性变化(P>0.05), 而 ADYNS-NT-EA组的平均针效明显高于 ADYNS-NS-EA组(P<0.01), 但是 NRS-NS-EA组和 ADYNS-NS-EA组相比大鼠平均针效变化也没有统计学意义(图3)。

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图　3　　ADYNS 对PAG 内注射NT增强电针镇痛的影响

Fig.3　Effect of ADYNS on enhancement of the electroacupuncture analgesia in～duced by injecting NT into PAG in rats
□: NRS-NS-EA group(n=8); a.gif (165 bytes)?: NRS-NT-EA group(n=8);■: ADYNS-NT-EA group (n=8); b.gif (148 bytes)?: ADYNS-NS-EA group (n=6). *　*　P<0.01 compared with ADYNS-NS-EA group. NT, 100 ng; ADYNS, 0.5 μl.

　　我们以往的工作证实, 大鼠侧脑室及 PAG内微量注射NT后痛阈显著提高, 并明显增强电针镇痛作用。 而侧脑室和PAG内注射抗神经降压素血清(ANTS)后, 大鼠痛阈明显降低并削弱电针镇痛效应[2,4,5]。 我们的实验表明, 电针大鼠双侧“足三里”产生镇痛作用时, PAG内NT含量明显降低[4]。 提示PAG内NT在电针镇痛过程中发挥了重要作用。
　　研究表明, PAG内内源性阿片肽在针刺镇痛中发挥重要作用。 内源性阿片肽系统三个不同家族的神经元在PAG内均有分布, 且PAG内含有μ、 κ和δ型等多种阿片受体, 在脊髓中, μ、 κ和δ型受体共同参与痛觉调制[7] ; 在脑内μ受体介导了阿片样物质的镇痛效应, 但对脑内的δ受体是否也参与镇痛, 还有争论[6]。 NT在电针镇痛过程中和内源性阿片肽系统间的关系如何？ 这是十分令人感兴趣的问题。
　　本实验的结果表明, PAG内注射大剂量NX, 以阻断三种不同亚型的阿片受体, 能够明显削弱 (但不能完全阻断) NT增强电针镇痛的作用。 显示PAG内NT在电针镇痛中的作用, 至少部分效应可能是由内源性阿片肽系统中介的。 值得注意的是, 各种不同的阿片类物质虽然都具有程度不同的镇痛作用, 但其与阿片受体亚型的亲合力则有着明确的选择性, 在不同脑区的作用机制也有一定的差异。 此外, 大剂量的NX表现一定的药理学作用, 故用专一性更强的不同类型的拮抗剂来进一步分析PAG内NT与不同阿片肽之间的相互关系是十分必要的。 本实验利用PAG内微量注射不同的抗阿片肽血清的方法, 初步观察到, AMEKS及AEPS中和PAG内的内源性甲-脑啡肽和β-内啡肽后, NT增强电针镇痛的作用虽未完全消失, 但是降低非常明显; 而用ADYNS中和PAG内的内源性强啡肽A1-13后, 对NT增强电针镇痛作用无明显的影响。 提示PAG内的NT增强电针镇痛的效应与PAG内的内源性甲-脑啡肽和β-内啡肽有非常密切的关系, 而和强啡肽A系统没有密切关系。 至于PAG中NT与其它参与镇痛的内源性生物活性物质之间的关系怎样, 也是饶有兴趣的问题, 正在探讨中。

作者单位:白　波　王　宏　刘文彦　宋朝佑*　济宁医学院神经生理研究室, 济宁 272113;
*第二军医大学神经生物学教研室, 上海 200433

参考文献

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　[2]　Bai B (白 波), Liu WY (刘文彦), Wang H (王 宏), et al. Involement of dynorphin A1-13 in electroacupuncture analgesia induced by intrathecal neurotensin. Chin J Behav Med Sci (中国行为医学科学), 1995， 4 (2): 69～71 (in Chinese with English abstract)．
　[3]　Hylden JLK， Wilcox GL. Antinociceptive action of intrathecal neurotensin in mice. Peptides, 1983; 4: 520～527．
　[4]　Liu WY (刘文彦), Bai B (白 波), Song CY (宋朝佑), et al. The role of periaqedutal gray neurotensin in electroacupuncture analgesia. J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1997， 13 (3): 253～256 (in Chinese with English abstract)．
　[5]　Li H (李 和), Liang XG (粱勋广), Guan XM (关新民). The effect of electroacupuncture on the content of neurotensin in the dorsal horn of spinal cord of rats. Acupunt Res (针刺研究), 1991; 16 (3-4): 200～201 (in Chinese with English abstract).
　[6]　Zadina JE, Hackler L， Ge LJ. A potent and selective endogenous agonist for the μ opiate receptor. Nature, 1997; 386: 499～501.
　[7]　Bunzow JR, Saez C， Mortrud M. Molecular cloning and tissue distribution of a putative member of the rat opioid receptor gene family that is not a μ, δ, or κ opioid receptor. FEBS Lett, 1994; 347: 284～288.

1998-03-02收稿　　1998-04-27修回