UV-C照射诱导体外血管平滑肌
细胞凋亡模型的建立

李晓丹　李　进^?*

摘　要　　应用常规细胞培养超净台紫外消毒灯(220 W, 220 V, 50 Hz)发射的UV-C波段的紫外光源(254 nm), 垂直照射距离其10 cm 处的大鼠主动脉平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs), 发现经照射后细胞出现典型的凋亡形态学改变, 如细胞变圆、 染色质浓缩、 细胞膜出泡、 出现凋亡小体等; 细胞面积、 核面积及核/胞面积比均显著降低; 且提取细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳呈现梯状图谱。 从形态学和生化指标方面证明了UV-C照射可诱导体外血管SMCs凋亡。 此方法可作为进一步研究SMCs凋亡的内在调控机制的一个简便、 稳定、 可靠的模型。
关键词: 平滑肌细胞; 细胞凋亡; 紫外线; 动脉粥样硬化
学科分类号: Q2-33

ESTABLISHMENT OF AN APOPTOSIS MODEL OF
VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS INDUCED BY
ULTRAVIOLET-C RADIATION IN VITRO

LI　XIAO-DAN，　LI　JIN^?*
(Department of Internal Medicine of Guangzhou Medical College, PLA, Guangzhou 510315)

ABSTRACT

　　After a 10-min exposure to 254 nm UV-C radiation, aortic SMCs of rat were found to undergo apoptosis, characterized by cell shrinkage, condensation of cytoplasm, membrane blebbing, appearance of apoptotic body and DNA ladder in the agarose gel. Therefore, UV-C radiation can be used to generate a useful model for the investigation of the molecular regulatory mechanisms underlying SMCs apoptosis.
Key words: smooth muscle cells; apoptosis; ultraviolet; atherosclerosis

　　动脉中膜平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)向内膜迁移并大量增生被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的核心病理过程。 近年来发现, SMCs的凋亡也参与了AS的发生和发展, 无论在正常血管调节数量平衡, 还是在早期血管损伤方面及在血栓性病变的发生过程中, SMCs的凋亡均起了重要作用。 但目前对SMCs凋亡的研究尚属起步。 本文应用紫外线-C(ultraviolet C, UV-C)波段照射诱导体外SMCs凋亡, 在形态学和生化指标方面进行凋亡的检测, 以期为今后进一步从细胞、 亚细胞和分子水平深入研究SMCs凋亡的内在调控机制提供一个简便、 稳定、 可靠的模型。 现将本方法简要介绍如下。
　　体外血管SMCs培养及鉴定^[1]　　选定重约150～200 g的成年SD大鼠, 无菌条件下取出胸主动脉, 剥离中膜, 参照传统的组织贴块法进行SMCs原代及传代培养, 应用SP免疫组织化学方法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SM actin)的表达。
　　UV-C诱导体外SMCs凋亡模型的建立　　取第4～7代生长良好的SMCs, 胰蛋白酶消化, 以10⁵/ml浓度接种于直径60 mm的培养皿上。 48 h后待细胞完全贴壁生长良好时吸去培养基, 清洗2～3次。 之后以0.5 ml D-Hank′s液湿润皿底, 垂直置于细胞培养超净台之UV-C紫外光源下10 cm处, 打开皿盖, 照射10 min,照射过程中须保持皿底湿润不干燥。 照射后加10% DMEM培养基, 置5% CO₂孵箱中继续培养, 动态观察细胞形态变化。
　　UV-C诱导体外SMCs凋亡的形态观察　　将4～7代常规传代的大鼠SMCs接种在置于培养皿内的盖片上生长。 48 h后待细胞贴壁良好后, 依上述方法应用UV-C照射。 然后加入培养基继续培养, 动态观察细胞形态变化。 并于照射后24、 48 h取出盖片, 行HE染色, 光镜下观察。
　　UV-C诱导体外SMCs凋亡的形态计量学研究　　接种细胞于盖片上, 依上法应用UV-C照射。 取照射后24、 48 h及未照射的相应对照组细胞切片各4张, 用D-Hank′s液冲洗2～3次, 自然干燥, 再用纯丙酮固定10 min。 每张切片测定5个视野, 每个视野测定10个细胞, 4张盖片共20个视野、 200个细胞。 以每个视野为单位(n值), 用Quantimet 520⁺图像分析仪进行场测量, 选择细胞面积(cellular area, CA)、 核面积(nuclear area, NA)及其两者的比值(ratio of area, RA)为定量参数。 此3项参数关系如下式:

　　统计学处理　　各组定量检测所得结果以均数±标准差(±s)表示, 进行两样本均数比较的t检验, 用SPLM软件(第四军医大学卫生统计学教研室研制)在微机上进行处理。
　　实验分组　　正常对照组(Control); 照射组(UV-C)．
　　生化指标检测　　细胞DNA提取及凝胶电泳: 依上述方法, 应用UV-C照射体外培养的SMCs, 分别于照射后24、 48 h离心收集细胞, 1?000 r/min离心5 min, 去上清液, 用4 ml PBS重悬细胞, 置于50℃水浴箱内。 超过3 h, 至看不见絮状物时, 加平衡酚500 μl抽提, 上下颠倒数次, 充分混匀, 6?000 r/min离心5 min, 取上清液, 加氯仿-异戊醇(24∶1)500 μl 抽提, 上下颠倒数次, 充分混匀, 6 000 r/min离心5 min, 取上清液, 加入3　mol/L乙酸钠50 μl及无水乙醇1 ml混匀, －20℃过夜, 1?000 r/min离心10 min收集沉淀, 弃上清液, 真空抽干, 溶入100 μl TE缓冲液中, 加RNase 5 μl, 37℃水浴30 min, 点样1.5%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外灯下观察DNA图谱。
　　实验结果如下:
1.　体外SMCs的培养
　　参照传统的组织贴块法进行体外SMCs培养, 所得细胞生长状态具典型“峰与谷"结构, 用SP免疫组织化学方法观察细胞内α-SM actin表达阳性, 证明所得细胞为SMCs。
2.　UV-C照射后SMCs形态学变化和形态计量学研究
2.1　形态学变化　　UV-C照射后, 约3 h细胞体积开始缩小, 12 h部分细胞开始变圆、 上浮, 随时间推移上浮细胞逐渐增多。 24 h将爬片生长的细胞用HE染色, 光镜下观察可见典型的凋亡形态学改变: 细胞体积变小, 胞质收缩、 深染, 核染色质浓缩, 聚集于核膜下呈境界分明的颗粒块状小体, 细胞形态完整。 48 h可见多数细胞表现同24 h, 亦可见部分细胞膜出泡; 72 h可见细胞膜包裹碎裂的核成为凋亡小体(见图1)。

图　1　A. 正常大鼠的SMCs; B.　UV-C照射后24 h的SMCs；C. UV-C照射后72 h SMCs出现的凋亡小体

Fig.1　A. Normal SMCs (HE staining; scale bar: 25 μm).B. Cell shinkage and condensation of cytoplasm and chromatin of SMCs at 24 h after exposure to UV-C (HE staining; scale bar: 50 μm). C. Appearance of apoptotic body in SMCs at 72 h after exposure to UV-C (HE staining; scale bar: 25 μm).

2.2　图像分析定量参数统计结果　　正常的、 经UV-C照射后24、 48 h大鼠主动脉SMCs的细胞面积(CA)、 核面积(NA)及核/胞面积比(RA)的变化见表1。

表 1　UV-C照射后SMCs的CA、 NA和RA的变化值

Table 1　Changes in CA, NA and RA after exposure to UV-C

	CA /μm^2		NA ／μm^2		RA ／%
	Time after exposure to UV-C		Time after exposure to UV-C		Time after exposure to UV-C
	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h
Control	2272.045± 　403.674	2187.432± 　303.572	244.707± 　29.770	247.534± 　22.691	10.9± 　0.9%	10.7± 　0.6%
UV-C	954.063± 110.940^**	665.985± 　77.226^**	83.861± 　5.003^**	47.788± 　2.787^**	8.8± 　0.6%^**	7.2± 　0.5%^**

^*　*　P<0.01 as compared with control. CA: cellular area; NA: nuclear area; RA: ratio of area.

　　与正常对照组比较, UV-C照射后24、 48 h实验组的CA、 NA、 RA均显著减小(P<0.01), 实验组24、48 h的CA、NA、RA亦有显著差异(P<0.01)。说明UV-C照射体外SMCs可造成细胞体积缩小、 核皱缩, 且随时间推移有加重的趋势, 细胞核的面积较细胞面积下降略快, 核/胞比从(10.9±0.9)%(control)降至(8.8±0.6)%(24 h)和(7.2±0.5)%(48 h)。
2.3　生化指标检测　　于UV-C照射后24、 48 h分别提取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，　结果见图2。 经UV-C照射后24、 48 h的细胞DNA图谱为180～200 bp 或其倍数的亚单位片段, 呈梯状(ladder), 未经处理的正常细胞其DNA图谱不呈梯状带, 说明经UV-C照射后SMCs的DNA在核小体联接部发生了断裂。

图　2　　SMCs 的DNA图谱
Fig.2　DNA ladder of SMCs
1. 24 h after exposure to UV-C; 2. Control; 3. 48 after exposure to UV-C; 4. Molecular mark.

　　紫外线根据波长可分为3种: UV-A(320～390 nm); UV-B(280～320 nm); UV-C(小于280 nm), 细胞内DNA对紫外线的吸收波段在240～310　nm之间, 于260　nm处吸收最大, 属于UV-C波段范围, UV-C光子能量高, 可迅速引起大量损伤。 常规使用的细胞培养超净台紫外线消毒灯发射出波长为254 nm的紫外线, 属于UV-C波段范围, 许多学者应用此来源的UV-C研究动植物细胞、 细菌等的紫外线辐射损伤。 此法方便、 稳定, 也远较利用高输出的UV-A、 UV-B辐射源和放射源经济^[2]。
　　紫外线造成的DNA损伤主要有环丁嘧啶二聚体(cyclobutane-type pyrimidine dimmer, CPD)、 嘧啶6,4-二聚体、 多种稀少的DNA光产物和非直接类型如DNA-蛋白质交联和Singlet氧损伤等, 短波长UV-C可造成DNA的直接损伤, 主要为CPD。 近年来越来越多的研究证明, 紫外线可诱导多种细胞凋亡, 如人表皮Langerhans细胞^[3]、 角化细胞^[4]、 人白血病HL-60细胞、 U937淋巴细胞^[5]等。 具体机制尚不明确, 可能与DNA的损伤及某些凋亡调控基因的活化有关。 Servomaa等^[6]研究发现, 在绿色瘤白血病细胞快速指数生长期内, UV可造成可活动长重复片段(L1Rn)快速的成熟前激活, 并认为这种外源性的基因组致死性突变可造成凋亡; Wright等^[5]的研究发现, 在UV导致的HL-60、 U937、 T淋巴细胞Molt-3、 Molt-4等细胞系的凋亡中染色体的片段化并非于照射后马上可测得, 因此它并非来源于UV直接导致的DNA损伤; Gudar^[7]却提出UV导致的4 h之内的快速凋亡源于胞膜的损伤, 20 h之后的延迟凋亡则由DNA的损伤引发。 Bazar等^[8]发现, RNA、 蛋白质合成的抑制剂可抑制UV导致的T淋巴细胞和Jurkat细胞凋亡, 说明UV造成的凋亡存在着由内在基因编码的新蛋白质合成的通路。 另外, 众多的研究表明, UV可激化多种原癌基因的转录活性, 如与生存有关的Clusterin基因^[9]、 细胞增殖调控基因fos/jun家族^[10]、 抑凋亡基因bcl-2^[10,11]、 监控DNA损伤的“分子警察”P⁵³基因^[11]等, 其确切机制尚需进一步探讨。
　　我们用UV-C波段紫外线光源近距离照射体外培养的血管SMCs 10 min可诱导其发生凋亡, 在形态学和生化指标方面均具有典型的凋亡特征, 在照射后早期即出现细胞皱缩， 应用图像分析技术在二维平面观察到照射后细胞的面积、 核面积及核/胞面积比均明显减少, 且随着时间的推移有进一步发展的趋势, 细胞核面积的减少较细胞面积减少更快。 Orlov等^[12]在去除血清所致的体外SMCs凋亡的研究中发现, 高渗环境可引起正常SMCs皱缩, 这一皱缩并不进一步引发凋亡; 但对处于去除血清条件的SMCs, 高渗环境引起的细胞皱缩却可大大地加强因血清去除而诱发的凋亡。 因此，　研究者认为细胞的皱缩参与了SMCs凋亡的触发机制和/或推动了凋亡的进展, 其原因可能是细胞内水的丧失。 在UV-C诱导的体外SMCs凋亡的进程中, 细胞体积的减少是否也与凋亡的触发机制有关需进一步验证。
　　由于UV-C对细胞是一个较为剧烈的伤害因素, 实验中严格保证实验组、 对照组在其他条件上的一致性, 以杜绝其他因素的影响。 本文发现，　经UV-C照射后SMCs DNA出现有控降解, 这是凋亡发生最具特征性的表现^[13], 说明UV-C造成了DNA的损伤, 结合形态学上表现出的凋亡特征, 可认为UV-C照射可诱导体外SMCs凋亡。 其具体机制可能涉及DNA的直接、 间接损伤和在分子水平上激活多种凋亡相关基因。 虽然UV-C的穿透能力很弱, 用于实体组织和器官照射以治疗动脉粥样硬化的意义可能不大, 但可作为诱导体外SMCs凋亡的一个模型, 为进一步研究SMCs凋亡的内在信号传递和分子调控机制打下基础。

^*现在地址: 第一军医大学组织胚胎学教研室, 广州 510515　234
^*Present address: Department of Histology and Embryology of the First Military Medical University, Guangzhou 510515

作者单位:李晓丹　李　进^?*　广州军区医学高等专科学校内科教研室, 广州 510315

参考文献

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1997-10-10收稿　　1998-04-01修回