c-fos基因在内皮素-1促肺泡Ⅱ型细胞
表面活性物质合成中的作用^*

罗自强　孙秀泓　秦晓群

摘　要　　应用反义技术探讨c-fos基因在ET-1调控肺泡Ⅱ型细胞(ATⅡ) 表面活性物质(PS) 合成的胞内信号转导中的作用。 结果显示: (1) 内皮素-1 (ET-1) 可提高ATⅡ细胞的³H-胆碱掺入量。 (2) 蛋白激酶C (PKC) 激活剂PMA可使ATⅡ细胞的³H-胆碱掺入量增加, PKC抑制剂H₇可抑制ET-1的促PS合成效应。 (3) ET-1和PMA可显著提高Fos蛋白表达量。 H₇和c-fos反义寡核苷酸(ODN) 预处理可抑制ET-1促Fos蛋白表达和促³H-胆碱掺入效应。 (4) ET-1、 正义及反义ODN对ATⅡ细胞乳酸脱氢酶(LDH) 释放量均无显著影响。 结果证实: ET-1可促进ATⅡ的PS合成, 激活PKC上调c-fos基因表达是ET-1促ATⅡ细胞合成PS的胞内信号转导途径。
关键词: 内皮素-1; 肺泡Ⅱ型上皮细胞; 肺表面活性物质; 蛋白激酶C; c-fos基因
学科分类号: R332.2; Q47

ROLE OF c-fos GENE IN THE PULMONARY SURFAC
TANT SYNTHESIS OF CULTURED ALVEOLAR
TYPE Ⅱ CELLS INDUCED BY ENDOTHELIN-1^*

LUO　ZI-QIANG，　SUN　XIU-HONG，　QIN　XIAO-QUN
(Department of physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)

ABSTRACT　　The effects of endothelin-1 (ET-1) on pulmonary surfactant(PS ) synthesis of cultured alveolar type Ⅱcells(ATⅡ) were observed. The role of c-fos gene in cellular signal transduction of ET-1 was studied by antisense technology. The results showed that: (1) ET-1 enhanced ［³H］choline incorporation into ATⅡcells in a dose-dependent manner. (2) Protein kinase (PKC) activator PMA increased ［³H］ choline incorporation into ATⅡ cells, while PKC inhibitor H₇ inhibited the stimulating effect of ET-1. (3) Both ET-1 and PMA could increase the level of c-Fos protein, and H₇ and c-fos antisense oligonucleotides (AS ODN) could inhibit the effects induced by ET-1 on Fos protein expreesion and ［³H］ choline incorporation. (4) The release of lactic dehydrogenase (LDH) was not different among control, ET-1, antisense oligonucleotides and sense oligonucleotides groups. The above results demonstrated that ET-1 can enhance PS synthesis of AT Ⅱcells and ET-1 stimulating the expression of c-fos gene mediated by PKC is a major signal transduction pathway of modulating PS synthesis.
Key words: endothelin-1; alveolar type Ⅱcells; pulmonary surfactant; protein kinase C; c-fos gene

　　我室最近报道内皮素-1 (ET-1) 可促进离体肺和培养的肺组织分泌、 合成肺表面活性物质(PS)^［1,2］。 但ET-1对肺泡Ⅱ型细胞(ATⅡ)PS合成的直接影响未见报道。 c-fos原癌基因是即刻早期基因家族成员, 其表达产物Fos可作为转录因子参与对目的基因表达的调控, 发挥第三信使作用^［3］。 本实验采用离体培养的ATⅡ细胞, 进一步在细胞水平观察ET-1促PS合成的直接效应, 并应用反义技术论证c-fos基因在ET-1调控PS合成的胞内信号转导中的作用。

1　材料和方法

1.1　材料　　Wistar大鼠(本校实验动物中心提供), 雌雄不拘, 体重215±30 g。 ET-1、 PMA、 H₇、 DMEM培养基、 弹性蛋白酶、 大鼠IgG(Sigma公司), 核糖核酸酶(华美公司), ³H-氯化胆碱(NEN公司)。 抗c-Fos多克隆抗体(Santa Crueg公司), 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (Jackson公司), 免疫印迹化学发光试剂(来福泰生物工程研究所)。 乳酸脱氢酶测定试剂盒(北京中生生物技术公司)。
　　反义寡核苷酸: 按照文献报道序列^［4］由上海费尔公司合成硫代磷酸寡核苷酸(ODN), 反义链与大鼠c-fos mRNA 起始密码的－6～+9位碱基互补, 正义链与c-fos mRNA起始密码的－6～+9位碱基相同。 反义链5′-GAA-CAT-CAT-GGT-CGT-3′, 正义链5′-ACG-ACC-ATG-ATG-TTC-3′。
1.2　大鼠ATⅡ细胞纯化与鉴定^［5］　　氨基甲酸乙酯(1g/kg) 麻醉, 无菌开胸, 用生理盐水经肺动脉冲净肺血。 经气管插管, 用灌洗液(mmol/L: NaCl140, KCl5, HEPES10, CaCl₂ 2.0, MgSO₄ 1.3, pH7.4)60ml灌洗肺泡腔。 将弹性蛋白酶(4U/ml) 13ml注入肺泡, 37℃消化20min。 加0.1%核糖核酸酶 ml将肺剪成1mm³的碎片, 加小牛血清2ml终止消化, 80目和180目滤网依次过滤, 离心收集细胞。 用台盼蓝排斥法测成活率。 用每ml含青霉素100 U、 链霉素100μg的DMEM将细胞配成5×10⁶个/ml, 转移至已被大鼠IgG包被的培养皿, 37℃、 5% CO₂ 培养1h, 让有Fc受体的肺泡巨噬细胞、 淋巴细胞及中性粒细胞贴壁。 将未贴壁细胞调节至5×10⁵/ml, 培养8h待用。
　　分离的ATⅡ细胞于电镜下可见典型板层体。 细胞涂片采用改良巴氏染色法染色, 胞浆中有染成蓝色的板层体颗粒, 计数500个细胞, ATⅡ细胞纯度为(80.5±5.1)%。
1.3　ATⅡ细胞PC合成的检测　　实验分为对照组、 反义ODN组、 正义ODN组、 ET-1组、 ET-1+反义ODN组和ET-1+正义ODN组, 以及PMA组和ET-1+H₇组。 加³H-胆碱(3.7 GBq/ml) 培养16h (ODN于加入ET-1前8 h加入), 弃上清, Hank液洗3次, 用1% Triton裂解细胞, 液闪计数测定放射性强度, 反映PC合成量。
1.4　Fos蛋白的检测　　加入ET-1等处理因素1h, 裂解ATⅡ细胞, 用Western blot法检测Fos蛋白。 用EagleeyeⅡ图像分析处理系统测定各带密度, 以对照组为100%, 计算各组Fos蛋白含量的相对变化。
1.5　乳酸脱氢酶(LDH)的测定　　依LDH测定药盒说明书操作。
1.6　统计学分析　　实验数据以±s表示, 在IBM-PC微机以Instat软件采用方差分析比较各组差异。

2　结果

2.1　ET-1对ATⅡ细胞PS合成的影响
　　对照组³H-胆碱掺入量为(351±35)cpm/10⁵细胞, 10^－11mol/L ET-1可使 ATⅡ细胞的³H-胆碱掺入量较对照组增加(140.5±12.1)% (P<0.01), 量-效关系显著(r=0.9816, P<0.01) (图1)。 10^－12mol/L ET-1对ATⅡ细胞³H-胆碱掺入量无明显影响(P>0.05)。

图　1　　ET-1对³H-胆碱掺入肺泡Ⅱ型细胞的影响
Fig.1　Effects of endothelin-1 on³H-choline incorporation into alveolar type Ⅱ cells (incubated 16h, n=5)

2.2　PKC在ET-1促PS合成中的作用
　　PKC激活剂PMA可使ATⅡ细胞的³H-胆碱掺入量增加为对照组的(209.5±30.6)%(P<0.01), PKC抑制剂H₇可抑制ET-1的促PS合成效应, 使之降至对照组的(121.4±7.6)%(P<0.01)（图2）。

图　2　　PKC在ET-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成中的作用
Fig.2　Role of protein kinase C on pulmonary surfactant synthesis induced by endothelin-1 in alveolar type Ⅱ cells (incubated 16h, n=5)
^**P<0.01 vs control; ⁺⁺P<0.01 vs ET-1．

2.3　c-fos反义寡核苷酸对ET-1促PS合成的影响
　　c-fos正义和反义ODN对基础状态下的³H-胆碱掺入量均无明显影响(P>0.05)。 c-fos反义ODN预处理使ET-1的促³H-胆碱掺入效应下降了76.8%(P<0.01), 而c-fos正义ODN无此效应(见图3)。

图　3　　c-fos反义寡核苷酸对ET-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成的影响
Fig.3　Effects of c-fos antisense oligonucleotides on pulmonary surfactant synthesis induced by endothelin-1 in alveolar type Ⅱ cells (incubated 16h, n=5)
AS:antisense oligonucleotides; S:sense oligonucleotides;^**P<0.01 vs control;⁺⁺P<0.01 vs ET-1.

2.4　ATⅡ细胞Fos蛋白表达量的检测
　　对照组 Fos蛋白有低水平表达, 10^－10mol/L ET-1 和10^－7mol/L PMA均可显著提高Fos蛋白表达量, 分别为对照组的 (407.1±60.4)% 和 (424.4±100)% (P<0.01)。 H₇和反义ODN预处理可部分阻断ET-1的效应, 使ET-1促Fos蛋白表达效应分别下降了42.1%和52.8%(P<0.01) （图4, 图5）。

图　4　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Fos蛋白的Western blot法分析
Fig.4　SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot analysis for Fos protein

图　5　ET-1, 蛋白激酶C和c-fos反义寡核苷酸对促肺泡Ⅱ型细胞Fos蛋白表达量的影响
Fig.5　Effects of ET-1, protein kinase C and c-fos antisense oligonucleotides on Fos protein expression in alveolar type Ⅱ cells (incubated 1h, n=5)
^**P<0.05 vs control; ⁺⁺P<0.01 vs ET-1.

2.5　对ATⅡ细胞LDH释放的检测
　　对照组、 ET-1组、 ET-1+正义ODN及 ET-1+反义ODN四组间LDH释放量分别为(0.032±0.008)、 (0.031±0.007)、 (0.031±0.008)、 (0.029±0.009)U/10⁶, 均无显著差异(P>0.05), 表明本实验所使用的ET-1及ODN不导致ATⅡ细胞损伤。

3　讨论

　　ATⅡ细胞占肺细胞总数的14%～16%, 培养时ATⅡ细胞贴壁率较低, 很少分裂增殖, 其分离、 纯化和培养难度较大，本文采用电镜及细胞化学染色法证实所分离的细胞为ATⅡ。ATⅡ细胞在培养过程中会发生代谢和形态的改变, 体外培养超过24h,其磷脂合成率显著降低,故我们观察ET-1 对ATⅡ细胞PS代谢的研究在原代培养24h内进行。
　　磷脂酰胆碱(PC)是PS脂质的主要成分。 胆碱在胆碱激酶及磷酸胆碱胞苷酰转移酶作用下生成CDP-胆碱,与二酰基甘油生成PC。因此,通常采用³H-胆碱掺入量来反映PS的合成变化^［6］。本实验观察到, ET-1作用16　h以剂量依赖方式促进³H-胆碱掺入ATⅡ细胞, 首次在细胞水平证实ET-1可以促进ATⅡ细胞的PS脂质合成。PKC是胞内信号转导的重要分子。我们观察到PKC激动剂PMA可显著提高³H-胆碱掺入量,PKC阻断剂H₇可有效地阻断这一效应,证实PKC的激活是ET-1促PS合成的胞内信号转导的重要环节。
　　在多种细胞生长、 增殖和活化的调控中, Fos蛋白可作为转录因子参与调控靶基因的转录, 发挥第三信使作用^［3］。 本实验研究了PKC下游信号转导途径与c-fos基因表达的关系, 观察到ET-1及PKC激活剂PMA作用1h可使ATⅡ细胞的Fos蛋白含量增加4倍, PKC抑制剂H₇可部分阻断ET-1的促Fos表达效应, 表明ET-1可通过激活PKC上调ATⅡ细胞c-fos基因表达。关于c-fos基因表达与ET-1生物学效应之间的确切联系至今未见直接证据。为确认某一基因的功能, 采用基因敲除技术造成基因缺损动物的技术难度大, 费用高, 应用受限。 近年来发展了反义技术, 采用反义ODN特异性封闭或阻断某一基因, 已成为研究基因功能的有效手段^［7］。 本研究采用针对c-fos基因的反义ODN, 阻断c-fos基因表达, 使ET-1促Fos蛋白表达和～³H-胆碱掺入量显著降低, 而正义ODN无此效应, 从而首次证实, c-fos基因参与介导ET-1的促PS合成效应。 PS磷脂的生物合成受ATⅡ细胞内一系列酶促反应催化, 因此, c-fos基因表达产物Fos蛋白作为第三信使调控PS磷脂合成酶的表达而实现对PS合成的影响。

^*国家自然科学基金资助项目 (No.39770284)
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39770284)

作者单位：湖南医科大学生理学教研室, 长沙 410078

参考文献

　［1］　Luo ZQ (罗自强), Sun XH (孙秀泓). Modulation of endothelin-1 on pulmonary surfactant secretion. Acta Physiol Sin (生理学报), 1998， 50 (3): 333～336 (in Chinese with English abstract)．
　［2］　Luo ZQ (罗自强)，Sun XH (孙秀泓), Qin XQ (秦晓群)，et al. Modulation of endothelin-1 on pulmonary surfactant synthesis in lung explants． Bull Hunan Med Univ　(湖南医科大学学报)，1998, 23: 527～530..
　［3］　Morgan JI, Curran T．　Immediate-early genes: ten years on. TiNS, 1995, 18: 66～67．
　［4］　Suzuki S, Pilowsky P, Minson J, et al.c-fos antisense in rostral ventral medulla reduces arterial blood pressure. Am J Physiol, 1994, 266: R1418～R1422.
　［5］　Dobbs LG. Isolation and culture of alveolar type Ⅱ cells. Am J Physiol, 1990, 258: L134～L147.
　［6］　Batenburg JJ. Surfactant phospholipids: synthesis and storage.　Am J Physiol, 1992, 262: L367～L385.
　［7］　Wahlestedt C. Antisense oligonucletides strategies in neuropharmacology. TiPS, 1994, 15: 42～46.

1998-07-26收稿　　1998-10-18修回