巢蛋白在P19神经元分化过程中的表达^*

边玮　杨靖　唐珂　景乃禾^**

摘　要　　小鼠巢蛋白(nestin)基因编码了一个中等纤维骨架蛋白, 该基因在小鼠中枢神经系统发育过程中瞬时性表达。 为了推测该基因在神经发育过程中可能的功能, 我们分析了该基因在RA诱导的P19胚胎性癌细胞体外神经分化过程中的表达规律。 结果显示, 在上述过程中, 巢蛋白基因的表达早于神经前体细胞(neural precursor cell)中表达的BMP4, 以及在成熟神经元中特异表达的标记分子神经丝(NF160), 表明巢蛋白基因可能主要在神经干细胞(neural progenitor cell)阶段表达。 细胞免疫染色结果显示, 巢蛋白在神经突及生长锥上存在较强的分布, 表明它可能参与了有丝分裂后神经元与靶细胞之间神经联系的建立。
关键词: 巢蛋白; P19神经元; BMP4; 神经丝
学科分类号: Q71

NESTIN EXPRESSION DURING P19
NEURON DIFFERNTIATION^*

BIAN　WEI，　YANG　JING，　TANG　KE，　JING　NAI-HE^?　?
(Shanghai Institute of Biochemistry, Chinese Academy of Science;
Shanghai Research Center of Life Sciences, Shanghai 200031)

ABSTRACT　　Mouse nestin, an intermediate filament gene, is transiently expressed during the development of the central nervous system. In order to find the clue of its function during neural development, we tried to find out the gene expression pattern during the neuronal differentiation of P19 EC cells induced RA. RT-PCR showed that nestin was transiently expressed during P19 neuron differentiation, with a peak at day 4 of this process. However, BMP4, a neural precursor cell marker, was transiently expressed with its highest level at day 6, while NF160 kD a terminal differentiated neuronal marker, was increasingly expressed during the whole process. These results implied that nestin might play some roles during the process of neural progenitor cells differentiating into neural precursor cells. Moreover, immunostaining showed that nestin was located in the neurite and the growth cone of the P19 neuron, suggesting that nestin might be also involved in the process of the establishment of neural connection.
Key words: nestin; P19 neuron; BMP4; neural filament

　　哺乳动物神经系统发育是一个复杂的过程。 这一过程包括多潜能细胞分化为神经干细胞,神经干细胞分化为神经前体细胞, 神经前体细胞进一步分化为成熟神经元等几个阶段。 这几个阶段涉及大量基因的表达。 寻找神经发育相关基因, 分析它们在神经发育的何种阶段行使功能, 有助于了解神经发育的分子机制。
　　巢蛋白(nestin)基因编码了一个中等纤维骨架蛋白, 因其在中枢神经系统发育过程中的瞬时性表达而被克隆^［1］。 原位分子杂交结果显示, 在7.75 d胚胎小鼠的神经板上, 巢蛋白mRNA出现在中线两侧的柱状神经上皮细胞中, 在靠近中胚层的细胞中信号更强。9.5d小鼠胚胎的神经管完全闭合, 神经管两侧的细胞中有很强的巢蛋白mRNA分布。10.5d小鼠胚胎中, 除了神经管之外, 在神经嵴(neural crest)细胞及体节(somite) 上也有表达。15.5d的小鼠胚胎, 巢蛋白mRNA主要分布在端脑室(telencephalon ventricular) 及室下层(subventricular zone)、 辐射状胶质细胞(radial glial cell)、 小脑原基(cerebellar primordium)和舌的位置。 新生鼠的脑室及室下层和小脑中也存在其表达。 而在成年鼠脑中, 在脉络丛(choroid plexus)有少量细胞依然表达巢蛋白mRNA^［2］。 另一些实验表明, 大鼠室下层的细胞并不都表达巢蛋白, 而是从室下层迁移, 开始从干细胞状态向星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化的细胞中才表达, 而在成熟的这两类胶质细胞中, 均没有巢蛋白的表达^［3,4］。 这些结果表明, 巢蛋白可能同时参与了神经元和胶质细胞的分化。 成年动物中枢神经系统损伤后,在损伤导致的星形胶质细胞重新激活过程中, 能观察到细胞重新表达巢蛋白, 并且巢蛋白的表达会维持很长时间^［5］。 这些结果表明, 巢蛋白与神经元和胶质细胞的分化有密切关系。 在神经元分化过程中, 该基因主要在快速分裂的神经前体细胞中存在瞬时性表达^［6,7］。 尽管大量实验结果表明巢蛋白与神经发育存在相关性, 但其在神经元分化过程中的功能及其在神经前体细胞中的亚细胞分布目前尚不清楚。
　　小鼠胚胎性癌细胞P19是一株多潜能细胞, 该细胞具有正常雄性小鼠染色体核型, 在10^－6　mol/L的视黄酸(retinoic acid, RA)诱导下, 可向神经细胞方向分化。 在此过程中, 神经发育相关基因的表达模式基本模拟了正常小鼠神经发育过程。 因此, P19细胞目前被作为一个研究小鼠神经发育的体外实验模型^［8］。 在P19细胞经RA诱导下向神经方向分化的过程中,巢蛋白的表达量在蛋白质水平存在明显的瞬时性变化。 在未经诱导的P19细胞中,其表达量很低; 而在RA诱导后, 细胞分化的第4天, 表达量有明显增加。 同时免疫荧光染色结果表明, 该蛋白主要在分化中神经细胞的神经纤维上表达^［9］。 本研究希望利用小鼠P19胚胎性癌细胞在RA诱导下向神经细胞分化这一实验模型, 进一步分析巢蛋白在神经元分化过程中可能的功能。

1　材料和方法

1.1　材料　　P19细胞株由日本理化学研究所渥美忠南博士赠送。 多聚甲醛(PFA)、RA、多聚D型赖氨酸(poly-D-lysine)、N₂培养基内的添加因子购自Sigma公司。PVDF膜、EDTA、SDS、 抗神经丝160 kD蛋白(neurofilament, NF160)单克隆抗体购自Amersham公司。 兔抗鼠巢蛋白抗体为本实验室制备^［7］。 反转录酶Superscript^TMⅡ、Taq DNA 聚合酶、 细胞培养用DMEM/F12、 αMEM培液、 胎牛血清(FBS)、 正常羊血清(normal goat serum, NGS)、 Proteinase K、 Trypsin-EDTA、 Fibronectin、 牛血清白蛋白(BSA)购自GIBCO BRL公司。 dNTP购自Boehringer Mannheim公司。 细胞培养瓶及细胞培养板购自Corning公司。 细菌培养皿(petri dish)购自Fisher公司。 FITC-羊抗鼠IgG购自Dianova公司。 FITC-羊抗兔IgG购自Tago公司。 丙烯酰胺(acrylammide)、 N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N′-methylene-bis-acrylamide,BIS)、 十二烷基磺酸钠(sodium dodecy sulfate, SDS)购自Bio-Rad公司。 苯酚、 氯仿、 异戊醇、 醋酸钠、 异丙醇、 乙醇、 丙酮、 甲醇、 等为国产分析纯试剂。 PCR引物在中国科学院上海植物生理研究所DNA合成测序中心合成。
1.2　P19细胞培养　　该细胞贴壁生长于含10％　FBS的DMEM/F12培液的细胞培养瓶中, 每2～3天传代。 细胞培养于37℃、5％　CO₂培箱中。
1.3　P19细胞体外诱导　　按文献^［9］所述方法进行。
1.4　反转录PCR　　分别收集未经处理的P19细胞、 RA诱导4d的细胞团、 在N₂无血清培液中培养2, 4, 6, 8 d的细胞, 按分子克隆^［10］介绍方法抽提总RNA, 反转录按Superscript^TMⅡ酶使用说明进行, 每个样品取总RNA 5μg进行反转录。
　　巢蛋白引物序列为: 5′端: 5′　GAATCAGATCGCTCAGATCC 3′; 3′端: 5′ GCACG～ACAC～CAG～TAGAACTG 3′。 PCR反应体系如下: 12ng/μl反转录产物, 1.5mmol/L MgCl₂, 200μmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8.4), 50mmol/L KCl, 5′端及3′端引物各1pmol/μl, Taq酶005U/μl反应体积, 0.37kBq/μl α-³²P-dATP。 反应条件如下: 94℃ 45s变性, 56℃退火 45 s, 72℃延伸1min反应28次循环。 PCR结束后, 在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 电泳结束后真空干燥凝胶, 对X光片曝光。
　　BMP4的引物序列为: 5′端: 5′ TGCCGCAGCTTCTCTGAGCC 3′; 3′端: 5′ GACTG～CCT～GAT～CTC～AGC～GGC 3′。 退火温度: 64℃; 反应循环25次; 其他反应条件与巢蛋白相同。
1.5　培养细胞的免疫荧光染色　　经RA诱导的P19细胞接种到玻璃盖玻片上, 在N₂无血清培液中分别培养2, 4, 6, 8 d后, 用4％多聚甲醛室温固定1h, PBS洗一次后, 用预冷的CMA(氯仿∶甲醇∶丙酮＝1∶2∶1)－20℃处理30min。 细胞经梯度甲醇换至PBS中, 在含有1%　BSA、 0.5%正常羊血清(normal goat serum, NGS)的PBS封闭液中室温下静置30min, 然后在室温下与一抗作用1.5h, 兔抗巢蛋白抗体按1∶200、 神经纤维160kD蛋白单克隆抗体按1∶100稀释于封闭液中。 PBS洗去一抗, 加入1∶200稀释的FITC-羊抗兔IgG或FITC-羊抗鼠IgG, 室温避光作用30min, PBS洗去二抗。 用无荧光甘油封片, 荧光显微镜下观察拍照。
1.6　免疫蛋白印迹反应(western blot)　　按文献^{［7, 9］}所述方法进行。

2　结果

2.1　巢蛋白基因在P19细胞神经分化过程中的表达规律
　　为了了解巢蛋白在神经元分化过程中可能的功能, 我们首先以RT－PCR方法考察了巢蛋白mRNA在RA诱导的P19细胞神经分化过程中的表达规律。 在未经RA诱导的P19细胞中, 存在少量巢蛋白mRNA(图1, Lane 1), RA诱导4 d后, 巢蛋白的表达量基本保持不变(图1, Lane 2)。 在神经分化过程中该基因的表达量逐渐增加, 到第4天达到高峰(图1, Lane 3, 4), 此后表达量下降(图1, Lane 5, 6)。 作为对照组的肌动蛋白(actin)反转录PCR结果显示,用以检测巢蛋白mRNA表达量的各组反转录产物,均可得到同样量的actin扩增产物(未发表结果)。

图　1　在P19细胞神经分化过程中, 巢蛋白mRNA表达量的变化
Fig.1　RT-PCR results of nestin expression during RA induced P19 cell neuronal differentiation
RNA samples were extracted from non-induced P19 cells (Lane 1), P19 cell aggregates induced by RA for 4d (Lane 2), P19 cell neuronal differentiation for 2d (Lane 3), 4d (Lane 4), 6d (Lane 5) and 8d (Lane 6), respectively.

2.2　神经丝蛋白(NF160)在P19细胞神经分化过程中的表达规律
　　神经丝(NF160)作为在成熟神经元中特异性表达的标记分子, 被用来跟踪RA诱导的P19细胞神经分化过程。
　　图2A所示为NF160抗体的Western blot结果, 在未经诱导的P19细胞中(图2A Lane 2, 见图版Ⅲ), 完全检测不到NF160的表达; 神经分化的第2天(图2A Lane 3, 见图版Ⅲ), NF160的表达开始出现; 在此后的几天中(图2A Lane 4～7, 见图版Ⅲ), NF160的表达不断增加, 这表明该细胞培养体系中成熟神经元的分化是一个持续进行的过程。 NF160抗体免疫荧光染色结果显示, 在神经分化的第8天, 细胞聚集成团生长, 在成团的细胞中, 可以看到大量NF160分布在细胞团之间的神经网络及细胞团内的一些神经纤维中(图2B, 见图版Ⅲ)。 同时, 在培养体系中依然存在相当数量的NF160抗体染色阴性细胞。 由此表明, 尽管大部分细胞已达到终末分化状态, 但依有部分细胞正处于向成熟神经元分化的过程中。

2.3　BMP4在P19细胞神经分化过程中的表达规律
　　我们还利用RT-PCR方法, 考察了在小鼠胚胎神经管背方的神经前体细胞中特异性表达的细胞因子BMP4在P19细胞神经分化过程中的表达规律。 我们注意到, 未经RA诱导及经RA成团诱导4d的P19细胞中, 完全检测不到BMP4的表达(图3, Lane 1, 2)。 而经RA诱导后, 在N₂无血清培液中分化2d的细胞中, BMP4开始表达(图3, Lane 3), 其表达量不断增加, 到分化的第6天(图3, Lane 5)细胞中的BMP4表达量达到高峰, 然后下降(图3, Lane 6)。 BMP4的这一表达模式表明, 经RA诱导的P19细胞在分化的第2到第6天, 大部分细胞正处于向神经前体细胞分化的过程中, 而第6天时, 大部分细胞达到了神经前体细胞状态。 随后, BMP4表达量的降低, 意味着大部分细胞已经从神经前体细胞开始向成熟神经元方向分化。

图　3　　BMP4在RA诱导的P19细胞神经分化过程中的表达
Fig.3　RT-PCR results of BMP4 expression during RA induced P19 cell neuronal differentiation
RNA samples were extracted from non-induced P19 cells (Lane 1), P19 cell aggregates induced by RA for 4d (Lane 2), P19 cell neuronal differentiation for 2d (Lane 3), 4d (Lane 4), 6d (Lane 5) and 8d (Lane 6), respectively.

2.4　巢蛋白参与了神经突的形成及神经联系的建立
　　从前面的结果中我们注意到, 尽管巢蛋白基因在P19神经元分化第6～8天的表达量比分化第4天下降了很多, 但仍然比未经RA诱导的P19细胞中的表达量高8～10倍(图1, Lane 4, 5, 6)。 这意味着该基因在神经前体细胞的进一步分化过程中, 可能依然具有重要功能。 为了分析巢蛋白在神经前体细胞向成熟神经元分化过程中的功能, 我们利用免疫荧光染色详细分析了上述过程中, 巢蛋白在细胞中的分布特征。
　　未经RA诱导的P19细胞具有典型的上皮样细胞形态, 巢蛋白在细胞中呈弥散状均匀分布(图4A, 见图版Ⅲ)。 经RA诱导后, 细胞形态发生变化, 细胞在其一端开始长出突起。 在这些发生形态变化的细胞中, 巢蛋白的分布与未经诱导的P19细胞相比发生了明显的变化: 在细胞体中, 巢蛋白明显地在细胞的外周, 靠近细胞膜的位置分布, 而在细胞形成的突起上, 则有巢蛋白集中的成束分布(图4B, 见图版Ⅲ)。 随着神经分化的继续, 细胞体上的突起逐渐向外生长, 形成神经突。 而细胞体中的巢蛋白纤维向神经突的基部集中, 并伸入神经突中, 在其中有较强的分布(图4C, 见图版Ⅲ)。 随后, 神经突的顶端开始膨大, 形成生长锥, 巢蛋白在生长锥中呈扇形分布(图4D, 见图版Ⅲ)。 随着神经突的继续伸长, 其直径明显变细, 其中的巢蛋白量也逐渐减少。 然而, 在生长锥上巢蛋白的分布却加强了, 此时的生长锥明显地向靶细胞方向迁移(图4E, 见图版Ⅲ)。 但当生长锥最终接触到靶细胞, 建立了神经联系后, 巢蛋白在神经突纤维上的分布逐渐消失(图4F, 见图版Ⅲ)。 以上结果提示, 巢蛋白可能参与了神经突和生长锥的形成、 伸长与迁移以及神经元与靶细胞间神经联系的建立等过程。

3　讨论

3.1　巢蛋白可能参与了神经干细胞向神经前体细胞的分化　　神经发育过程中涉及到多潜能细胞向神经干细胞的分化, 进而由神经干细胞分化形成神经前体细胞, 神经前体细胞经最后一次有丝分裂分化为成熟神经元。 这一过程涉及大量神经发育相关基因的时空特异性表达, 如在神经干细胞中存在Notch、 MASH等基因的表达^［11］, 在神经前体细胞中存在BMP4等基因的表达^［12］, 成熟神经元中存在NF160等基因的表达^［13］, 比较巢蛋白与这些基因表达的先后, 有助于判断其在神经发育的何种阶段行使了功能。 如前所述, 在P19细胞神经分化过程中, 我们考察了几个神经发育相关的基因的表达规律。 对图1、图2A和图3的RT-PCR和Western blots结果进行密度扫描, 可得到图5。 从图5可看出, 在P19细胞的神经元分化过程中, 巢蛋白的表达量在分化的第4天达到高峰, 比未经RA诱导的P19细胞增加了近30倍。到分化的第6～8天,其表达量下降,但仍较RA诱导前高8～10倍。NF160的表达量随着P19神经元的分化过程持续上升,而BMP4的表达高峰在分化的第6天。

图　5　巢蛋白、 BMP4、 NF160在RA诱导的P19细胞神经分化过程中的表达示意图
Fig.5　Schematic diagram of the expression pattern of nestin, BMP4, NF160 during P19 neuron differentiation

　　我们发现, 巢蛋白在RA诱导的P19细胞神经分化过程中, 其表达高峰出现在细胞神经分化的第4天(图1, 5), 与MASH-1在这一过程中的表达高峰出现时间相同^［14］。 而此时, 在胚胎发育中, 于神经管背方的神经前体细胞中特异性表达的BMP4并未达到最高(图3,5)。 如果以BMP4的表达作为细胞处于神经前体细胞状态的标志, 巢蛋白表达高峰早于BMP4, 这意味着大量表达巢蛋白的细胞分化状态早于神经前体细胞。 由此我们推测, 这些细胞很可能处于从神经干细胞向神经前体细胞分化的过程中。
　　中等纤维骨架蛋白的表达在胚胎发育中往往与细胞的分化状态有关, 如肌肉细胞特异性表达结蛋白(desmin)、 处于不同分化程度的表皮细胞表达不同类型的角蛋白(keratin)、 神经胶质细胞特异性表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、 而成熟神经元表达神经丝(neurofilament, NF)^［13］。 在神经分化过程中, 细胞瞬时性表达巢蛋白, 很可能与该细胞在从神经干细胞状态向神经前体细胞状态分化过程中的特定阶段, 需要在细胞中形成巢蛋白骨架, 以便细胞能够接受与分化有关的信号, 向神经前体细胞方向分化有关。
　　从BMP4和NF160的表达规律看, RA诱导的P19细胞的神经分化过程可简述如下: 经RA诱导后, P19细胞开始其神经分化过程, 到分化的第6天, 以BMP4的表达高峰为标志, 大部分细胞达到神经前体细胞的阶段。 而NF160表达量的持续上升则标志着, 从第6天起这些神经前体细胞开始向成熟神经元方向分化。 巢蛋白基因的表达高峰出现在分化的第4天, 表明该基因可能参与了神经干细胞向神经前体细胞的分化过程。
3.2　巢蛋白可能参与了有丝分裂后神经元间神经联系的建立　　我们注意到, 经RA诱导的P19细胞, 在神经分化的第6～8天时, 大部分细胞已达到有丝分裂后神经元状态, 失去有丝分裂的能力。 此时, 巢蛋白的表达虽已下降, 但仍然高于未经RA诱导的P19细胞(图1, 5)。 这一现象使我们推测, 巢蛋白在神经元分化过程中可能具有多种功能: 一方面, 该基因可能参与了神经干细胞向神经前体细胞的分化; 另一方面, 巢蛋白还可能在有丝分裂后神经元的终末分化中具有功能。
　　抗体荧光染色结果支持上述推测, 在有丝分裂后神经元中, 巢蛋白主要分布在细胞的神经突及其基部。 而在神经突纤维伸长后, 巢蛋白在其上的分布有所减弱, 但在生长锥上却有非常强烈的表达。 生长锥一旦与靶细胞接触, 巢蛋白在神经突纤维上的分布则开始消失(图4, 见图版Ⅲ)。
　　这些现象表明,神经突的形成很可能是巢蛋白在有丝分裂后, 在神经元细胞体的一端聚集,形成的巢蛋白骨架向外延伸,使细胞的一端向外突起而形成的。神经突形成后,巢蛋白骨架继续向外延伸,使神经突纤维逐渐伸长。随后,巢蛋白逐渐集中到神经突纤维的前端形成生长锥。随着神经突纤维的进一步伸长,生长锥到达靶细胞,与其建立神经联系。在神经联系建立之后,巢蛋白的功能完成,在神经突纤维中的分布也逐渐消失,其功能可能由神经丝(NF)骨架取代。因此,我们认为,巢蛋白参与了有丝分裂后神经元间神经联系的建立。
　　综上所述, 我们认为, 巢蛋白在神经发育及神经分化过程中可能具有多种功能。 首先, 该基因可能参与了神经干细胞向神经前体细胞的分化; 此后又参与了神经联系的建立。 鉴于巢蛋白可能具有上述功能,在P19细胞中过量表达巢蛋白,对分析巢蛋白在神经元分化过程中的功能, 可能提供重要的线索。同时,进一步利用免疫电镜等高分辨率的方法,考察巢蛋白在神经元分化过程中的亚细胞分布,将有助于进一步研究巢蛋白在上述过程中的功能。

^*国家自然科学基金资助项目 (No.39670250, 39870283)
^**联系人　246　
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39470245, 39870283)
^**To whom correspondence should be addressed.

作者单位：中国科学院上海生物化学研究所, 200031；
　　　　　上海生命科学研究中心, 200031

参考文献

　［1］　Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RDG. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell, 1990, 60: 585～595.
　［2］　Dahlstrand J, Lardelli M, Lendahl U. Nestin mRNA expression correlates with the central nervous system progenitor cell state in many, but not all, regions of developing central nervous system. Dev Brain Res, 1995, 84: 109～129.
　［3］　Zerlin M, Levison SW, Goldman JE. Early patterns of migration, morphogenesis, and intermediate filament expression of subventricular zone cells in the postnatal rat forebrain. J Neurosci, 1995, 15: 7238～7294．
　［4］　Frisen J, Johansson CB, Torok C, et al. Rapid, widspread, and longlasting induction of nestin contributes to the generation of glial scar tissue after CNS injury. J Cell Biol, 1995, 131: 453～464．
　［5］　Gallo V, Armstrong RC. Developmental and growth factor-induced regulation of nestin in oligodendrocyte lineage cells. J Neurosci, 1995, 15: 394～406.
　［6］　Yang J (杨　靖), Bian W (边　玮), Jing NH (景乃禾). Nestin mRNA expression during the development of mouse central nervous system. Acta Physiol Sin（生理学报）， 1997, 49 (6): 657～665 (in Chinese with English abstract).
　［7］　Jing NH, Kitani H, Morio I, et al. Expression of intermediate filament nestin during mouse brain development. Chin J Physiol Sci, 1996, 12: 1～9.
　［8］　Bain G, Ray WJ, Yao M, et al. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. BioEssays, 1994, 16: 343～348.
　［9］　Sun H, Zhang X, Kitani H, et al. Neuronal induction of embryonic carcinoma cell and nestin expression. Chin J Physiol Sci, 1996, 12: 163～169.
［10］　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 7.6.
［11］　Lewis J. Neurogenic genes and vertebrate neurogenesis. Curr Opin Neuro, 1996, 6: 3～10.
［12］　Tanabe Y, Jesell TM. Diversity and pattern in the developing spinal cord. Science, 1996, 274: 1115～1123.
［13］　Steinert PM, Roop DR. Molecular and cellular biology of intermediate filaments. Ann Rev Biochem, 1988, 57: 593～625.
［14］　Jonhsen JE, Zimmerman K, Saito T， et al. Induction and repression of mammalian achaete-scute homologue (MASH) gene expression during neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Development, 1992, 114: 75～87.

1998-04-29收稿　　1998-07-02修回