中枢应用β-内啡肽对大鼠血浆唾液酸
水平的影响以及与免疫功能的关系^*

陈文芳　陈蕾　吕秀文　陈家津

摘　要　　实验选择体重200～250g健康Wistar大鼠64只, 采用麻醉大鼠中枢微量注射、 分光光度测定法及免疫组织化学法, 研究侧脑室、 弓状核(ARC)区注射β-内啡肽(β-EP)对大鼠血浆唾液酸(SA)水平的影响及与免疫功能的关系。 结果表明: (1)侧脑室注射β-EP可明显降低血浆SA水平; (2)血浆SA水平在ARC区注射β-EP后明显降低, 此效应可被M胆碱受体阻断剂阿托品或切断双侧颈迷走神经所阻断; (3)ARC区注射β-EP后, 外周血CD3, CD4明显升高, CD8明显降低, CD4/CD8比值升高。 以上结果提示, 中枢应用β-EP可降低血浆SA水平, ARC可能是主要的中枢作用部位, 其机制与M胆碱能受体密切相关, 可能是通过副交感神经实现此效应, 且机体的细胞免疫功能是增强的。
关键词: 血浆; 唾液酸; β-内啡肽; 侧脑室; 弓状核区; 淋巴细胞; 大鼠
学科分类号: Q426

EFFECT OF β-ENDORPHIN ON PLASMA SIALIC
ACID LEVEL IN RATS AND THE RELATIONSHIP
WITH THE IMMUNE FUNCTION^*

CHEN　WEN-FANG，　CHEN　LEI，　LU　XIU-WEN，　CHEN　JIA-JIN
(Department of Physiology, The Medical College of Qingdao University, Qingdao 266021)

ABSTRACT　　With the use of β-EP microinjection into the central nervous system, spectrophotometrical analysis and immunochemical method we studied the effect of β-Endorphin (β-EP) on plasma sialic acid (SA) level. The results indicate: (1) The plasma SA level was significantly decreased after microinjection of β-EP into the lateral ventricle (LV); (2) When β-EP was microinjection into nucleus arcuatus (ARC), the plasma SA level was significantly decreased (P<0.05). This effect can be blocked by i.v. atropine or vagotomy; (3) Microinjection of β-EP into ARC can cause the increase of CD3, CD4 and CD4/CD8, while CD8 was decreased. The above results suggest that the possible mechanism underlying the decrease of plasma SA level is mediated by cholinergic muscarinic receptor, and the cellular immune function is enhanced.
Key words: plasma; sialic acid; β-endorphin; lateral ventricle; nucleus arcuatus; lymphocyte; rat

　　唾液酸(sialic acid, SA)是一族化合物的总称, 除少数以游离形式存在外, 其余均以结合形式存在于糖蛋白、 糖脂分子的糖链及一些寡糖中。 SA作为细胞膜重要的组成成分, 与细胞的接触抑制、 增殖分化、 免疫调控、 细胞的转变等生物学特性密切相关^［1～4］。 但是有关血液中SA水平变化的机制, 迄今尚不清楚。 有些学者推测, 神经-体液系统在调节血液SA水平的变化中可能起重要作用, 但缺少动物实验研究证据。 β-内啡肽(β-endorphin, β-EP)作为阿片肽家族中的重要一员, 与其相应受体结合后, 可以调节机体许多生理功能。 它参与镇痛、 应激、 僵直、 行为等效应。 此外, 它还参与神经内分泌-免疫系统网络, 直接影响免疫功能^［5～9］。 但血浆SA水平是否受β-EP的调节, 尚未见这方面的研究报道。 本研究旨在探讨中枢应用β-EP对大鼠血浆SA水平的影响以及与免疫活动的关系, 并对其机制进行初步探讨。

1　材料和方法

　　实验选择体重200～250g健康Wistar大鼠, 雌雄不拘, 随机分为对照组和实验组。 动物以20%乌拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉后, 固定于江湾I型C立体定向仪(上海花木农机厂制)上, 部分动物在颈部做气管插管术, 用2%三碘季铵酚(10.2ml/100g bw)肌松剂, 行人工呼吸, 分离双侧颈迷走神经备用。 实验结束后固定脑组织、 冰冻切片及按图谱确定注射部位等步骤同以往实验^［10］。
1.1　中枢定位　　定位按照Paxinos和Watson氏图谱进行, 侧脑室的坐标为: 前囟后2.8mm, 颅中线, 颅骨下4.0mm; 单侧ARC的坐标为: 前囟后3.8mm, 旁开0.2mm, 颅骨下9.0mm, 插入同心套管(外径0.7mm, 内径0.4mm), 用502胶和自凝牙托粉固定, 作微量注射用。 侧脑室注入液体总量为5μl, ARC区内注入液体总量为1μl, 在1min内注射完毕, 5min拔出内套管。
1.2　用分光光度法测定血浆SA含量　　分离右侧颈静脉, 将聚乙烯管插入右心房以备取血用。 静脉用药在1 min内均匀注入, 注药前、 切断迷走神经前及中枢 注射β-EP后, 分别取血0.5ml, 置抗凝管中, 以3?000r/min的速度离心30min, 分离血浆。 测定时, 将血浆0.1ml和F8836试剂4ml混匀, 在沸水浴中加热10min后, 立即置冷水浴2min, 以1000g离心10min, 取上清液, 用722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂制)进行比色, 波长560nm, 试剂调零, 测定SA含量。
1.3　外周血T淋巴细胞及其亚群的测定　　应用免疫组织化学染色SP法(链菌素亲生物蛋白-过氧化酶法)检测外周血CD3(外周血总T细胞)、 CD4(T辅助细胞)和CD8(T抑制细胞)阳性率。 SP试剂盒系美国Iymed公司产品。 取血(肝素抗凝)1 ml, 分离淋巴细胞后用PBS液洗2次, 将淋巴细胞悬液滴于10孔抗原片上。 每孔20μl, 置于4℃丙酮-福尔马林固定液固定30s, 用PBS液洗2次后吹干; 抗原片水化, 加非免疫动物血清孵育10min, 加第一抗体60min后, 再加生物素标记的二抗孵育10min; 加链霉素亲生物蛋白-过氧化酶10min后, 置于新配置的DAB显色液显色5min; 用苏木素复染核, 常规脱水、 透明, 中性树胶封固, 在高倍镜下连续记数200个淋巴细胞, 计算其阳性细胞的百分数。
1.4　数据处理　　数据以±s 表示, 应用两样本均数的t检验判定其差异, 以P<0.05作为显著性差异的标准。

2　结果

2.1　侧脑室注射β-EP对大鼠血浆SA水平的影响
　　对照组侧脑室(LV)注射生理盐水5μl, 于注射后5, 15, 25, 35及45min分别取血测SA浓度, 结果注射前后血浆SA水平无明显变化(P>0.05)。 实验组LV注射5×10^－5mmol/L　β-EP 5μl, 结果血浆SA水平于注射后15 min开始下降, 25min时作用最明显, 此后SA水平渐回升。 与对照组相比差异显著(n=6, P<0.05)(图1)。
2.2　ARC区注射β-EP对大鼠血浆SA水平的影响及机制分析
　　为研究侧脑室注射β-EP引起血浆SA水平降低的中枢作用部位, 我们选择了下丘脑ARC区注射β-EP, 观察其对血浆SA水平的影响并对其机制进行了探讨。 结果发现, ARC区注射5×10^－5 mmol/L　β-EP 1μl 15min后, 血浆SA水平开始下降, 25min时降低最明显, 45min时血浆SA水平仍较对照组明显降低, 但已呈回升趋势, 与对照组相比有显著差异(n=6, P<0.05) (图2)。
　　β-EP引起血浆SA水平降低的效应, 可被颈静脉预先注射阿托品0.25mg/kg所阻断, 与静脉注射生理盐水(2mg/kg)组相比, 差异显著(P<0.05)。 此效应亦可被预先切断双侧颈迷走神经所阻断, 与假手术组相比, 差异显著(n=6, P<0.05)(表1)。

图　1　　侧脑室注射β-EP对大鼠血浆SA水平的影响
Fig.1　Effect of microinjection of β-EP into the LV on plasma SA level
^*P<0.05, compared with the control.n=6. ◆: control group; ■: LV group.

图　2　　弓状核注射β-EP对大鼠血浆SA水平的影响
Fig.2　Effect of microinjection of β-EP into ARC on plasma SA level
^*P<0.05, compared with the control. n=6. ◆: control group; ■: β-EP group.

表 1　ARC区注射β-EP导致血浆SA水平的改变
Table 1　Changes in SA level induced by ARC microinjection of β-EP

Group	Concentration /mg^.dl^－1
	0min	25min
Control	153.1±17.5	126.0±13.3^*
Atropine	154.5±18.9	150.0±16.0
Sham operation	155.1±17.3	123.0±17.8^△
Vagotomy	156.2±18.6	152.2±17.5

n=6. ^*P<0.05, compared with the atropine group; ^△ P<0.05,compared with the vagotomy group.

2.3　ARC区注射β-EP对外周血T细胞及其亚群的影响
　　对照组ARC区注射生理盐水1μl, 实验组ARC区注射β-EP (5×10^－5mmol/L)1μl, 注射后60 min断头取血, 分别测定外周血CD3、 CD4及CD8的百分率。　结果表明, ARC区注射β-EP在降低血浆SA水平的同时, 可提高外周血CD3、 CD4细胞的百分率(P<0.01), 而CD8的百分率低于对照组(n=8, P<0.05) (见表2)。

表 2　ARC区注射β-EP对外周血T细胞及其亚群的影响
Table 2　Effect of ARC microinjection of β-EP on the blood multiple types of lymphocytes (%)

Group	CD3	CD4	CD8	CD4/CD8
Control	65.88±4.22	38.75±3.06	24.88±4.64	1.64±0.54
β-EP	72.75±4.24^**	44.38±3.50^**	19.88±4.02^*	2.30±0.44^**

n=8. ^*P<0.05, ^**P<0.01, compared with the control.

3　讨论

　　血液SA水平的检测, 是临床恶性肿瘤早期诊断和预后判断的重要指标之一, 但是对SA水平高低变化的机制, 目前尚有不同见解。 我们以前的工作证实, 麻醉大鼠血浆SA水平较清醒大鼠明显降低, 提示中枢神经系统的功能状态与血中SA水平保持稳态密切相关。 进一步的研究发现, 应用谷氨酸钠兴奋ARC区神经元, 可导致血浆SA水平降低, 其作用机制与DA释放有关, 且通过DA-D2受体起作用^［10］。 有文献报道, 下丘脑ARC富含β-EP能神经元, 且激活下丘脑内DA-D2受体可对β-EP的释放起抑制作用。 有人等曾对SA与机体的免疫功能作过初步探讨, 结果认为SA水平与机体的免疫功能密切相关^［4］。 β-EP作为阿片肽家族重要一员, 对机体神经内分泌免疫系统有广泛的调节作用。 据此, 有理由认为, 血浆SA水平的调节还可能与β-EP的参与有关。
　　本实验中我们证实侧脑室注射β-EP后可降低SA水平,注射后25min降低最明显, 此后血浆SA水平渐回升。 为探索此效应的中枢部位, 本实验观察了下丘脑ARC区注射β-EP对血浆SA水平的调节作用及对机体免疫功能的影响。 结果发现, ARC区注射β-EP可导致血浆SA水平降低, 注射后25min降低最明显, 若预先静脉注射M受体阻断剂阿托品, 可完全阻断此效应。 这表明β-EP降低血浆SA水平的效应可能与M胆碱能受体的活动有关。 为进一步探索此效应的外周途径, 我们对部分动物行双侧颈迷走神经假手术及切断术, 结果表明, 假手术后, ARC区注射β-EP也可引起大鼠SA水平降低; 而迷走神经切断后, β-EP的这一效应却不再出现。 这进一步说明β-EP导致血浆SA水平降低的作用与迷走神经的中介有关, 而此中介作用的机制有待于进一步研究。
　　有大量文献报道, 在癌症、 急性炎症、 严重创伤等患者体内SA含量往往明显升高。 尤其是作为恶性肿瘤的非特异性标志物, SA水平对疾病分期、 评价疗效、 估计预后、 预测复发等具有较大的价值。 癌患者细胞表面SA含量往往大量增加, 在糖链末端可起屏蔽作用, 掩盖许多抗原位点, 使其免疫原性低下, 从而逃避免疫攻击。 所以, 临床上SA水平升高的肿瘤病人往往伴有机体免疫功能的降低。 本实验观察了ARC区注射β-EP引起血浆SA水平降低时机体免疫功能的改变。 结果发现, 外周血总T细胞(CD3)较对照组明显升高, T辅助细胞(CD4)亦升高, 而T抑制细胞(CD8)降低, CD4/CD8比值明显升高。 CD8细胞是重要的免疫调节细胞, 可抑制体液及细胞免疫功能。 此结果表明机体的免疫功能是增强的。 本实验从另一个角度证明了血浆SA水平与机体免疫功能的相关性, 旨在为肿瘤防治提供一定的实验依据。

^*山东省教委科研基金资助课题
^*Funded by the Educational Council of Shangdong Prevince

作者单位：陈文芳　陈蕾　陈家津　青岛大学医学院生理教研室,
　　　　　吕秀文　青岛大学医学院附属医院检验科, 青岛 266021

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1998-02-09收稿　　1998-07-10修回