急性低氧下β-内啡肽参与对
大鼠体液免疫的抑制性调节^*

白海波　杜继曾　郑筱祥

摘　要　　正常大鼠脑室注射β-内啡肽(β-EP)(1 ng/rat)使溶血素生成和鸡卵白蛋白的IgG抗体产生受到明显抑制, 脾脏单个核细胞DNA含量也下降; 7km 48h低氧同样使溶血素的产生明显下降, 大鼠脑室注射阿片受体阻断剂钠屈酮(naltrexone)可使低氧造成的IgG和溶血素生成抑制翻转, 低氧抑制的脾脏单个核细胞DNA合成得到部分阻断; 脑室注射β-EP与7km低氧12h一样使脾脏中儿茶酚胺含量增加。 因而, 本研究认为阿片类物质在急性低氧应激过程中参与了对大鼠体液免疫功能的调节作用。 其对低氧体液免疫功能的抑制作用可能与激活交感神经系统有关。
关键词: 低氧; 免疫; β-内啡肽; 免疫调节
学科分类号: Q46; Q494

β-ENDORPHIN INVOLVED IN THE REGULATION OF
HUMORAL IMMUNE FUNCTION OF
RATS DURING ACUTE HYPOXIA^*

BAI　HAI-BO，　DU　JI-ZENG，　ZHENG　XIAO-XIANG
（Department of Biological Science and Medical Engineering,
^#Department of Biological Science and Technology, Zhejiang University, Hangzhou 310027）

ABSTRACT　　In order to investigate the role of β-endorphin in the regulation of humoral immune function of rats during acute hypoxia, the effects of β-endorphin on mitogen-induced spleen lymphocyte DNA synthesis and hemolysin formation as well as IgG production to chicken egg albumen were observed. It was found that after rats received icv injection of β-endorphin (1 ng/rat), the T-lymphocyte DNA content, the hemolysin-forming capacity of SRBC-sensitized rats and the IgG level were reduced significantly compared with the control (icv normal saline). Similar suppressive effects on immune function could be found after rats were exposed to 7 km altitude in a hypobaric chamber for 48 h. Pretreatment with icv injection of naltrexone, the immunosuppressive effects of acute hypoxia were partially blocked. Icv administration of β-endorphin produced an increase in splenic cathcholamines, similar to those of hypoxia treated group (7 km for 12 h). All the above findings suggest that β-endorphin may modulate the immune response to hypoxia stress via opioid receptor and its inhibitory action may be mediated by activating sympathetic nervous system.
Key words: hypoxia; immunofunction; β-endorphin; immunoregulation

　　脑内β-内啡肽(β-EP)合成于下丘脑弓状核^［1］, 它主要涉及疼痛、 心血管和免疫这些与应激密切相关的功能。 目前已发现它在免疫调节中具有重要作用^［2］, 其对免疫的增强和抑制作用均有报道^［3］, 在一些应激情况下中枢β-EP升高从而发挥对免疫功能的抑制作用^［4］。 对急性低氧应激时β-EP对大鼠免疫功能的调节及其机制少见有报道。 本文以模拟高原低氧的方法探讨了β-EP对大鼠体液免疫功能的作用。

1　材料和方法

1.1　实验动物　　Wistar大鼠, 健康雄性, 鼠龄一致, 体重140±15g。 鼠源系上海实验动物中心, 在实验室饲养10 d后用于实验。
1.2　主要试剂　　钠屈酮naltrexone (NTX), Con A, β-EP, MTT, 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 为Sigma产品, 1,2-diphenylethylenediamine (DPE) 为Fulka产品, RPMI 1640为Life Technologies产品。
1.3　低氧模拟　　见文献^［5］。
1.4　脾单个核细胞DNA含量测定　　脾脏研磨制成单细胞悬液, 用生理盐水洗两次, 经稀释后离心收集细胞沉淀, 加入0.25mg/ml SDS, 37℃ 30min, 取10μl 加入2.5ml DAPI缓冲液(mmol/L): NaCl100, EDTA10, Tris10, pH7.0。 使用岛津RF-540荧光分光光度计, 在激发波长360nm, 发射波长450nm, 狭缝10nm条件下测定荧光值。
1.5绵羊红细胞(SRBC)致敏大鼠溶血素测定(定量溶血测定法)　　2% SRBC 0.2ml ip 致敏, 至实验结束时尾静脉采血20μl, 与1ml生理盐水混合离心取上清0.5ml, 加2% SRBC 0.25ml和豚鼠补体0.5ml, 37℃水浴10min后离心取上清, 经适当稀释后取200 μl转入酶标板, 用Bio-Rad Model 450酶标仪在550nm读取光密度值。
1.6　侧脑室注射　　在乙醚轻麻下切开大鼠头皮后, 用微量注射器缓慢注入生理盐水配制的药液2μl, 对照动物注入生理盐水。 动物在注入药液后5min(已苏醒)置入减压舱进行低氧模拟实验。 注射部位为颅骨矢状缝和冠状缝旁开2mm, 深3mm, 牙科钻头在注入药液前5 d预先钻好孔, 注入美蓝以验证注入部位的正确性。
1.7　IgG抗体的ELISA法　　侧脑室注射外源性β-EP(1ng/rat)后第10天, 经鸡卵白蛋白腹腔免疫(3μg /kg)的动物尾静脉采血20μl, 用PBS(含0.1% BSA, 0.05% TWeen-20)适当稀释后, 用ELISA法测定, 测定方法同我们以前报道的方法^［5］。
1.8　脾脏儿茶酚胺水平测定　　脾脏研磨制成细胞悬液, 用0.2mol/L高氯酸匀浆10000g离心, 上清加入1.0mol/L K₂CO₃中和, 取上清0.3ml加入20μ1 20mol/L铁氰化钾和100μl DPE40℃反应2h, 冰浴终止反应, 使用岛津RF-540荧光分光度计, 在发射波长485nm, 激发波长345nm, 狭缝10nm条件下测定。
1.9　数据处理　　使用统计软件, 采用均数差异性检验(t test)和单因子方差分析, Duncan法检验差异显著性, 对于严重偏态数据经Log转换后进行统计分析。

2　结果

2.1　脑室注射β-EP及低氧时注射NTX对大鼠SRBC致敏产生溶血素的影响
　　与对照组比较, icv β-EP (1ng/rat), SRBC致敏5d后, 溶血素的产生受到明显抑制, 抑制57%(P<0.01); 7km低氧48h同样使溶血素产生明显下降(38%) (P<0.01), 低氧时icv NTX (5mg/kg)或预先icv NTX再以β-EP处理, 则β-EP和低氧的抑制作用被取消(图1)。

图　1　　大鼠侧脑室注入β-内啡肽和低氧时注入钠屈酮对溶血素形成的影响
Fig.1　Effect of icv β-EP or NTX during hypoxia on the production of hemolysin
in rats
, n=6.^**P<0.01 vs control.

2.2　侧脑室注射β-EP及低氧时注射NTX对大鼠IgG抗体产生的影响
　　7km急性低氧暴露时, icv NTX (5mg/kg), 阻断低氧抑制大鼠IgG产生, icv β-EP (1 ng/rat), IgG的产生受到明显抑制, 抑制25%(P<0.01), 而icv NTX (5mg/kg)后再icv β-EP (1 ng/rat)未见β-EP的免疫抑制作用(图2)。

图　2　　低氧以及侧脑室注入β-内啡肽和低氧时侧脑室注入钠屈酮对大鼠IgG抗体产生的影响
Fig.2　Effect of hypoxia, icv β-EP, icv NTX during hypoxia on IgG production of rats
, n=6. ^**P<0.01 vs control.

2.3　侧脑室icv β-EP对脾脏单个核细胞DNA含量的影响
　　icv β-EP (1 ng/rat)后2h, 培养48h的脾脏单个核细胞DNA含量比对照组下降33%(P<0.05), icv NTX可使低氧抑制的脾脏单个核细胞DNA合成得到部分阻断(图3)。

图　3　　低氧以及侧脑室注入β-内啡肽和低氧时侧脑室注入钠屈酮对大鼠脾细胞DNA含量的影响
Fig.3　Effect of hypoxia， icv β-EP or NTX on DNA content of rat splenocytes
, n=6. ^*P<0.05 vs control.

2.4　侧脑室icv β-EP对脾脏中儿茶酚胺含量的影响
　　icv β-EP (1 ng/rat)后2 h脾脏儿茶酚胺含量比对照增加160%(P<0.01), 7 km低氧12 h脾脏儿茶酚胺含量也增加21%(图4)。

　图　4　　低氧以及侧脑室注入β-内啡肽对大鼠脾脏中儿茶酚胺水平的影响
　Fig.4　Effect of hypoxia and icv β-EP on catecholamine level in the spleen of rats
, n=6. ^*P<0.05, ^**P<0.01 vs control.

3　讨论

　　阿片类物质在多种形式应激导致的免疫功能变化中起着非常重要的作用。 本文研究结果表明, 脑室注射β-EP可导致体液免疫抑制, 这与其他研究者的实验结果类似^［6］, 在急性低氧应激中, 钠屈酮可阻断低氧的抑制作用, 表明阿片类物质也参与了低氧下对大鼠体液免疫功能的调节作用。
　　关于β-EP对免疫功能的调节机制有直接和间接两种可能。 有资料表明, 免疫细胞上有β-EP受体^［2］。 β-EP抑制淋巴细胞转化的机制, 可能是通过结合抑制性T淋巴细胞(Ts)上的相应阿片受体, 加强Ts的活性从而抑制免疫功能; β-EP也可能通过抑制淋巴细胞释放白细胞介素2(IL-2)和IL-2受体表达而抑制淋巴细胞转化^［7］。
　　低氧应激下，　β-EP还可能通过神经-内分泌-免疫系统对大鼠免疫功能起间接调节作用。 一般认为, 应激导致脑内释放的β-EP量很少, 通过血液再调节外周组织的作用甚微。 因此, 低氧可能刺激脑内β-EP升高, 再经过神经或内分泌方式间接抑制大鼠的免疫功能。 本文研究表明, 脑室注射β-EP后脾脏儿茶酚胺水平增高, 提示β-EP可能激活了交感神经系统, 有资料证明β-EP在中枢通过激活交感神经系统而抑制免疫功能^［8］。
　　β-EP对免疫功能调节作用的报道较多, 但颇有争议, 且离体和在体的结果也不一致, 在体外实验中, 内源性阿片肽通常促进免疫反应, 但在体内实验中常表现出抑制免疫反应及损害肿瘤排斥作用, 体外应用纳洛酮通常难以拮抗阿片肽的作用, 其调节作用的差异往往与阿片肽的种类、 使用剂量、 给药途径、 受体种类、 免疫反应等有关^［9～12］。 应激时阿片类物质对免疫功能的调节更为复杂, 不同机能状态, 不同条件下可能作用不同, 这方面的研究还不够深入。 本实验仅在急性低氧应激时β-EP的体液免疫调节做了初步的探讨, 尚需更进一步的研究。

^*国家自然科学基金 (39470277) 和中国博士后科研基金资助项目
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39470277) and the postdoctoral Foundation of China

作者单位：白海波　郑筱祥　浙江大学生命科学与医学工程学系;
　　　　　杜继曾　浙江大学生命科学与技术系, 杭州 310027

参考文献

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1998-07-01收稿　　1998-10-14修回