鲫鱼视网膜锌离子分布的光、电镜观察^*

杜卫东　包永德^**

摘　要　　本文应用neo-Timm染色法, 观察了鲫鱼视网膜内锌离子的分布情况以及明、 暗适应条件下鲫鱼视网膜内锌离子分布的变化。 结果发现: 明适应条件下, 外网层、 部分光感受器、 双极细胞、 无长突细胞以及神经节细胞胞体锌离子着色明显。 含锌光感受器和双极细胞的突起伸入外网层。 暗适应条件下, 外网层锌离子染色减弱抑或消失(P<0.01)。 外核层胞体锌离子染色阴性, 少数散在分布的视锥细胞呈锌离子阳性。 上述资料提示, 明适应条件下外网层视觉通路1、 2级神经元之间突触组构区存在锌离子, 并在暗适应条件下释放, 为锌离子在视网膜内信号调制中起重要作用提供了形态学证据。
关键词: 锌离子; 视网膜; 明、 暗适应; neo-Timm染色法; 鲫鱼
学科分类号: Q436

LIGHT AND ELECTRON MICROSCOPIC OBSERVATION OF
ZINC DISTRIBUTION IN THE CARP RETINA^*

DU　WEI-DONG，　BAO　YONG-DE^**
(Shanghai Institute of Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031)

ABSTRACT　　Localization of zinc in the carp retina in both light and dark adaptation was investigated using neo-Timm sulfate silver method. The results showed that in light adaptation, zinc was preponderantly present in the outer plexiform layer (OPL). Both terminals of zinc containing photoreceptors and dendrites of bipolar cells usually extend into zinc staining areas in OPL. In dark adaptation, zinc staining in retina is blanched or only appeared in cytoplasmic bodies of few cones. There is no significant difference between dark and light adaptation in the zinc distribution in bipolar, amacrine and ganglion cells. The fact that zinc is perched in the carp retina between photoreceptors and second-order neurons of the visual pathways in OPL in light adaptation and significantly released in dark adaptation suggests that zinc might play some modulatory roles in the visual signal transduction.
Key words: zinc; retina; light and dark adaptation; neo-Timm staining; carp

　　锌离子是一种过渡性二价金属离子。 已知大鼠海马、 猫视觉皮层、 鼠嗅觉皮层等的神经元富含锌离子。 这些锌离子能被活跃地摄取并被存储在神经末梢的突触囊泡内。 刺激这些含锌神经纤维可诱发锌离子的释放。 近期的资料进一步证实, 锌离子可作为神经调质, 随谷氨酸等神经递质一起释放, 对谷氨酸受体和GABA受体起重要的调制作用^［1］。 视网膜作为中枢神经系统的外延部分, 业已发现其中存在与中枢神经系统相似的神经递质及其受体, 关于视网膜内锌离子含量与分布的研究目前仅见零星报道^［2～4］。 本文主要应用neo-Timm染色方法, 同时辅以喹啉荧光染色法, 研究鲫鱼视网膜内锌离子的分布情况以及明暗适应变化对这种分布的影响。 我们的研究首次表明: 位于视网膜1, 2级神经元之间突触组构区-外网层存在的锌离子, 在暗适应条件下被释放, 为锌离子对视网膜内信号调制起重要作用提供了直接的形态学证据。

1　材料和方法

1.1　材料　　4～5月份间鲫鱼36条, 体长10～15cm, 性别、 品种不限。 从市郊鱼塘捕获后饲养于室内玻璃水缸内, 水由气泵充气并保持循环。 在自然光照条件饲养。
1.2　动物模型的制备　　实验前将动物随机分为两组, 分别放置于明、 暗环境中5h以上。 分别在明光和暗红光下取视网膜。
1.3　neo-Timm染色^［3,16］　　具体操作参见文献^［20］, 灰度统计取明暗适应组标本各10例,用Leica Q500 MC图像分析仪对外网层锌离子图像灰度进行分析, 检测明、 暗适应条件下外网层锌离子的含量变化情况, 以样本±s表示, 进行t检验。 电镜标本制备: 标本放入0.1mol/L PB (pH 7.4)漂洗1～2h, 标本显色后入0.1mol/L PB (pH 7.4), 4℃, 漂洗过夜。 系列乙醇脱水, 环氧丙烷置换, Epon 812包埋, 制作超薄切片。 Epton-100型透射电镜下观察、 摄片。

2　结果

2.1　neo-Timm染色
　　光镜下, 锌离子位于鲫鱼视网膜光感受器的内段、 胞体、 细胞间细小突起及其终末突起, 外网层、 双极细胞和无长突细胞的突起以及神经节细胞等处。 外网层锌离子染色颗粒密集, 呈条带状分布。 无长突细胞的阳性突起则向神经节细胞层延伸。 水平细胞未见锌离子着色。 经腹腔注射双硫腙 (150mg/kg)后, 视网膜neo-Timm染色为阴性反应。
　　明、 暗适应对鲫鱼视网膜锌离子的含量的影响主要集中在外网层以及外核层光感受器胞体等处。 明适应条件下, 视网膜外网层锌离子条带着色明显。 部分光感受器(视锥为主)锌离子染色阳性, 其内段缩短, 锌离子着色浓密。 外段锌离子染色阴性。 含锌光感受器终末突起以及双极细胞的树突常伸入外网层锌离子条带内(图1A, 见图版Ⅰ)。 暗适应条件下, 外网层锌离子染色条带减弱抑或消失, 光感受器内段锌离子染色减弱或为阴性(图1B, 见图版Ⅰ), 外核层胞体染色阴性或仅见于少数散在分布的视锥细胞内, 其内段明显伸长, 纤细, 锌离子染色仍为阳性, 阳性终末伸入外网层。 双极细胞、 无长突细胞及神经节细胞等锌离子染色与明适应组染色结果无异(图1,C,E; D,F, 见图版Ⅰ)。 视网膜外网层锌离子图像灰度分析结果表明, 明适应组外网层锌离子含量为67.34±13.29, 暗适应组则为167.24±3.45, 比较明、 暗适应组外网层锌离子的含量, 有显著性差异(P＜0.01)。

　　电镜下, 经neo-Timm染色后的视网膜超微结构保存较差, 带型突触内的电子致密带电子密度较弱。 在明适应和暗适应条件下, 锌离子在鲫鱼视网膜超微水平上的分布不同, 主要集中在外网层光感受器突触终末上。 明适应组锌离子位于部分光感受器(多为视锥)内段肌样体区(图2, 见图版Ⅱ)、 胞体(图2B, 见图版Ⅱ)以及突触终末内(图2Ca,Cb, 见图版Ⅱ)。 内段富集线粒体的椭圆体区近外侧部于线粒体之间偶见散在锌颗粒。 值得一提的是, 光镜下外网层呈浓染条带状分布的锌离子, 电镜下总是位于部分光感受器突触终末处, 呈高电子密度的小圆形颗粒, 其数量估计不到5％。 外核层光感受器间胞膜连接以及外网层光感受器与双极细胞树突之间所形成的基部连接处, 可见锌离子阳性产物呈簇状或线状分布(图2D, 见图版Ⅱ)。 另外, 锌离子亦可见于部分双极细胞、 无长突细胞以及神经节细胞的胞体。 神经节细胞和内网层少数双极细胞的轴突含有少量锌离子颗粒(图2Ea,Eb, 见图版Ⅱ)。 光感受器外段膜盘区、 内段椭圆体区大部以及内核层水平细胞锌离子染色阴性。 暗适应组光感受器突触终末内锌离子染色颗粒稀少或缺如(图2F, 见图版Ⅱ), 或仅局限于光感受器突触终末与双极细胞间的接触面。 内段肌样体区锌离子减少或仅局限于少数视锥伸长的肌样体区。 双极细胞、 无长突细胞、 神经节细胞锌离子的分布和变化与明适应组相似。

2.2　喹啉荧光染色
　　明适应条件下, 视网膜光感受器内段及外网层显示较强的锌离子喹啉荧光, 中间外核层偶见光感受器阳性, 所形成的锌离子荧光的分布与neo-Timm染色结果相似。 内核层及神经节细胞层阴性或少数细胞显示微弱的荧光。 暗适应条件下, 外网层锌离子荧光条带消失或微弱(资料未显示)。

3　讨论

　　目前用于锌离子组织化学定位的方法有银染法(neo-Timm硫化银法和硒法)、 双硫腙法及喹啉荧光法。 由于银染法敏感性较高并能在光、 电镜下进行观察, 其染色强度在一定程度上能反映出突触囊泡内的锌含量, 故较为常用^［5］。 虽然双硫腙法和喹啉荧光法的特异性固然相对较高, 但由于敏感性较差, 目前主要用于验证neo-Timm法的实验结果。 应当指出的是, neo-Timm法只能对离子状态、 疏松结合或螯合状态下的锌离子染色^［6］, 而对存在于蛋白质内部, 并与之紧密结合的锌离子不能染出^［7］。 neo-Timm过染有时会使视网膜几乎所有的神经元胞核及胞体呈棕褐色。 有人认为, 这是由于含锌量不同缘故^［8］。 但也有人认为, 这是由于显影剂导致的非特异性吸附^［9］。 我们更倾向于后一种观点, 因为此时阳性细胞周边部常有银颗粒呈无序性分布。 在前人工作的基础上, 我们对视网膜浸泡、 硫化等条件进行了摸索^［4,10］。 我们的经验是, 视网膜锌离子的显现与硫化钠的质量、 硫化时间以及显色剂的配制条件有一定的关系。 经neo-Timm染色后超微结构保存不佳, 推测可能与硫化钠处理、 固定不佳和偏酸显色液(pH3.6～3.8) 浸泡等因素有关。 双硫腙 (150mg/kg)经腹腔注射后视网膜neo-Timm染色转为阴性, 提示neo-Timm染色阳性产物可能为锌离子。 喹啉荧光法染色也进一步证实了这一点。
　　锌离子是神经组织内含量最为丰富的二价阳离子之一, 其中特异性位于轴突终末或突触囊泡内的锌离子虽然含量较少, 占脑内含锌量的5%～10%, 却具有非常重要的功能。 尽管关于中枢神经系统锌离子定位的研究富有成果, 但关于视网膜锌离子分布的研究却仅有零星报道, 且结论不一。 已有资料表明眼球组织内锌离子的含量较高^［2］。 牛视网膜亚细胞组分析^［3］, 锌离子位于光感受器的外段及突触终末内。 大鼠视网膜双硫腙染色^［11］却提示锌离子仅位于光感受器的外段内。 虎蝾螈视网膜neo-Timm染色则发现锌离子位于光感受器胞体及其终末以及内核层某些细胞突起。 锌离子的分布部位及电生理的结果提示了锌离子可能参与GABA等受体调节, 进而在视网膜信号调制过程中起重要作用^［4］。 本文neo-Timm染色光、 电镜观察结果证实, 明、 暗适应变化对鲫鱼外网层及光感受器锌离子的分布产生明显影响, 为上述假设提供了形态学依据。 光感受器和双极细胞均为谷氨酸能神经元, 明适应条件下外网层内的锌离子几乎总是位于突触囊泡内, 长时间暗适应 (大于5小时) 引起的去极化反应可使光感受器突触囊泡内随谷氨酸呈持续性释放的锌离子趋于耗竭。 因此光感受器胞体及其突触囊泡neo-Timm染色趋于阴性。 其中锌离子释放最可能的机制是富锌囊泡的胞吐作用^［1］。 光感受器终末突触囊泡锌离子阳性, 其意义推测有二: (1)囊泡内的确含有锌。 明适应条件下外网层视觉通路第1、 2级神经元间突触组构区存在锌离子, 并在暗适应条件下释放, 为锌离子作为神经调质电生理资料研究提供了有力的形态学依据; (2)作为突触部位细胞组构蛋白的成分之一, 如磷脂酶A2, 参与对突触囊泡向功能活动区的位移、 融合以及囊泡更新等的调节或作为代谢酶的辅基(如乙醇脱氢酶等)^［12,13］, 参与视网膜光感受器的生化代谢过程。 光感受器突触终末锌离子阳性囊泡据估计不到5%。 即便如此, 在同一染色条件下, 突触囊泡内锌颗粒的多少基本能反映出明、 暗适应变化的影响。
　　光感受器内段肌样体区锌离子的含量随明、 暗适应条件的变化亦有差异, 提示该部位的锌离子也可能作为囊泡锌的来源, 并参与视网膜明、 暗适应的代谢调节过程。 光感受器外段膜盘为视色素分子所在部位, 具有产生光化学反应的功能。 尽管曾有文献报道牛和大鼠视网膜该部位富集锌离子^［1,3］, 但本文neo-Timm法光、 电镜观察及喹啉荧光法染色结果均未观察到外段有锌离子, 其原因值得进一步研究。
　　GABA为抑制性神经递质。 尽管电生理资料已提供了锌离子对GABA受体调制的证据^［14］, 但迄今尚未见到中枢神经系统GABA能通路中含锌神经元存在的报道^［15］。 本文光镜观察结果表明, 至少部分无长突细胞锌离子染色阳性, 电镜下进一步发现锌离子位于无长突细胞的胞体或胞膜。 从理论上讲, 某些无长突细胞可以是GABA能的^［16,17］, 然而, 这些含锌无长突细胞是否同时就是GABA能神经元, 目前尚无法肯定。 推测锌离子可能通过调节GABA合成限速酶－氨基丁酸酶(GAD)活性, 以改变GABA的含量来调制GABA受体复合体的功能。 但其确切机制尚有待于进一步探讨。
　　有趣的是, 猫视觉皮层亦富集锌离子^［18,19］。 结合本文的研究结果, 即光感受器、 双极细胞、 无长突细胞以及神经节细胞含有锌离子的事实, 推测视觉通路亦可能为含锌性的, 其相关内容值得进一步研究。 值得一提的是, 尚有少量鲫鱼视网膜在相同的染色条件下, 明、 暗适应组间外网状层锌离子染色并无明显差异, 其原因可能与国内鲫鱼品种混杂, 生理状况不一所引起, 因此, 本文观察到的现象值得用遗传背景清楚、 生理状态一致、 对光反应敏感的物种进行详细的分析。

　　感谢李继硕教授和杨雄里教授对本工作的关心和指导。

^*国家“八.五”攀登项目“脑功能及其细胞及分子机制”支持课题
^**联系作者
^*Supported by the Basic Research Climbing Program (P.8514)
^**Corresponding author

作者单位：中国科学院上海生理研究所, 上海 200031

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1998-06-10收稿　　1998-09-07修回