血管平滑肌细胞增殖与Cdk抑制蛋白p27的表达*

袁勇　许顶立　刘伊丽　贾满盈

摘　要　　p27蛋白是细胞周期素依赖性激酶(Cdk)抑制蛋白家族中的一种, 主要对外部促进或抑制细胞增殖的信号起反应。 本研究应用流式细胞仪(FCM)双标记的方法观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、 血管加压素(AVP)和血小板源生长因子(PDGF)对血管平滑肌细胞(VSMCs)细胞周期百分比和p27蛋白表达量的影响。 静止状态培养的VSMCs加入AngⅡ, AVP, PDGF-BB后, 在不同时间收集细胞, 用碘化丙啶(PI)标记细胞DNA, 以确定细胞所处的周期。 用p27蛋白的单抗和标记了FITC的二抗标记细胞, 通过流式细胞仪测定被激发出的荧光量来确定细胞p27蛋白表达的相对量。 结果显示, AngⅡ刺激VSMCs增生, 其蛋白含量增加了43.6% (P<0.01), 但不抑制p27蛋白的表达; AVP可轻度抑制p27的表达, 有轻度促进VSMCs增殖和增生的作用(P<0.05); PDGF明显抑制p27的表达, 引起细胞增殖。 本研究结果提示, p27蛋白抑制VSMCs通过G1期进入S期, 是抑制VSMCs增殖的重要调节因子。
关键词: p27蛋白; 细胞周期; 血管平滑肌细胞; 流式细胞仪
学科分类号: R543.5

EXPRESSION OF CYCLIN DEPENDENT KINASE
INHIBITOR p27 DURING PROLIFERATION
IN VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELL

YUAN　YONG，　XU　DING-LI，　LIU　YI-LI,　JIA　MAN-YING
(Department of Cardiology, Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515)

ABSTRACT　　This study was to investigate cell cycle distribution of the vascular smooth muscle cells (VSMCs) and negative regulator of cell proliferation p27 expression caused by platelet derived growth factor BB (PDGF-BB), angiotensin Ⅱ (AngⅡ) and arginine vasopressin (AVP). Deprived of fotal calf serum for 48h, cultured VSMCs in quiescent condition were collected at different times after stimulation of AngⅡ, AVP and PDGF-BB. Cell cycle distribution and p27 expression were determined with a flow cytometer. The results showed that the protein content of VSMCs was significantly increased (43.6%) by AngⅡ as a result of hypertrophy, but AngⅡ did not lead to downregulation of p27. AVP could downregulate p27 slightly. PDGF could inhibit p27 expression significantly and cause VSMCs hyperplasia. These results suggest that the progression of VSMCs through G1 to S phase might be brought out by the inhibition of p27 during proliferation.
Key words: p27; cell cycle; vascular smooth muscle cell; flow cytometer

　　血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和增生是动脉粥样硬化、 高血压、 冠状动脉腔内成型术术后再狭窄的主要病理表现, 引起VSMCs增殖或增生的信号转导机制目前尚不完全清楚, 但揭示VSMCs增生或增殖的信号转导通路具有重要意义［1］。
　　VSMCs增生或增殖的早期信号转导通路是相似的, 例如: Ca2+, PKC, 酪氨酸激酶, Ras, Raf, MAPK, 因而弄清下游两条信号转导通路的区别是非常重要的［2］。 在细胞周期G1末期存在一个限制点(restriction point, R点), 细胞能否越过它是细胞增殖的关键［3］, 后者是由G1期的细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶(Cdk)调节的。 Cdk抑制蛋白是细胞内可抑制Cdk活性的蛋白质家族的总称, 细胞外抗增殖信号就是通过这些抑制蛋白而起作用的［4］。 p27蛋白是Cdk抑制蛋白家族中的一种, p27主要对外部促进或抑制增殖的信号起反应。 以往的研究大多在肿瘤细胞中进行, 发现在静止的肿瘤细胞中p27具有相当高的活性, 而在增殖的肿瘤细胞中活性却明显减低［5,6］。 而p27蛋白在VSMCs增殖中的作用目前尚不清楚。
　　本研究应用流式细胞仪(FCM)双标记的方法观察血管紧张素Ⅱ、 血管加压素和血小板源生长因子对VSMCs细胞周期百分比和p27蛋白表达量的影响, 说明外部促进VSMCs增殖的因素可能是通过调节p27蛋白的表达而引起VSMCs增殖。

1　材料和方法

1.1　材料　　血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、 血小板源生长因子BB (platelet-derived growth factor, PDGF-BB)、 血管加压素(arginine vasopressin, AVP)、 碘化丙啶(PI)购于美国Sigma 公司, DMEM、 胰蛋白酶、 胎牛血清购于美国GIBCO公司, 抗p27单克隆鼠抗人抗体(一抗)由美国哈佛大学麻省总医院(MGH)病理科Dr. Wu惠赠, 荧光标记羊抗鼠抗体(二抗)购于军事医学科学院, 流式细胞仪Elite型(美国Coulter公司)。
1.2　VSMCs的培养及处理　　参照Campbell JC的方法［7］。 无菌取出7～8周雄性SD大鼠(本校动物所)的胸主动脉。 将血管中膜剪成1mm大小的组织块, 加入含10%胎牛血清的DMEM, 置于37℃　5% CO2孵箱中培养。 在光、电镜下鉴定, 并用抗α-actin的单抗鉴定VSMCs。 实验用第4～6代细胞, 实验前48h换成不含血清的DMEM, 使细胞处于静止状态。
1.3　细胞生长率的测定　　将消化下的VSMCs悬液(浓度为1×105个/ml), 分别接种于6孔板, 每孔3ml, 让细胞贴壁后加入无血清DMEM 48h使之静止。 在无血清DMEM中加入AngⅡ10－6mol/L， AVP 10－6mol/L， PDGF-BB10ng/ml, 无血清DMEM培养作为对照。 1～5d内, 每天取3孔进行消化, 计算细胞数, 取其均值。
1.4　细胞蛋白含量的测定　　采用Bradford方法测定。 经过AngⅡ10－6mol/L， AVP 10－6 mol/L ， PDGF-BB10 ng/ml处理24h的细胞, 用4℃　PBS冲洗细胞两次, 然后加入600　μl的细胞裂解液, 其成分为: 50mmol/L β-磷酸甘油(β-glycerophosphate), 100μmol/L 钒酸钠(Na3VO4), 2.0mmol/L氯化镁(MgCl2), 1.0mmol/L EGTA, 0.5% Triton X-100, 1.0mmol/L DTT。 用细胞刮子把细胞收集到Eppendorf管中。 4℃10000g离心10min, 取上清液用756MC型紫外分光光度计进行蛋白检测, 波长为595nm, 根据测出的OD值与标准曲线比较得出样本的蛋白含量。
1.5　流式细胞仪测定［8］　　静止细胞加入刺激因素作用24h, 收集细胞, 用PBS洗两遍, 离心, 去掉上清液, 留0.5ml细胞悬液, 用震荡器使之分散, 用注射器将细胞迅速注入4℃70%冷乙醇中, 4℃保存, 至少18h。 离心收集细胞, 加入RNA酶(终浓度为50μg/ml), 内含0.1% Triton X-100, 37℃水浴30min后, 放入冰浴中, 停止RNA酶的作用。 加入抗p27(鼠抗人)抗体50μl, 4℃过夜。 PBS洗两次后加入荧光标记的二抗50μl(羊抗鼠FITC), 37℃水浴30min。 PBS洗两次, 加入碘化丙啶(PI), 终浓度为50μg/ml, 保存在冰浴中暗处至少30min, 上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。
　　PI和FITC被激发出的荧光互不影响, 因此, 根据PI标记的DNA含量可确定细胞所处的细胞周期, 同时根据FITC被激发出的荧光量的多少来确定细胞p27蛋白表达的相对量。
1.6　统计学处理　　各组数据采用均数±标准差(xx-05.gif (95 bytes)±s)表示, 两组之间用配对t检验, 多组百分率比较用u检验, P<0.05表示差异有显著性。

2　结果

2.1　AngⅡ, AVP, PDGF-BB对VSMCs生长的影响
　　在无血清培养液中加入AngⅡ 10－6mol/L, AVP 10－6mol/L, PDGF-BB 10ng/ml。　 结果表明, 加入PDGF-BB 1 d即表现明显的促进VSMCs增殖的作用(P<0.01); AVP有轻度促进VSMCs增殖的作用(P<0.05), 在培养的第4天有统计学的显著差异; 而AngⅡ并不刺激VSMCs增殖, 和对照组相比较没有区别(表1)。

表 1　AngⅡ, AVP, PDGF-BB对VSMCs生长的影响
Table 1　Effects of AngⅡ, AVP and PDGF-BB on VSMCs growth (×105cell/ml)

 

　

　1 d

　2 d

　3 d

　4 d

　5 d

Control

1.05±0.08

1.10±0.06

1.20±0.10

1.15±0.08

1.25±0.09

Ang Ⅱ (10－6 mol/L)

1.08±0.07

1.16±0.06

1.20±0.13

1.23±0.06

1.26±0.05

AVP (10－6 mol/L)

1.13±0.11

1.25±0.16

1.36±0.10

1.46±0.14*

1.52±0.13*

PDGF (10 ng/ml)

1.37±0.14*

1.65±0.20*

1.82±0.24*

1.95±0.17**

2.01±0.18**

 


Values are expressed as xx-06.gif (95 bytes)±s. n=3. *P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

2.2　AngⅡ, AVP, PDGF-BB对VSMCs蛋白含量的影响
　　在无血清培养液中加入AngⅡ 10－6mol/L, AVP 10－6mol/L, PDGF-BB 10ng/ml, 蛋白含量见表2。 AngⅡ刺激VSMCs增生, 和不含血清的DMEM作用相比较其蛋白含量增加了43.6% (P<0.01), AVP有轻度促进VSMCs增生的作用(P<0.05), 而PDGF-BB无促进VSMCs增生的作用。

表 2　AngⅡ,AVP,PDGF-BB对VSMCs蛋白含量的影响
Table 2　Effects of AngⅡ, AVP and PDGF-BB on VSMCs protein content (mg/106cell)

 

Treatment

Protein content

Control

2.64±0.2

AngⅡ 10－6mol/L

3.79±0.1**

AVP 10－6mol/L

3.12±0.3*

PDGF-BB 10ng/ml

2.63±0.2

 


Values are expressed as xx-07.gif (95 bytes)±s. n=3.*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

2.3　AngⅡ, AVP, PDGF-BB对VSMCs p27表达的影响
　　从表3可以看出, 不含血清的DMEM培养48h可使VSMCs处于静止状态, 细胞主要处于G0-G1期, 静止状态时p27的表达为48.1±5.6, PDGF-BB可抑制p27的表达, 促进VSMCs从G1期进入S期。 AngⅡ并不抑制p27蛋白的表达, 对VSMCs细胞周期比例的分布也没有影响。 AVP的作用介于PDGF和AngⅡ之间, 有轻度抑制p27的表达作用。

3　讨论

　　VSMCs的增殖与动脉粥样硬化、 高血压、 再狭窄等疾病密切相关。 VSMCs的生长受许多细胞因子如AngⅡ、 AVP、 PDGF-BB的调节, 但它们对VSMCs的作用并不完全相同, 而且因实验方法的不同会有很大的差别［9］。 本实验观察了在无血清培养条件下AngⅡ、 AVP、　PDGF-BB对VSMCs的作用。 结果表明, PDGF-BB是强有力的有丝分裂原, 可明显地促进静止的VSMCs增殖, 促进VSMCs通过G1期进入S期。 在无血清培养条件下，　AngⅡ使VSMCs大部分处于G0-G1期, 没有越过G1末期的限制点, 但是能促进VSMCs蛋白合成增加, 诱导VSMCs增生。 因此, AngⅡ对静止的VSMCs没有促进增殖作用。 AVP可轻度促进VSMCs增殖, 又可轻度诱导VSMCs蛋白合成增加, 其作用介于AngⅡ和PDGF-BB之间。 实验提示AngⅡ, AVP, PDGF-BB是研究VSMCs增殖和增生信号转导合适的刺激因子, 和文献报道相一致［9］。

表 3　AngⅡ, AVP, PDGF-BB对VSMCs细胞周期分布和p27蛋白表达的影响
Table 3　Effects of AngⅡ, AVP and PDGF-BB on VSMCs cell cycle distribution and p27 expression

 

Treatment

Cell cycle distribution

p27

　G0-G1%

S%

G2-M%

Control

87.8±3.2

　6.5±1.1

　5.7±0.6

48.1±5.6

AngⅡ 10－6mol/L

88.9±2.8

　5.4±0.6

　5.7±0.5

46.0±6.4

10－8mol/L

84.4±4.7

　7.3±0.8

　8.3±0.6

45.7±5.8

10－10mol/L

84.1±6.3

　7.1±0.7

　8.8±0.5

47.4±4.7

AVP 10－6mol/L

82.7±3.5

10.4±1.1

　6.9±0.4

10.4±3.1*

10－8mol/L

83.1±2.1

　7.8±0.7

　9.2±0.8

11.7±1.2*

10－10mol/L

83.4±1.4

　8.5±0.8

　8.1±0.7

12.8±2.3*

PDGF-BB 20ng/ml

77.5±3.6*

15.5±0.8

　6.8±0.3

　1.8±0.8**

10ng/ml

80.8±2.6*

　7.4±1.2

11.8±0.9

　2.1±0.5**

 


Values are expressed as xx-08.gif (95 bytes)±s. n=3. *P<0.05, **P<0.01 compared with control group.

　　近年来, 在引起VSMCs增殖或增生的共同信号转导通路方面的研究取得了不少成果。 研究结果表明, 在体内存在的促进VSMCs增殖或增生的激动剂, 根据其膜上受体结构的不同主要分为两类。 一类为酪氨酸激酶受体激动剂, 配体与受体结合后受体本身可以被酪氨酸激酶自动磷酸化, 这类激动剂主要是各种生长因子, 以血小板源生长因子(PDGF)为代表; 另外一类为G蛋白偶联受体激动剂, 受体都具有7个跨膜结构, 可通过激活与之相连的G蛋白而引起信号向下传导, 这类激动剂主要包括内皮素、 肾上腺素、 血管加压素、 血管紧张素Ⅱ等［2］。 但引起VSMCs增殖或增生的下游信号转导机制目前尚不完全清楚, 弄清楚细胞内VSMCs增殖或增生的信号转导路将为临床上限制或逆转VSMCs增殖提供理论基础。
　　在肿瘤细胞的研究中发现, 细胞内还存在着一类抑制CDK活性的蛋白质家族, 对细胞周期进展起负调节作用, 称为CDK抑制蛋白(CKI)［3,10］。 在肿瘤细胞中, CKI中起主要抑制作用的有p21和p27, p21监督细胞的内部状态, 主要表现在DNA损伤介导的细胞周期抑制及损伤修复［11］。 p27则特异性抑制Cyclin E-CDK2的激酶活性, 而Cyclin E-CDK2的浓度是细胞通过R点的最关键因素。 p27mRNA在增殖细胞的整个细胞周期中保持相对恒定的水平, 但其蛋白表达量却因细胞所处时期不同而不同。 因此, 对p27的调节主要表现在翻译后水平［12］。 已有研究表明, p27与肿瘤的相关性不是表现为缺失或突变, 而是呈现化学剂量关系, 即在原发性肿瘤及细胞系中, 游离的p27的量远远低于正常细胞中的量［13］。
　　本实验主要研究p27蛋白表达与VSMCs增殖或增生的关系。 显示在静止的VSMCs 中p27蛋白的表达处于较高水平, PDGF-BB可完全抑制p27蛋白的表达, 可明显地促进静止的VSMCs增殖, 但对VSMCs增生没有明显的影响。 AngⅡ不抑制静止的VSMCs中p27蛋白的表达, 对静止的VSMCs细胞周期分布的百分比也没有影响, 但可明显促进静止的VSMCs增生。 AVP可轻度抑制p27蛋白的表达, AVP对静止的VSMCs既有轻度促进其增殖, 又有轻度促进增生的作用。 提示p27蛋白对VSMCs的作用和对肿瘤细胞的作用相似, 抑制VSMCs通过G1期进入S期, 使细胞主要处于G1期, 从而抑制了细胞的增殖［4,9］。 证实p27蛋白是在R点连接促VSMCs增殖或增生信号和细胞周期之间信号转导链的重要物质。 然而, PDGF-BB是如何抑制p27蛋白的表达尚需要进一步研究。

*国家自然科学基金资助项目 (No.39770325)
*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39770325)

作者单位：第一军医大学南方医院心内科， 广州 　510515

参考文献

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1998-04-17收稿　　1998-09-21修回