大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其调控^*

朱发明^**　文志斌　何晓凡　李俊成　贺石林

摘　要　　本实验观察了基础培养条件和凝血酶刺激条件下, 大鼠星形胶质细胞组织因子活性的表达及其信号传递途径。 结果显示, 基础条件下, A₂₃₁₈₇(4-bromo calcium ionophore)和佛波醇脂(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)能明显提高星形胶质细胞组织因子活性的表达, 而三氟吡啦嗪(trifluoperazine, TFP)和1-(5-异喹啉磺胺)-3-甲基哌嗪［1-(5-isoquinolinyl sulfonyl)-3-methyl-piperazine, H₇］则降低星形胶质细胞组织因子活性的表达。 凝血酶能明显增加星形胶质细胞表达组织因子活性; 当凝血酶与TFP或H₇联合应用时, 凝血酶的刺激作用受到明显抑制。 实验表明, 星形胶质细胞在基础培养条件下能表达组织因子, 凝血酶能刺激它表达组织因子活性。 Ca²⁺/钙调素和PKC途径参与了在基础条件以及凝血酶刺激条件下星形胶质细胞组织因子活性的表达。
关键词: 星形胶质细胞; 组织因子; 蛋白激酶C; 钙调素; 凝血酶
学科分类号: Q461; R331.1

EXPREESION OF TISSUE FACTOR OF ASTROCYTES AND
ITS SIGNAL TRANSDUCTIONAL PATHWAYS^*

ZHU　FA-MING^**，　WEN　ZHI-BIN，　HE　XIAO-FAN
LI　JUN-CHENG，　HE　SHI-LIN
(Department of Physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)

ABSTRACT　　The aim of this study was to observe the expression of tissue factor(TF) of astrocytes in basic culture medium and under the condition stimulated by thrombin and to explore the relevant signal transduction pathways. The results showed that 4-bromo calcium ionophore (A₂₃₁₈₇) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) enhanced significantly the TF expression of astrocytes, but the expression was decreased markedly by trifluoperazine (TFP) and 1-(5-isoquinolinyl sulfonyl)-3-methyl-piperazine (H₇) in the basic medium. Thrombin increased significantly the TF expression of astrocytes, which was obviously inhibited by TFP and H₇. The results above indicate that astrocytes can express TF activity in the basic medium, which is promoted by thrombin, probably through some pathways involving Ca²⁺/CaM and protein kinase C (PKC).
Key words: astrocyte; tissuse factor; protein kinase C; calmodulin; thrombin

　　近几年的研究表明, 组织因子途径是生理性止血中凝血过程与病理条件下血栓形成的启动环节^［1,2］。 组织因子(tissue factor, TF)作为因子Ⅶa的受体在组织因子途径中起关键性作用。 它广泛分布于脑、 肺等组织。 血管内皮下的成纤维细胞、 平滑肌细胞以及血管外的各种组织细胞都程度不同地表达组织因子, 尤其在血管周围组织因子分布比较丰富, 这对血液循环系统的完整性起着保护套的作用。 早已知道, 脑组织富含组织因子, 但长期来对它的来源并未确定。 新近发现星形胶质细胞(astrocyte, AS)是脑组织中TF的主要来源, 并已达成广泛的共识^［3,4］。 但对AS在不同条件下TF活性表达情况及其调控机理, 尚未见报道。 本实验观察了在基础培养条件下, AS的TF活性表达情况, 以及凝血酶对AS表达TF活性的影响及其可能的信号传递机制。

1　材料与方法

1.1　星形胶质细胞培养　　按Hertz L等报道的方法^［5］培养Wistar 乳鼠(出生后24h内)星形胶质细胞。 星形胶质细胞能特异性分泌神经胶质纤维样酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 本实验采用GFAP抗原间接免疫荧光法进行鉴定^［4］。
1.2　试剂和药品　　DMEM培养基干粉、 A₂₃₁₈₇、三氟吡啦嗪(TFP)、 佛波醇脂(PMA)、 H₇、兔抗鼠神经胶质纤维样酸性蛋白单抗、 异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的羊抗兔 IgG 抗体均为美国Sigma产品; 凝血酶为中国医学科学院血液学研究所产品; dansyl-Glu-Gly-Arg-chloromethyl ketone Ⅶa (DEGR-Ⅶa) 由Taylor FB Jr惠赠; 抗组织因子单克隆抗体由Morrissey JH惠赠。
1.3　实验方案　　将同源传代的单层星形胶质细胞(F1代)接种于24孔板上, 每孔接种细胞数为5×10⁴, 37℃、 5% CO₂饱和湿度下培养。 待24孔板细胞完全融合成片后去培养液, 用D-Hank′s液洗涤3遍。 然后分组加含不同刺激物的完全DMEM 1ml。 对照组只加完全DMEM 1ml。 37℃、 5% CO₂饱和湿度培养6 h后制备细胞悬液, 贮于－40℃待测^［4］。
1.4　TF检测方法
1.4.1　AS冻融液促凝活性的测定　　采用一期凝固法^［4］。
1.4.2　TF活性确认方法　　为确认星形胶质细胞冻融液的促凝活性来自TF, 本实验从以下两方面加以证实^［6,7］。 (1) 生物活性特异性: dansyl-Glu-Gly-Arg-chloromethyl ketone Ⅶa(DEGR-Ⅶa)能和FⅦa竞争性地与TF结合, 但DEGR-Ⅶa/TF丧失了对因子Ⅹ的激活能力, 当血中DEGR-Ⅶa远远大于血浆Ⅶa的浓度(100倍), TF的促凝活性可完全中止。 (2) 抗原特异性: 抗TF单抗只与TF发生特异性结合, 随着TF单抗浓度增大, TF的促凝活性逐步被中和。 当TF单抗浓度增加到一定时, TF促凝活性可完全中止。 DEGR-Ⅶa与TF单抗对其它凝血因子活性无直接影响。
1.5　统计学分析　　测定结果以均数±标准差(±s) 表示, 采用INSTAT统计软件, 组间比较采用F检验。 若F>F_0.05, 则两两比较用q检验, P<0.05表示具有统计学意义。

2　结果

2.1　星形胶质细胞的鉴定
　　使用抗GFAP单抗组在荧光显微镜下, 可见99%以上的细胞呈现黄色荧光, 而无单抗组荧光显微镜下无荧光表现, 表明培养的细胞绝大多数属于星形胶质细胞。 加各刺激物后, 镜下观察细胞形态无明显变化。
2.2　TF活性的确认
2.2.1　DEGR-Ⅶa对兔脑凝血活酶和AS冻融液促凝作用的影响　　从表1可见, 加入DEGR-Ⅶa (终浓度为46μg/ml)阻断TF的作用后, 各种稀释度的兔脑凝血活酶与AS冻融液的促凝活性均完全丧失, 与盐水血浆凝固时间相对照无差异(P>0.5)。 由此可见, AS冻融液与兔脑凝血活酶一样, 它们的促凝活性都来自TF。

表 1　DEGR-Ⅶa对兔脑凝血活酶和星形胶质细胞冻融液促凝活性的影响
Table 1　Effect of DEGR-Ⅶa on the procoagulant activity of rabbit thromboplastin and astrocyte lysate (clotting time, s)

	Pooled human plasma	Dilution
		1∶1	1∶2	1∶4	1∶8	1∶16	Saline
Rabbit thromboplastin	Without DEGR-Ⅶa	49	55	64	77	105	232
	With DEGR-Ⅶa	231	227.5	230	232.5	233	233
Astrocyte lysate	Without DEGR-Ⅶa	58.7	69.5	88.5	107	123	232
	With DEGR-Ⅶa	229	228.5	231.5	228	231	233

2.2.2　抗TF单抗对兔脑凝血活酶和AS冻融液生物活性的影响　　加入兔脑凝血活酶或鼠AS冻融液的血浆, 凝固时间在加入抗TF单抗(终浓度0.25μg/ml)后均明显延长, 并且随促凝物稀释度加大, 凝固时间延长, 两者间存在明显的相关性(r=0.989, P<0.05, 见表2)。 从表3可见, 将两个促凝物的稀释度固定在1∶16, 随着加入抗TF 单抗的量增大, 凝固时间延长越加显著, 乃至完全中止, 但加入非特异性IgG, 则对促凝活性并无影响, 从而表明AS冻融液中促凝活性与兔脑凝血活酶一样, 均来自TF。

表 2　抗TF单抗对兔脑凝血活酶和星形胶质细胞冻融液促凝活性的影响
Table 2　Effect of TF monoclonal antibody on the procoagulant activity of the rabbit thromboplastin and astrocytes lysate (clotting time, s)

	Pooled human plasma	Dilution
		1∶1	1∶2	1∶4	1∶8	1∶16	Saline
Rabbit thromboplastin	Without TF McAb	49	55	64	77	105	232
	With TF McAb	58.3	76	87	112	142	230
Astrocyte lysate	Without TF McAb	58.7	69.5	88.5	107	123	232
	With TF McAb	82.5	94.6	120.5	154.5	181.5	230

表 3　不同浓度抗TF单抗对兔脑凝血活酶和星形胶质细胞冻融液促凝活性的影响
Table 3　Effect of different concentrate TF monoclonal antibody on the procoagulant activity of rabbit thromboplastin and astrocytes lysate (clotting time, s)

	TF McAb concentration /μg^.ml^－1
	0	0.25	0.50	1.0	2.0
Rabbit thromboplastin	105	142	175	235	232
Astrocytes lysate	123	181.5	231.5	232	232.5

2.3　信号传递途径工具药对星形胶质细胞表达组织因子活性的影响
2.3.1　A₂₃₁₈₇和TFP对星形胶质细胞表达TF的影响　　实验中加入A₂₃₁₈₇终浓度为10μmol/L, TFP为50nmol/L, 加入刺激物后培养时间为6h。 从图1可见, 与对照组比较［(7.0±1.2)mU×10²/ml, n=6］, A₂₃₁₈₇组AS表达TF活性明显增高［(11.1±1.6）mU×10²/ml, P<0.05］, TFP组AS表达TF活性明显下降［(4.0±1.3）mU×10²/ml, P<0.05］。 A₂₃₁₈₇+TFP组AS表达TF与对照组差异无统计学意义［(7.6±1.2)mU×10²/ml, P>0.05)］。 与A₂₃₁₈₇组比较, A₂₃₁₈₇＋TFP组明显下降(P<0.05)。 说明TFP对AS在基础条件下与A₂₃₁₈₇刺激下的TF活性都有明显抑制作用(P<0.05)。
2.3.2　PMA和H₇对星形胶质细胞表达TF的影响　　实验中加入PMA终浓度为1μmol/L, H₇为200 μmol/L, 加入刺激后培养时间为6h。 从图2可见, 与对照组比较［(6.8±1.3)mU×10²/ml, n=6］, PMA组AS表达TF活性明显增加［(10.2±1.8)mU×10²/ml, P<0.05］, H₇组AS表达TF活性明显下降［(3.8±1.0)mU×10²/ml, P<0.05］, PMA+H₇组与对照组差异无统计学意义［(4.7±1.6)　mU×10²/ml, P>0.05］。与PMA组比较, PMA与H₇组明显下降(P<0.05)。 说明H₇能明显阻断在基础条件下以及在PMA作用下AS的TF活性表达。

图　1　　A₂₃₁₈₇和TFP对AS表达TF的影响
Fig.1　Effect of A₂₃₁₈₇ and TFP on TF expression of astrocytes
^*P<0.05, compared with the control; ^#P<0.05, copmpared with the A₂₃₁₈₇ group.

图　2　　PMA和H₇对AS表达TF的影响
Fig.2　Effect of PMA and H₇ on the TF expression of astrocytes
^*P<0.05, compared with the control; ^#P<0.05, compared with the PMA group.

2.4　凝血酶对AS表达TF活性的影响
　　实验中凝血酶终浓度为10IU/ml, TFP为50nml/L, H₇为200μmol/L。 加入刺激物后培养时间为6h。 从表4可见, 与对照组比较, 凝血酶组AS表达TF明显升高(P<0.01); 加入H₇或TFP后与凝血酶组相比, AS表达TF活性均明显降低(P<0.01)。

表 4　凝血酶对AS表达TF的影响
Table 4　Effect of thrombin on the TF expression of astrocytes (n=6, ±s)

Group	TF /mU×10^2.ml^－1
Control	7.0±1.2
Thrombin	19.7±1.9^*
Thrombin+H7	10.7±2.0^#
Thrombin+TFP	8.8±0.9^#

^*P<0.01, compared with the control; ^#P<0.01, compared with the thrombin group.

3　讨论

　　神经胶质细胞在脑内发挥支持、 营养、 屏障、 修复、 吞噬、 缓冲、 参与信息传递等多种功能。 晚近发现, 神经胶质细胞特别是星形胶质细胞具有调控止血功能^［4］。 尽管已有人报道体外培养星形胶质细胞在无任何刺激下能够表达TF的mRNA和功能性TF蛋白^［4］, 但对脑组织中星形胶质细胞表达TF的影响因素及其机制尚不明确。 本实验结果表明: 星形胶质细胞在体外培养基础条件下, 的确能够表达一定量的TF功能性蛋白, 这与Eddleston的报道相一致^［4］。
　　钙离子是一种重要的信号离子。 当细胞受到刺激时, 细胞内钙离子浓度很快升高, 升高的细胞内钙可引起细胞一系列的功能变化。 A₂₃₁₈₇是一种钙离子载体, 它能升高细胞内钙。 本实验表明, 在体外培养基础条件下, A₂₃₁₈₇引起星形胶质细胞TF活性表达明显增加, 而钙调素阻断剂TFP可以明显抑制AS 细胞在基础条件下与A₂₃₁₈₇刺激情况下TF活性表达。 故本实验结果提示: 星形胶质细胞表达TF活性受细胞内钙/钙调素途径的调控。
　　二脂酰甘油(DG)在多种受体介导的细胞信息传递的过程中起第二信使作用。 DG可直接激活蛋白激酶C (PKC), PKC引起蛋白磷酸化而产生生物学效应。 众所公认PMA是PKC的激动剂, H₇是PKC的阻断剂。 本实验结果表明, PMA能明显增强星形胶质细胞表达TF活性; H₇则明显抑制星形胶质细胞表达TF活性。 因此可以认为, PKC途径在星形胶质细胞表达TF活性中也起着重要的作用。
　　在病理情况下, 由于血脑屏障的改变或血管壁完整性受损, 血液中的凝血因子可进入脑组织, 进而凝血酶原被激活成为凝血酶。 新近研究表明, 神经元和胶质细胞也有凝血酶原的mRNA^［8］, 它们可能是脑内凝血酶的来源之一。 凝血酶刺激血管内皮细胞表达TF活性, 这已得到公认^［1］。 本研究室以前的研究表明脑出血病人TF和FⅦa均明显增高^{［9, 10］}, 本实验也观察到凝血酶能刺激AS的TF活性表达。 这一发现对于理解脑出血的发病学具有一定的参考意义。 因为脑血管壁破损, 血液接触AS的TF, 便可通过组织因子途径启动凝血过程。 微量的凝血酶可正反馈性刺激AS表达TF活性增多, 无疑有利于加快局部的止血。 但是过量凝血酶的形成也有不利的方面。 因为局部形成的高浓度凝血酶不仅使神经轴突回缩, 突触传递障碍^［11,12］; 而且使AS变形, 神经营养与屏障功能受损。 某些脑出血患者预后不良可能与此有关。 本实验发现凝血酶对AS组织因子活性表达的刺激作用也受PKC和Ca²⁺/CaM信号传递途径的调控, 因此本实验结果对脑出血的治疗也许能提供一些新的思路与方法。

^*国家自然科学基金资助项目　(No.39770710)
^**现在地址: 浙江省血液中心, 杭州 310020
^*Supported by National Natural Science Foundation of China (No.39770710)
^**Present address: Blood Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310020

作者单位：湖南医科大学生理教研室, 长沙 410078

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1998-05-22收稿　　1998-08-07修回