单羧酸类Cl^－通道阻断剂对心室肌CFTR Cl^－通道的影响^*

周士胜　臧益民

摘　要　　本文采用全细胞膜片箝与细胞内灌注技术, 观察了单羧酸类 Cl^－通道阻断剂对豚鼠心室肌囊性纤维变性膜透性调节蛋白(CFTR) Cl^－电流的影响, 细胞外9-AC以可逆方式增强异丙肾上腺素(ISO)激发的CFTR Cl^－的外向电流成分, 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate (NPPB)和二苯胺羧酸(DPC)对ISO发的CFTR Cl^－电流的作用呈现先增强后抑制的双相效应。细胞内NPPB表现为增强ISO激发作用。 结果表明, 单羧酸类Cl^－通道阻断剂在细胞上有不同的作用位点, 该类药物作用效果的差异可能与此有关。
关键词: 异丙肾上腺素; Cl^－通道阻断剂; 心室肌; 豚鼠
学科分类号: Q445

EFFECTS OF MONOCARBOXYLIC ACID
DERIVATIVES ON CARDIAC VENTRICULAR CFTR
Cl^－　CHANNELS IN GUINEA PIG

ZHOU　SHI-SHENG，　ZANG　YI-MIN
(Department of Physiology, Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

ABSTRACT　　Using the whole-cell recording technique, the effects of monocarboxylic acid derivatives on cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) Cl^－-channel were examined in guinea pig ventricular myocytes. Anthracene-9-carboxylic acid (9-AC)added to the bath solution further enhanced the outward component of isoproterenol-induced currents in a　reversible manner, whereas 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) or diphenylamine-2-carboxylic acid (DPC) induced a biphasic effect on the currents. Either NPPB or DPC first produced a transient increase in the outward component of current before ensuing inhibition. Intracellular NPPB was found to potentiate isoproterenol-activated currents. It is concluded that these monocarboxylic acid derivatives have different binding sites in cardiac ventricular myocytes, which might partially account for the varied effects in blocking anion channels.
Key words: isoproterenol; chloride channel blocker; ventricular myocyte; guinea pig

　　囊性纤维变性膜透性调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)Cl^－通道是一类分布广泛、 具有重要生理功能的阴离子通道, 其激活经由cAMP蛋白激酶(CPKA)-磷酸化途径。 在研究不同组织细胞CFTR Cl^－通道时, 常借助于Cl^－通道阻断剂。 目前所用的Cl^－通道阻断剂主要有单羧酸类和磺酸芪类两大类, 关于它们的作用, 历来争议很大^［1］, 主要是效果不肯定和特异性差, 有些对Na⁺、 Ca²⁺电流也有抑制作用^［2］。 在研究心室肌CFTR Cl^－通道时, 亦经常使用这些药物。 有文献报道, 某些Cl^－通道阻断剂对心室肌CFTR Cl^－电流亦具有抑制作用, 如二磺酸芪的衍生物4,4′-dinitrostilbene-2,2′-disulfonic acid(DNDS)、 4-acetamido-4′-isothiocyanostilbene-2,2′-disulfonic acid (SITS) 和4,4′-diisothio-cyanostilbene-2,2′-disulfonic acid (DIDS)^［3］; 单羧酸类的9-羧酸蒽(9-AC)^［4～6］、 二苯胺羧酸(DPC)和5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate (NPPB)等^［3］。 然而, 有些报道却截然不同, Harvey发现SITS和DIDS与异丙肾上腺素(ISO)产生协同作用, 而不是抑制作用^［7］。 Hwang等未发现DPC对CFTR Cl^－电流有明显影响^［8］。 Vandenberg等报道, CFTR Cl^－通道对9-AC并不敏感^［9］。 目前的研究未能阐明产生争议的原因。
　　最近, 我们在研究豚鼠心室肌CFTR Cl^－通道的调控时, 发现9-AC在细胞上有不同作用位点, 9-AC通过细胞内位点抑制心室肌CFTR Cl^－通道的脱磷酸化过程, 因而具有增强ISO激发CFTR Cl^－电流的作用^［10］。 为此, 本文以豚鼠心室肌CFTR Cl^－通道为研究对象, 进一步比较了常用单羧酸类Cl^－通道阻断剂对心室肌CFTR Cl^－通道作用, 以探讨它们的作用机制。

1　材料和方法

1.1　分离单个心室肌细胞　　分离所用方法及液体同文献报道^［10］。 用雌性豚鼠 (200～250 g), 苯巴比妥钠 (35mg/kg) 腹腔麻醉。 人工呼吸状态下开胸行原位主动脉插管, 摘出心脏后, 依次用下列液体进行逆行心脏灌流: 台氏液(3min)、 无钙台氏液(3min)、 含0.1mg/ml胶原酶(yakult)和0.7mg/ml BSA 无钙台氏液(6min)、 室温KB液(5min)之后, 在KB液中将心室剪成碎块并过滤, 含有心室肌细胞的KB液保存在室温下备用。
1.2　液体　　记录心室肌CFTR Cl^－电流的液体成分为(mmol/L): (1) 灌流液 NaCl 150, MgCl₂ 0.5, CdCl₂ 1, glucose 5.5, HEPES-NaOH 5(pH 7.4)。 (2) 电极内液aspartic acid 85, EGTA 10, TEA-Cl 20, MgCl₂ 0.5, Na₂-creatinephosphate 5,　MgATP 10, NaGTP 0.2, glucose 5.5, HEPES-CsOH 10 (pH 7.35)。 实验中, 为了在等氯梯度(细胞内、 外的Cl^－均为106 mmol/L)状态下记录CFTR Cl^－电流, 灌流液中部分NaCl (47mmol/L)由甘露醇代替, 电极液中的天冬氨酸被等摩尔的CsCl代替。
1.3　药品　　ISO、 9-AC、 DPC和NPPB均为Sigma公司产品。
1.4　电生理实验　　全细胞记录实验同文献报道^［10］。 实验选直径1.5mm硅硼玻璃电极毛坯, 经拉制后, 使充灌电极液后的电极尖端阻值为1.5～2.5MΩ。 在有些实验中, 充灌后的电极连于特制的电极固定装置, 以便进行细胞内灌流^［10］。 膜电流经膜片箝放大器(Axopatch 200A)放大, 一路通过Bessel 型滤波器滤波(2kHz)后, 用TA240型热敏记录仪(Gould Instrument Systems Inc.)实时记录, 并同时记录在录像带上, 供以后回放用。 另一路经过A/D转换器(PCM 50lES, Sony), 由计算机(PC8901 DX, NEC)采样、 分析及处理。 斜波(ramp pulse)由1915型信号发生器(NF Electronic Instruments)产生。 记录CFTR Cl^－的保持电位为0mV, 斜波波宽5s, 波幅为0～±100mV, 频率为7.5Hz。
1.5　统计学处理　　数据以均数±标准差()表示, 实验结果的统计学处理以配对t检验作显著性分析。

2　结果

2.1　9-AC、 NPPB和DPC对心室肌CFTR Cl^－电流的影响
　　心室肌CFTR Cl^－通道被β肾上腺素能受体激活, 其通道电流在生理Cl^－浓度梯度下呈外向整流性质, 而在等Cl^－浓度梯度下呈近乎线性I-V关系^［3］。 由图1A可见, 当CFTR Cl^－电流被ISO激发出来后, 在灌流液中加入NPPB　(50μmol/L）, 开始先产生一个外向电流明显增强作用(第一时相), 当膜电位为＋100mV时, NPPB的最大效应可使ISO激发的CFTR Cl^－电流增加(29.78±15.23)％ (n＝8, P<0.05), 而后出现抑制效应(第二时相)。与NPPB相似, DPC　(100μmol/L）的作用亦呈双向性(图1B), 第二时相在用药2min后才表现出来。 然而, 9-AC对外向电流的作用则表现为单一的增加效应, 9-AC　(500μmol/L)使ISO激发的CFTR Cl^ˉ电流由对照的8.19±3.25nA/nF增加到10.50±4.99 nA/nF (n=9,P<0.01)。 NPPB和DPC对CFTR Cl^ˉ电流影响的实验结果总结见表1。

图　1　NPPB DPC和9-AC 对ISO 激发的CFTR Cl^ˉ电流的影响

Fig.1　Effects of extracellular application of 9-AC, NPPB and DPC on ISO-activaed CFTR Cl^--currents
The Cl^－current was activated by ISO in guinea pig ventricular Myocytes and recorded at asymmetrical (153 mmol^.L^－1 ［Cl^－］_O /21 mmol^.L^－1 ［ Cl^－］_i)chloride concentrations during repetitive application of ramp pulses from 0 to ±100mV. A and C,　representative chart records of whole-cell currents before and after exposure to ISO, NPPB (A),　DPC (C) and 9-AC. B and D,　I-V curves from the data in panel A and C　(b through f)　respectively after subtraction of the basal current　(a).

2.2　细胞内NPPB对CFTR Cl^ˉ电流的影响
　　NPPB， DPC和9-AC同属于单羧酸类化合物, 实验发现, 9-AC在细胞上通过细胞内位点增强CFTR Cl^－电流^［10］。 为了探讨单羧酸类中其它药物的作用机制是否也存在类似现象, 本实验观察了细胞内NPPB的作用。 结果发现, 用含NPPB(50μmol/L)的电极液更换对照电极液后, ISO激发的CFTR Cl^-电流幅度逐渐增加, 10min后CFTR Cl^-电流幅度从对照的(3.57±2.03)nA/nF增加到(5.54±2.03)nA/nF　(膜电位为+100mV, n=5, P<0.05), 此时, 在细胞外液中加入相同剂量的NPPB, 则使CFTR Cl^-电流完全抑制。 图2为原始记录结果之一。

表 1　细胞外NPPB和DPC对CFTR Cl^ˉ电流的影响
Table 1　Effects of extracellular NPPB and DPC on CFTR Cl^－ currents (at+100mV)

		n	CFTR Cl^--current density (nA/nF)
Control (1 μmol/L ISO)		8	7.73±3.38
+NPPB (50 μmol/L)	First phase	8	9.85±4.09^*
	Second phase	8	2.05±1.6^**
Control (1 μmol/L ISO)		7	6.98±2.22
+DPC (100 μmol/L)	First phase	7	7.85±2.12^#
	Second phase	7	0.88±0.84^##

^*P<0.05 vs control, ^**P<0.01 vs control; ^#P<0.05 vs control, ^##P<0.01 vs control．

图　2　细胞内NPPB对心室CFTR Cl^－电流的影响
Fig.2　Effects of intracellular application of NPPB on ISO-activated CFTR Cl^- currents
ISO-activated Cl^- currents of ventricular myocytes in guinea pig was recorded at symmetrical (106 mmol^.L^－1 ［Cl^-］_O /106 mmol^.L^－1 ［Cl^-］_i) chloride concentrations during repetitive application of ramp pulses (0～±100mV). A. The whole-cell currents were observed before and after intracellular perfusion with NPPB and bath application of ISO and NPPB (indicated by horizontal bars). B. I-V curves from the data in panel A　(b through d)after subtraction of the basal current (a).

3　讨论

　　自从1989年在哺乳动物心室肌上发现CFTR Cl^－通道以来^［4，12］, 曾有人使用Cl^－通道阻断剂研究该通道的性质, 不同实验室的结果差异很大(见引言), 而导致这种差异的原因一直未搞清楚。
　　本研究发现, 单羧酸类Cl^－通道阻断剂NPPB和DPC对ISO激发的CFTR Cl^－电流的作用呈先增强后抑制的双相效应。 研究进一步发现, 细胞内NPPB具有增强ISO的作用, NPPB的抑制效应只在细胞外用药时出现。 NPPB的这一作用与9-AC的作用^［10］十分相似, 提示这些单羧酸类药物在细胞上有不同的作用位点, 有的在细胞膜上, 有的则位于细胞内。 因此, 在这些Cl^－通道阻断剂使用中, 不同实验室的结果差异以及由此产生的争议可能与此有关。
　　用药时间的长短可能是导致争议的另一方面。 由于NPPB和DPC 产生双相效应, 因此, 用药后, 观察时间长短对实验结果乃至结论将产生重要影响。 例如Hwang等报道, 用药2min 内, 未发现DPC对腺苷酸环化酶激动剂Forskolin 激发的Cl^－电流有明显影响^［8］, 而本文持续记录结果显示, 在细胞外灌流液中加入DPC, 2min后才逐渐表现出抑制效应。
　　另外, 心室肌CFTR Cl^－电流对细胞内的Mg²⁺很敏感, Mg²⁺具有抑制CFTR Cl^－电流的作用(结果将在另文发表), 实验条件中电极内液中游离Mg²⁺浓度的差异, 也可能是结果差异的另一因素。
　　我们以前的工作提示, 9-AC的细胞内作用可能与抑制蛋白磷酸酶而限制了CFTR Cl^－通道的脱磷酸化过程有关^［10］, NPPB和 DPC细胞内作用机制如何, 有待于进一步研究。
　　综上所述, 本文进一步证实了单羧酸类 Cl^－通道阻断剂在心室肌细胞上有不同作用位点, 这一发现有助于阐明这些药物的作用机理。

^*国家自然科学基金资助项目 (No.39770281)
^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39770281)

作者单位：第四军医大学生理学教研室, 西安　710032

参考文献

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1998-06-03收稿　　1998-08-07修回