乙醇对胃粘膜的损伤及牛磺酸的保护作用

谢勇　李小平　王崇文　黄德强　祝金泉　张昆和　陈江

摘　要　　为了探讨乙醇性胃粘膜损伤和牛磺酸对其保护作用的机制, 将40只SD大鼠分为对照组、 乙醇损伤组和牛磺酸保护组, 观察其胃粘膜中内皮素(ET)、 一氧化氮合成酶(NOS)、 生长抑素(SS)和血管活性肠肽(VIP)的变化。 结果如下: (1)随着乙醇作用时间延长、 粘膜的损伤加重, 胃粘膜内ET含量显著上升, 而NOS 、 SS和VIP含量显著下降; (2)牛磺酸可显著减轻乙醇性胃粘膜损伤, 抑制ET释放, 增加NOS活性和SS、 VIP的含量。 上述结果表示, ET、 NOS、 SS和VIP的变化参与了乙醇性胃粘膜损伤的病理生理过程; 牛磺酸对乙醇性胃粘膜损伤具有保护作用, 可能与其调节胃粘膜内ET、 NOS、 SS和VIP的释放与活性有关。
关键词: 乙醇; 胃粘膜损伤; 牛磺酸; 内皮素; 一氧化氮合成酶
学科分类号: R363

ETHANOL-INDUCED GASTRIC MUCOSAL INJURY AND
THE PROTECTION OF TAURINE AGAINST
THE INJURY IN RATS

XIE　YONG，　LI　XIAO-PING，　WANG　CHONG-WEN，
HUANG　DE-QIANG，　ZHU　JIN-QUAN, 　ZHANG　KUN-HE，　CHEN　JIANG
(The First Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College, Nanchang 330006)

ABSTRACT　　40 SD rats were randomly divided into control group, ethanol-induced injury group and taurine protective group for the measurement of the contents of endothelin (ET), nitric oxide synthetase (NOS), somatostatin (SS) and vasoactive intestinal peptide (VIP). The results are as follows. The gastric mucosa was damaged by 75% ethanol, being aggravated with prolonged application time, as shown by a significant increase of the ET content and decreases of the contents of NOS, VIP and SS in the gastric mucosa. In the taurine group, decrease of ET content and increase of the contents of NOS, SS and VIP in the gastric mucosa were observed. Apparently, the changes in ET, NOS, SS and VIP contents of gastric mucosa serve as reliable indices in the pathogenesis by ethanol and protective effect by taurine.
Key words: ethanol; gastric mucosal injury; taurine; endothelin; nitric oxide synthetase

　　内皮素(ET)和一氧化氮(NO)是最近几年才发现的重要的器官局部血管调节因子。 近年来, 它们对胃粘膜的保护作用及在胃粘膜损伤中的致病作用倍受国内外学者的关注^［1,2］。 生长抑素(SS)存在于胃粘膜的D细胞中, 目前已知它可以减轻动物实验性胃粘膜损伤, 被看作胃粘膜局部的防御因子^［3］。 血管活性肠肽(VIP)也是广泛存在于胃粘膜内的一种胃肠激素, 它除了具有扩血管作用外, 还具有调节NO和ET分泌的作用^［4］。 因此, 我们观察了一氧化氮合成酶(NOS)、 ET、 SS和VIP含量在实验性乙醇胃粘膜损伤中的变化及牛磺酸对它们的影响, 以探讨乙醇性胃粘膜损伤和牛磺酸对其保护作用的机制。

1　材料和方法

1.1　实验动物　　健康雄性SD大鼠40只(200±15g)。 按统计学随机数字表将大鼠分为: 对照组、 牛磺酸保护组和乙醇损伤后5、 15、 30min组, 每组8只。
1.2　胃粘膜损伤模型的制备　　所有大鼠先适应性饲养1周, 实验前禁食24h, 自由饮水, 实验前4 h禁水, 损伤组鼻饲75%乙醇10ml/kg bw, 分别于5、 15和30min后用10%戊巴比妥钠35mg/kg腹腔麻醉, 剖腹取胃。 保护组以80mmol/L牛磺酸(化学名为2-氨基乙磺酸, 结构式为H₂N-CH₂-CH₂-SO₂H, 分析纯, 上海生物化学研究所产品)溶液10ml/kg bw灌胃, 早晚各1次, 连续2 d, 末次灌胃1h后处理同乙醇损伤后30min组, 对照组给予等量蒸馏水。
1.3　胃粘膜损伤指数测定及病理损伤积分　　胃取出后沿大弯侧剪开, 冲洗, 展平, 置光学显微镜下用微尺测量损伤情况。 损伤指数的计分参考 Guth 等^［5］ 标准, 以局限于胃上皮的点状糜烂、 溃疡、 出血灶的长度累积计分: 正常为0分, 损伤≤1mm为1 分, ＞1mm和≤2mm为2分, 依此类推, 损伤宽度＞2mm者, 指数加倍。 病理损伤及积分: 胃粘膜常规石蜡包埋切片, HE染色, 以Mascuda 等^［6］ 标准进行损伤程度累积计分: 正常为0分, 表层上皮损伤为1分, 上层粘膜充血水肿为2分, 中/下层粘膜充血、 出血和水肿为3分, 粘膜上层腺体结构紊乱或坏死为4分, 有深层的坏死或溃疡为5分。 每张切片的损伤累积计分, 最大不超过15分。
1.4　胃粘膜ET、 SS、 及VIP测定　　大鼠胃体和窦部粘膜(重约200mg)取出后立即置于冰上, 称重, 沸水浴中煮10min后匀浆, 以1mol/L冰醋酸提取(4℃ 3000r／min离心30min, 共2次, 合并上清液), －80℃贮存待测。 生长抑素、 血管活性肠肽放免试剂为北京海科锐生物技术中心产品, 北京协和医院胃肠组监制。 ET放免试剂为解放军总医院东亚免疫技术研究所产品。 采用竞争性放射免疫分析法进行测定, 用西安产PJ-2003/50P型全自动γ-免疫计数器计数。
1.5　胃粘膜NOS测定　　大鼠胃粘膜取出后立即置于冰上, 称重, 用40mmol/L、 pH 7.2磷酸钾缓冲10%～20% (W/V)匀浆, 4℃ 10000r／min离心20min, 取上清, －80℃贮存待测。 NOS 试剂购自军事医学科学院放射医学研究所, 并按其说明书操作。 将组织提取液0.6ml、 磷酸缓冲液和NADPH溶液各0.8ml混合, 振荡, 加入精氨酸溶液0.8ml立即计时, 用双波长分光光度计选择401 nm和421nm, 每隔30s记录吸光值, 记录3min。 NOS活性单位为nmol/(min^.g), 计算公式为: NOS活性=［(30s时401nm处吸光值－30s时421nm处吸光值)－(90s时401nm处吸光值－90s时421nm处吸光值)］×94.3。
1.6　统计学处理　　所有数据均为±s,两组间比较用t检验,多组间比较用F-q检验。

2　结果

2.1　乙醇对胃粘膜的损伤及牛磺酸的保护效应
　　随乙醇作用时间延长, 粘膜的损伤加重, 而牛磺酸可明显降低胃粘膜损伤程度(表1)。

表 1　乙醇对胃粘膜的损伤及牛磺酸的保护效应
Table 1　Gastric mucosal lesion index and pathologic lesion scores in ethanol injury groups and taurine protective group

Groups	Time of ethanol action /min	Lesion index	Pathologic lesion scores
Control group	0	0	0
Injury group 1	5	13.70±5.16	5.12±3.24
Injury group 2	15	18.98±3.25^*	8.15±1.25^*
Injury group 3	30	39.27±8.97^**	12.36±5.27^**
Protective group	30	23.91±5.46^***	6.14±3.65^***

n=8. ^*P<0.05 vs injury group 1,^**P<0.01 vs injury group 1, and　^***P<0.01 vs injury group 3.

2.2　乙醇损伤胃粘膜内NOS和ET的变化及牛磺酸对其的影响
　　　　随着乙醇作用时间的延长胃粘膜内ET含量上升, NOS的含量显著下降。 而牛磺酸保护组胃粘膜内ET含量显著低于损伤组3, NOS活性显著高于损伤组3（见表2）。

表 2　乙醇损伤胃粘膜内NOS和ET的变化及牛磺酸对其的影响
Table 2　Changes in ET and NOS of injury ethanol groups and taurine protective group

Groups	Time of ethanol action /min	ET /pg^.mg^－1	NOS /nmol^.(min^.g)^－1
Control group	0	50.35±16.39	34.81±6.28
Injury group 1	5	72.43±22.46^*	25.04±3.93^**
Injury group 2	15	99.87±39.88^**	10.38±2.80^**
Injury group 3	30	181.36±25.16^**	7.36±2.08^**
Protective group	30	106.41±31.24^***	21.64±4.06^***

n=8. ^*P<0.05 vs control group, ^**P<0.01 vs control group, and ^***P<0.01 vs injury group 3.

2.3　乙醇损伤胃粘膜内SS和VIP的变化及牛磺酸对其的影响
　　随着乙醇作用时间的延长, 胃粘膜内SS和VIP含量显著下降, 而牛磺酸保护组胃粘膜内SS和VIP含量显著高于损伤组(表3)。

表 3　牛磺酸保护与未保护组胃粘膜内SS和VIP含量比较
Table 3　Changes in SS and VIP of ethanol injury groups and taurine protective group

Groups	Time of ethanol action /min	SS /pg^.mg^－1	VIP /pg^.mg^－1
Control group	0	215.5±33.9	32.0±5.9
Injury group 1	5	160.4±28.7^*	24.8±3.9^*
Injury group 2	15	106.3±21.5^*	14.6±3.0^*
Injury group 3	30	71.3±11.2^*	10.7±2.7^*
Protective group	30	158.3±12.31^**	20.0±2.1^**

n=8. ^*P<0.01 vs control group, ^**P<0.01 vs injury group 3.

3　讨论

3.1　乙醇损伤胃粘膜的可能机制　　本研究发现随着乙醇作用时间延长, 粘膜损伤程度加重, 胃粘膜内的NOS、 SS和VIP的含量显著下降, ET含量显著升高, 并且牛磺酸保护组胃粘膜损伤减轻, NOS、 ET、 SS和VIP的变化也显著降低, 说明这4种物质的变化参与了乙醇性胃粘膜损伤过程。
　　NOS是NO生物合成的关键因素, NO是新近发现的重要细胞信息分子, 它通过增加胃粘膜血流量、 减轻炎症反应等机制, 在胃粘膜保护中起着重要作用^［1］。 ET是迄今所知最强烈而持久的缩血管因子, 参与许多疾病的病理生理过程。 有报道认为^［2］, 在胃粘膜下层注入不同浓度ET能导致胃粘膜下微血管长时间收缩, 同时伴有胃粘膜损伤, 且损伤程度与ET剂量呈依赖性, 因此人们认为ET能导致胃粘膜损害, 是一种强有力的致溃疡因子; 而乙醇可能通过降低胃粘膜NOS活性和增加ET含量加剧胃粘膜损伤。
　　在乙醇性胃粘膜损伤中, SS和VIP含量显著下降, 说明乙醇可破坏D细胞或抑制SS和VIP的分泌。 SS在胃粘膜损伤中的变化未见报道, 但有研究证实它对胃粘膜具有保护作用, 可抑制胃酸、 胃蛋白酶和胃泌素分泌, 促进胃粘液生成, 促进胃局部血液循环, 提高胃粘膜对氧自由基的清除能力, 预防细胞膜的脂质过氧化损伤^［3］。 VIP 可扩张血管, 抑制平滑肌收缩, 它在胃粘膜损伤中的变化及作用未见报道。 有研究^［4］显示, VIP能抑制内皮素-1(ET-1)的释放, ET-1是实验性乙醇损伤胃粘膜的重要损伤因子; 此外, VIP还可促进NO释放, 在乙醇所致的胃粘膜损伤中, VIP的减少可能通过减少NO释放和增加ET-1生成而参与胃粘膜的损伤过程。
　　本研究表明, NOS、 ET、 SS和VIP的变化共同参与了乙醇性胃粘膜损伤过程, 但它们的相互关系如何目前尚不清楚。 我们发现, 在胃粘膜损伤过程中NOS和ET含量呈负相关。 有研究证实, NO可拮抗ET的作用, 并抑制ET的释放。 Kohan^［7］等发现, NOS 激动剂可降低ET-1含量和ET-1 mRNA的表达, 而NOS 抑制剂L-NMMA能抑制这一效应。 在乙醇损伤胃粘膜过程中, NO减少失去对ET的抑制作用, 使ET显著增加, 两者共同作用加剧胃粘膜损伤。 反过来, ET却可以促进NO的释放, 国内外研究^［7］已证实, ET可通过ET受体而增加NOS 活性。 据报道, 在心、 脑缺血损伤早期, ET增加、 NO减少, 而中晚期两者均显著增加, 并且此时NO不起保护作用, 而发挥其细胞毒性作用, 因此加剧组织损伤。 这在胃粘膜损伤过程中是否也同样如此, 有待进一步研究。 此外, VIP的减少, 也可能导致NO的减少和ET含量的增加。 因此, 在乙醇损伤胃粘膜过程中, 以上4种物质可能互为因果, 共同作用, 从而加剧胃粘膜损伤。
3.2　牛磺酸抗乙醇性胃粘膜损伤的可能机制　　本研究发现, 牛磺酸预处理可明显减轻乙醇性大鼠胃粘膜损伤, 然而牛磺酸对胃粘膜保护的确切机制目前尚不明了。 有报道, 牛磺酸可能有维持渗透压平衡、 直接稳定细胞膜、 抗脂质过氧化损伤和Ca²⁺的调节作用^［8］。 我们发现, 牛磺酸可显著抑制乙醇损伤胃粘膜内ET的释放和NOS活性的下降, 并抑制乙醇损伤胃粘膜内SS和VIP含量的下降, 这可能是其抗乙醇性胃粘膜损伤的机制之一。
　　牛磺酸抑制乙醇损伤胃粘膜中ET的释放和NOS 、 SS、 VIP 含量下降的机制尚不清楚, 缺血、 缺氧、 凝血酶、 Ca²⁺载体等都能刺激ET的释放, ET的释放可能与内皮细胞内Ca²⁺增加有关^［9］。 NOS作用分Ca²⁺依赖性和非依赖性两类, Ca²⁺依赖性NOS于细胞内Ca²⁺浓度增加时被激活。 牛磺酸对细胞内Ca²⁺具有双向调节作用, 维持细胞内Ca²⁺稳态, 然而这与其抑制损伤胃粘膜内ET释放、 增加NOS活性之间的关系尚不清楚, 值得进一步探讨。 此外, 牛磺酸抑制损伤胃粘膜内SS和VIP含量下降的机制也尚不明了。 有报道, 牛磺酸可调节某些激素如生长激素等的分泌, 并抑制缺氧等所致组织与血浆中血管紧张素Ⅱ释放, 降低血栓素β／6-酮前列腺素Fα的比值, 抑制高血压动物血浆降钙素基因相关肽的下降^［8］。 因此, 牛磺酸是否是通过调节神经体液紊乱来平衡某些血管活性物质及胃肠激素合成释放的紊乱状态, 从而维持细胞稳态, 改变疾病的病理过程, 还有待于进一步研究。 总之, 本研究证实，　牛磺酸对乙醇性胃粘膜损伤具有明显保护作用, 且其抑制ET释放、 提高NOS活性和SS、 VIP含量的效应在其抗损伤机制中起重要作用。

作者单位：江西医学院第一附属医院消化研究所, 南昌 330006

参考文献

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1998-02-09收稿　　1998-06-26修回