内源性CO对内皮素促大鼠主动脉
平滑肌细胞增殖及MAPK活性的影响*

欧和生　严丽梅**　符民桂　王晓红　庞永政　苏静怡　唐朝枢

摘　要　　血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素分解代谢过程中的限速酶, 它能使细胞内的血红素降解成胆绿素和一氧化碳(carbon monoxide, CO)。 近来资料表明内源性一氧化碳对生理和病理状态下的血管张力有重要的调节作用。 目前尚不清楚内源性HO/CO系统是否参与平滑肌细胞增殖过程的调节。 本实验在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞模型上, 用血色素加氧酶抑制剂卟啉锌-9(zinc protoporphyrin IX, ZnPP-9)及酶底物血色素-左旋-赖氨酸盐(heme-L-lysinate, HLL)作用于内皮素处理的平滑肌细胞, 同时观察细胞HO活性、 CO产生和释放以及丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性的变化, 以探讨细胞内源性HO/CO系统对细胞增殖的调节作用。 结果发现: 内皮素明显刺激细胞的 3H-TdR参入, 其MAPK活性亦明显增加, 同时伴有HO活性上调和CO产生释放增加; 同时给予ET-1和ZnPP-9时, HO活性和CO的生成释放明显减少, 此时 3H-TdR参入和MAPK活性比单独ET-1组分别增加31.8% (P<0.01)和34.6% (P<0.01); 而同时加入ET-1和HLL时, HO活性和CO生成释放明显增加, 3H-TdR参入和MAPK活性比单独ET-1组分别减少28.5% (P<0.01)和23.4% (P<0.01)。 结果表明, ET-1刺激VSMC增殖伴有HO/CO的上调; 抑制HO活性或阻断CO的产生将促进细胞的增殖反应, 而HO活性的诱导或CO产生增加能有效抑制细胞的增殖反应; 这些效应可能由MAPK信号途径所介导。
关键词: 血色素加氧酶; 一氧化碳; 血管平滑肌细胞; 丝裂素活化蛋白激酶
学科分类号: R543； R544

THE ROLE OF ENDOGENOUS CO IN THE
REGULATION OF ENDOTHELIN-INDUCED VSMC
PROLIFERATION AND MAPK ACTIVITY

OU　HE-SHENG，　YAN　LI-MEI，　FU　MIN-GUI，　WANG　XIAO-HONG，
PANG　YONG-ZHENG,　SU　JING-YI,　TANG　CHAO-SHU
(Institute of Vascular Research, the First Clinical Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)

ABSTRACT　　Heme oxygenase (HO) is a rate-limiting enzyme of heme degradation, which converts the cellular heme to bilirubin and carbon monoxide (CO). Recently it is suggested that endogenous CO plays an important role in regulating vascular tone under both physiological and pathological conditions, but it is not clear whether endogenous HO/CO system regulates vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. In the present study, VMSC 3H-TdR incorporation, mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity, HO activity and CO release were determined to study the role of endogenous HO/CO system in regulating the VSMC proliferation induced by endothelin-1 (ET-1) in a cultured system. The results showed that ET-1 increased VSMC 3H-TdR incorporation, MAPK activity, HO activity, and CO release were up-regulated. Pretreatment of HO inhibitor, zinc protoporphyrin-9 (ZnPP-9), increased the ET-1-induced VSMC 3H-TdR incorporation and MAPK activity by 31.8% and 36.6% (P<0.01, respectively), whereas pretreatment of heme-L-lysinate (HLL), a HO substrate, inhibited these activities. This study demonstrated that up-regulation of VSMC endogenous HO represents a cellular protective response to stress or injury. Inhibition of HO may enhance VSMC proliferation induced by ET-1 in vitro, suggesting that endogenous HO/CO system may be directly involved in the regulation of VSMC proliferation through MAPK signaling pathway.
Key words: heme oxygenase; carbon monoxide; mitogen-activated protein kinase; vascular smooth muscle cell proliferation

　　在许多血管增殖性疾病(如高血压、血管成形术后再狭窄和动脉粥样硬化等)中, 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的大量增殖是其主要的病理改变［1］, 其增殖机制目前尚未阐明。 内源性一氧化碳 (carbon monoxide, CO) 是血色素在血色素加氧酶 (heme oxygenase, HO) 作用下降解产生的小分子气体, 近来发现其在心血管系统具有十分重要的生物学调节功能［2］。 我们以前的工作发现, HO底物血色素-左旋-赖氨酸盐(heme-L-lysinate, HLL)可急性降低自发性高血压大鼠的血压, 而HO活性抑制物2,4-二甘油-次卟啉锌(zinc deuteroporphyrin 2,4-bisglycol, ZnDPBG)则明显诱导大鼠发生高血压［3］, 也能有效地阻止大鼠败血症休克时低血压的发生［4］; HO/CO系统参与了大鼠主动脉内膜剥脱后的血管壁细胞增殖及其新内膜形成［5］。 然而HO/CO系统是否对培养的血管平滑肌细胞增殖及其信号传递产生影响, 目前尚未见报道。 内皮素具有强烈的促平滑肌细胞增殖的作用, 并与细胞增殖的胞内信息传递系统中丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的激活有关［6］。 本实验在内皮素促大鼠主动脉平滑肌细胞模型上, 观察了HO底物和HO活性抑制物对VSMC增殖及其MAPK活性的影响, 以探讨内源性HO/CO系统在平滑肌细胞增殖及其核信号转导中的可能作用。

1　材料与方法

1.1　大鼠主动脉平滑肌细胞培养及实验分组　　选250～300g Wistar大鼠, 取胸主动脉按Hirata等［7］方法分离和传代。 VSMC培养液为含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液, 第4代融合细胞用于本实验。 实验分为4组: (1) 对照组, 无特殊处理; (2)内皮素组, 培养液中加入内皮素-1 (ET-1, 10－8mol/L); (3) HO抑制组培养液中加入ET-1+ZnPP-9 (10μmol/L); (4) HO底物组培养液中加入ET-1+血红素-左旋-赖氨酸盐 (heme-L-lysinate, HLL, 10μmol/L), 置于CO2培养箱孵育24h。
1.2　3H-TdR掺入测定　　亚融合细胞换无血清RPMI 1640培养液, 于24孔板再孵育12h, 然后每孔按上述实验分组加入不同试剂, 16h后每孔加入1.85×104 Bq 3H-Thymidine (3H-TdR), 孵育6h后加入冷PBS终止反应。 在Millipore上经微孔滤膜收集细胞并用10%三氯醋酸处理, 滤膜烘干后置闪烁瓶中, 加入闪烁液(PPO/POPOP/二甲苯/无水乙醇)静置过夜, 在(闪烁仪(FJ2107)上测定 3H放射强度。
1.3　MAPK活性测定［8］　　将主动脉剪成碎块, 加入冷提取液后匀浆, 离心后取上清0.5ml与5μg特异性MAPK抗体于4℃共同孵育4h, 收集免疫复合物与预先吸附有抗鼠IgG的Agarose deads孵育30min, 沉淀下的蛋白再加入溶解液0.5ml混匀, 取其中150μl与20μl激酶缓冲液在25℃孵育25min, 取100μl点于P81 Phosphocellulose滤纸(Whatman)上, 在液闪仪上测定髓磷脂碱性蛋白(MBP)中 32P的掺入量, 结果以每分钟每毫克蛋白掺入 32P的pmol数表示。
1.4　主动脉平滑肌HO活性和CO释放量测定　　主动脉去掉内膜和外层组织, 平滑肌层用于以下HO活性和HbCO形成的测定。
　　HO活性测定采用Morita等［9］的方法稍加改良。 主要步骤有: 细胞用5体积冷Tris/HCl (pH 7.4)缓冲液离心两次(分别800g, 10min和13500g, 20min)以沉淀线粒体。 上清液再离心(105?000g, 90min) 分离微粒体。 用100mmol/L, pH 7.4的焦磷酸钠去除血红蛋白, 磷酸钾缓冲液制成微粒体悬浮液。 取1ml微粒体液加于0.5ml反应液中(含肝实质0.6mg, NADP 0.8mmol/L, 6-磷酸葡萄糖, 6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2U), 最后加入50μl 0.25mmol/L的血红素作底物。 混匀后置暗室37℃孵育10min, 用50μl 10% HgCl2终止反应。 在双波长分光光度仪上(OD 464～530nm)比色。 HO活性用胆红素形成速率［pmol/(mg.h)］来表示。 蛋白含量测定用考马斯亮蓝法。
　　平滑肌细胞培养液中, HbCO生成测定采用改良的Morita和Kourembanas方法［10］。 细胞在DMEM培养液中(加纯Hb, 1ml/15mg 组织)孵育1h (37℃, 95% O2-5% CO2)。 各样本HbCO生成量以占正常对照的百分比参数表示。
1.5　主要材料及试剂来源　　Wistar大鼠由北京医科大学动物中心提供, 人ET-1由Phoenix Pharmaceuticals, Inc (USA)惠赠, RPMI1640, PPO, POPOP, ZnPP-9, HLL, NADP, 血红素, 6-磷酸葡萄糖, 6-磷酸葡萄糖脱氢酶, 胆红素等购自Sigma公司; γ-32P-ATP来自Amersh公司; MAPK抗体为Zymed Lab.公司产品。
1.6　统计学处理　　结果用xx-11.gif (95 bytes)±s表示, 组间差异用方差分析q检验, P<0.05为差异有显著性。

2　结果

2.1　ZnPP-9和HLL对内皮素处理的平滑肌细胞增殖和MAPK活性的影响
　　与对照组比较, 无论是否加入ZnPP-9或HLL, ET-1均明显增加SMC的3H-TdR的掺入和MAPK的活性(P值均小于0.01); 同时给予ET-1和HO活性抑制剂ZnPP-9时, 3H-TdR的掺入和MAPK的活性比单独ET-1组分别增加31.8%(P<0.01)和34.6%(P<0.01); 而同时加入ET-1和HO底物HLL时,3H-TdR的掺入和MAPK的活性比单独ET-1组分别减少28.5%(P<0.01)和23.4%(P<0.01) (见表1)。

表　1　Znpp-9和HLL对内皮素处理的平滑肌细胞3H-TdR掺入和MAPK活性的影响
Table 1　Effects of ZNPP-9 and HLL on the ET-1-induced changes of VSMC 3H-TdR incorporation and MAPK activity

 

Group

3H-TdR inco.(cpm/well)

MAPK activity/cpm.(min.mg)－1 pro

Control

1565.24±351.23

2467.67±487.65

ET-1 alone

2847.92±113.94**

3875.54±356.42**

ET-1+ZnPP-9

3754.63±463.28**##

5216.70±275.34**##

ET-1+HLL

2034.80±430.78**##

2967.12±460.63**##

 


n=8. xx-12.gif (95 bytes)±s. **P<0.01, compared with control; ##P<0.01, compared with ET-1 alone group.

2.2　ZnPP-9和HLL对内皮素处理的平滑肌细胞HO活性和HbCO生成的影响
　　无论是否加入ZnPP-9和HLL, 加入内皮素后VSMC微粒体中HO活性和细胞培养液中的HbCO生成均比对照组明显增加; 令人感兴趣的是, 同时加入ET-1和HO活性抑制剂ZnPP-9时, HO活性和HbCO形成比单独ET-1组分别减少58.4% (P<0.01)和36.5% (P<0.01); 而同时加入ET-1和HO底物HLL时, HO活性和HbCO形成比单独ET-1组分别增加29.4%(P<0.01)和33.0%(P<0.01)(见表2)。

表　2　Znpp-9和HLL对内皮素处理的平滑肌细胞HO活性和培养液中HbCO生成的影响
Table 2　Effects of ZNPP-9 and HLL on the ET-1-induced changes of HO activity within VSMC and HbCO formation in media

 

Group

HO activity /pmol.(mg.h)－1

HbCO formation /μmol.L－1

Control

　48.6±2.4

1.43±0.24

ET-1 alone

687.4±50.9**

6.69±0.36**

ET-1+ZnPP-9

285.7±46.3**##

4.25±0.45**##

ET-1+HLL

889.5±79.6**##

8.91±64.0**##

 


n=8. xx-13.gif (95 bytes)±s. **P<0.01, compared with control; ##P<0.01, compared with ET-1 alone group.

3　讨论

　　细胞外一些刺激因子如细胞因子IL-1, 肽类内皮素-1等通过各种途径刺激细胞增殖和分化, 在细胞外刺激信号的核转位过程中, 丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是信号传递的共同通路。 本实验在大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养的模型上, 用内皮素处理后观察到VSMC增殖明显增加, 同时伴随有MAPK活性的明显上调, 提示MAPK介导了内皮素刺激的平滑肌细胞增殖过程; 更有意义的发现是, 在加入内皮素的同时, 给予HO活性抑制剂ZnPP-9能明显地加重细胞的增殖, 此时细胞产生和释放的CO明显减少; 相反, 同时加入内皮素和HO底物HLL能明显地抑制细胞的增殖, 此时细胞产生和释放CO是明显增加的, 提示细胞内源性CO的产生直接参与细胞的增殖调节。
　　HO是哺乳动物组织细胞微粒体中的一种蛋白酶, 它能将细胞浆中的血色素降解, 产生胆绿素, 自由离子和CO［11］。 近来研究发现, 细胞内源性CO在血管生物学功能调节中起着很重要的作用［12］。 CO与一氧化氮(NO)有许多相似的功能, 如两者都是小分子气体, 都可由血管壁细胞浆中的相应底物在酶的作用下产生和释放, 都能在胞浆中与可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase, sGC)结合并使之激活, 继而使细胞浆cGMP水平上升［13］。 HO几乎存在于体内所有的组织细胞中, 目前已确定具有两种形式: HO-1(诱导型)和HO-2(固有型)［14］, HO-1主要分布于脾、 肝、 网状内皮系统和血管壁细胞中, 许多刺激因素均可使细胞内HO-1的活性上调。 这些诱导剂包括细菌内毒素、 炎性细胞因子(IL-1和TNF-α)、 金属离子(锌、　锡、　钴、 钙和铝等)、 生物激素(肾上腺素、　去甲肾上腺素、 胰岛素和胰高血糖素等)、 血红素及其衍生物, 以及饥饿、 发热和机械性损伤等应激状态。 有资料证实，　热休克蛋白HSP70和应激蛋白P32都类似于HO-1［15,16］, 因此HO-1也被称为应激蛋白或热休克蛋白。 ZnPP-9和ZnDPBG等重金属卟啉类化合物是HO的强抑制剂, 这些抑制剂已被证实对HO-1和HO-2均有效, 近来已被用于内源性CO在体内的各种生物学功能研究［17,18］。 在我们以前的工作中发现, 应用ZnDPBG能成功地诱导大鼠高血压［3］, 而且对大鼠败血症性休克时低血压的发生也具有预防作用［4］; 更令人感兴趣的是, ZnDPBG的处理还能加重大鼠主动脉球囊剥脱术后血管新生内膜增厚的程度, 这一效应与HO活性的抑制和CO的生成减少密切相关, 推测内源性CO可能直接参与血管壁细胞的增殖调节。
　　本实验发现, HO活性抑制剂或HO底物对内皮素的促细胞增殖作用产生直接的影响, 证实了上述推测。 不仅如此, 实验还发现HO活性或CO产生的改变在影响细胞增殖的同时, 存在MAPK活性的变化, 而且与细胞的增殖程度相对应。 已有报道, 内皮素能使血管成形术后新生内膜的厚度增加［19］并通过MAPK介导而影响细胞的增殖［6］, 低密度脂蛋白或磷脂成分也促进MAPK活性的上调而刺激大鼠的血管平滑肌细胞增殖［20］。 此外, PKA信号途径也参与介导HO-1的基因转录水平调控［21］。 MAPK途径受多种因素的调节, 其上游存在多种成分(如MAP2K, MAP3K, PKC, PKA等), 对有关平滑肌细胞增殖的内源性HO/CO系统影响MAPK途径的主要环节, 我们正在进一步研究之中。

*国家自然科学基金资助 (No.39730220)
**衡阳医学院内基诊断学教研室, 湖南衡阳市 421001
*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39730220)

作者单位：北京医科大学第一临床医院心血管研究所, 北京 100034

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1998-07-27收稿　　1998-09-28修回