脑啡肽增强胶质细胞的神经营养作用与NO生成减少有关^*

魏光伟　杜莅娜　朱粹青　唐崇仁　曹小定　吴根诚^**

摘　要　　本文在SD大鼠大脑皮层胶质细胞-神经元共培养模式上, 以神经元存活、 突起生长、 生长相关蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43)mRNA的表达为指标, 观察了脑啡肽对胶质细胞神经营养作用的影响, 并对其机理作了初步探讨。 结果表明, 经脑啡肽处理的胶质细胞能使神经元的存活计数增加28%(P<0.05), 单个神经元突起总长度增加11%(P<0.05), 最长突起长度增加16%(P<0.05), GAP-43 mRNA的表达增加26%(P<0.05)。 然后又观察了脑啡肽(10^－6～10^－12mol/L)对培养胶质细胞生成一氧化氮(NO)的影响。 结果表明, 浓度为10^－8, 10^－10mol/L的脑啡肽能明显抑制其生成(P<0.05)。 结果提示, 脑啡肽可能增强胶质细胞的神经营养作用, 其机制之一可能是通过抑制胶质细胞NO的生成。
关键词: 脑啡肽; 胶质细胞-神经元共培养; GAP-43; NO
学科分类号: Q426

EFFECT OF ENKEPHALIN ON GLIAL NEUROTROPHIC
FUNCTION RELATED TO THE REDUCTION OF
NITRIC OXIDE PRODUCTION^*

WEI　GUANG-WEI，　DU　LI-NA，　ZHU　CUI-QING，
TANG　CHONG-REN，　CAO　XIAO-DING,　WU　GEN-CHENG^**
(State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Department of Neurobiology,
Shanghai Medical University, Shanghai 200032)

ABSTRACT　　The effect of methionine-enkephalin (ME) on glial neurotrophic function was studied in rat cortical glial-neuronal coculture. The results showed that ME-treated glia enhanced neuronal survival by 28% (P<0.05), and increased total neurite length per neuron by 11% (P<0.05), while the expression of GAP-43 mRNA by 26% (P<0.05). The effect of ME on NO production of glia was also studied in rat cortical glial culture. The result showed that different concentrations of ME (10^－12, 10^－10, 10^－8, 10^－6mol/L) inhibited glial NO production. All the above show that the increase of glial neurotrophic ability by ME may be due to the inhibition of glial NO production.
Key words: methionine-enkephalin; glial-neuronal coculture; GAP-43; NO

　　胶质细胞是中枢神经系统的主要细胞成分之一, 参与构成中枢神经元生存的微环境, 对神经元的发育、 生长及损伤后再生发挥着重要作用^［1～3］。 脑啡肽包括甲啡肽(methionine-enkephalin, ME)是中枢神经系统中广泛存在的一类内阿片肽, 对中枢胶质细胞的激活、 增殖、 分泌等均有影响^［4～6］。 McMillian综合有关文献报道, 认为脑啡肽对胶质细胞的作用可能影响到胶质细胞的神经营养作用, 从而影响神经元的生长发育与损伤再生^［6］。 因此, 我们拟在中枢胶质细胞-神经元共培养基础上, 以神经元存活、 突起生长、 GAP-43mRNA的表达为指标, 研究胶质细胞对神经元的营养作用及ME对胶质细胞神经营养作用的影响,
　　已有报道, 胶质细胞是中枢神经系统中一氧化氮(NO)的主要来源之一^［7］, NO依其来源、 生成量及氧化还原状态的不同而具有神经保护或神经毒作用; 亦有报道, 体外培养胶质细胞生成的NO可引起神经元的死亡^［8］, 并且ME可抑制NO的跨膜释放^［9］。 为此, 本实验进一步观察了胶质源性NO对神经元存活、 突起生长的影响及ME对胶质细胞生成NO的影响, 以期探讨ME影响胶质细胞神经营养作用的机理。

1　材料和方法

1.1　细胞培养　　大鼠大脑皮层胶质细胞培养: 按Conn^［10］方法行皮层胶质细胞培养。 简述如下: 取出生后2d内SD大鼠大脑皮层, 用0.25%胰蛋白酶制备细胞悬液, 以2×10⁵细胞/cm²的密度接种于12孔培养板, 置于37℃、 含5% CO₂的培养箱内孵育, 每3天更换一次培养液, 培养液为含5%胎牛血清、 10%小牛血清的DMEM。
　　大鼠大脑皮层神经元培养: 参照Conn^［10］及Bank^［11］方法, 取胚胎16d SD大鼠大脑皮层, 用0.25%胰蛋白酶制备细胞悬液, 以2×10⁴细胞/cm²的密度接种于经PLL处理的12孔培养板, 置于37℃、 含5% CO₂的培养箱内孵育, 1d后更换1/2培养液, 以后每3天更换一次培养液, 培养液为含10%胎牛血清、 10%小牛血清的DMEM。
　　大鼠大脑皮层胶质细胞-神经元共培养: 按前述方法培养新生大鼠大脑皮层胶质细胞, 7d后加入取自胚胎16 d大鼠大脑皮层细胞悬液(密度同上), 置于37℃、 含5% CO₂的培养箱内孵育, 1 d后更换1/2培养液, 以后每3天更换一次培养液, 培养液为含10%胎牛血清、 10%小牛血清的DMEM。
　　免疫组织化学染色: 用ABC法。 简述如下: 用0.01mol/L PBS冲洗培养细胞, 依次加入正常血清(1∶200), 37℃孵育1h; 神经元特异性烯醇化酶(neuron specific elonase, NSE) 单克隆抗体(1∶200, DAKO, USA)、 胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)单克隆抗体(1∶200, Boehringer Mannheim, Germany), 37℃孵育2h, 4℃孵育过夜; DAB显色。 用PBS取代单克隆抗体行同步实验作为对照。 免疫组化染色证实取材于出生2 d内SD大鼠的大脑皮层细胞培养, 经2次更换培养液后神经元(NSE阳性)已不能生存, 星形胶质细胞约占90%, 与文献报道一致^［10］; 胚胎16d大鼠的大脑皮层细胞培养4d内神经元的纯度在90%以上, 与文献报道一致^［11］。
1.2　神经元存活及突起生长的检测　　新生大鼠大脑皮层胶质细胞培养5d后, 分别加入ME(终浓度10^－10mol/L, Peninsula, USA)、 一氧化氮合酶抑制剂NAME (N-nitro-L-arginine methyl ester, 硝基精氨酸甲酯, 终浓度1mmol/L, Sigma, USA)及等体积的生理盐水, 继续培养2 d后用新鲜培养液清洗细胞, 加入取自胚胎16d大鼠的大脑皮层神经细胞行胶质细胞-神经元共培养, 细胞密度同方法1.1。 另在PLL处理的盖玻片上以相同密度作单纯神经元培养, 3d后取培养片做NSE免疫组化染色(ABC法), 常规封片。 用显微镜载物台上的标尺固定选取每张片子的上、 下、 左、 右、 中五个视野, 于镜下计数每个视野内NSE阳性细胞数。 存活神经元标准: 细胞轮廓清晰, 至少有一支突起, 且长度超过胞体直径的NSE阳性细胞。 并于每视野选取突起生长最好的2个神经元, 用Q570图像处理系统(Leica, Germany)测量单个神经元突起总长度及其最长一支突起的长度(包括分支)。
1.3　ME处理的胶质细胞影响神经元GAP-43基因表达的检测　　新生大鼠大脑皮层胶质细胞培养5 d后, 分别加入ME (终浓度10^－10mol/L)、 ME抗体(1∶5000, 美国NIH Dr.Hong J-S赠送)和ME(终浓度10^－10mol/L)及等体积的生理盐水。 培养2d后用新鲜培养液清洗细胞, 加入取自胚胎16d大鼠的大脑皮层神经细胞进行胶质细胞-神经元共培养, 细胞密度同上。 2d后取培养片用Dig标记RNA探针(第三军医大学组胚教研室合成)做GAP-43mRNA原位杂交。 方法简述如下: 4%多聚甲醛固定5min, 蛋白酶K (2μg/ml)37℃消化2min, 滴加含GAP-43 mRNA探针(10μg/μl)的杂交液, 37℃杂交2h, DIG免疫组化, NBT、 BCIP显色。 替代对照: 用不含探针的杂交液行同步杂交。 阳性对照: 用本实验室已确认阳性的损伤脊髓标本行同步杂交。 同方法1.2选取视野, 用Q570图像处理系统测量单个阳性细胞的积分光密度(IOD)。
1.4　不同浓度ME处理的胶质细胞培养上清中NO测定(亚硝酸盐重氮化反应法)　　新生大鼠大脑皮层胶质细胞培养7d后分别加入终浓度为10^－12, 10^－10, 10^－8, 10^－6mol/L的ME, 终浓度分别为10^－10, 10^－8mol/L的ME和Nal (naloxone, 纳洛酮, Sigma, USA), 18 h后取培养上清液, 测定其中NO^-₂含量, 间接反映胶质细胞NO的生成量, 同时计数每组培养中细胞的数目。 NO^-₂的测量: 96孔酶标板中每孔加0.15ml培养上清液后分别加入等体积的Griess液(5%磺胺溶于5%磷酸, 0.1% N-1奈乙二氨, 临用前1∶1混匀), 548μm波长下在酶标仪(Biorad, USA)上读取吸光度。 同时用不同浓度NaNO₂制作标准曲线, 将样品的吸光度转换成NO^-₂的浓度, 样品NO^-₂的含量用nmol/10⁶细胞表示。

2　结果

2.1　胶质细胞对神经生长的作用及脑啡肽对胶质细胞促神经生长作用的影响
　　NSE免疫组化结果表明, 生长在胶质细胞上的神经元与单纯培养神经元相比, 神经元存活数目增加57％, 突起生长旺盛, 单个神经元平均突起总长度增加30％, 最长突起长度增加32％, 差别均有极显著的统计学意义(P<0.01)。 而且单纯培养的神经元突起不大清晰, 有延伸受阻现象(图1A和B, 见图版Ⅳ; 表1)。 结果说明胶质细胞是神经元存活、 突起生长的有效支持物, 具有较强的促神经元生长、 存活作用。
　　预先经ME处理和未处理(生理盐水对照)的胶质细胞和神经元共培养组相比, 前者神经元存活数目增加28％, 单个神经元平均突起总长度增加11％, 最长突起长度增加16％(图1B和C, 见图版Ⅳ; 表1), 差别有显著性(P<0.05)。 以上结果说明, ME处理的胶质细胞能增加神经元的存活、 生长, 提示ME可能增强胶质细胞的促神经元存活、 生长作用。

表 1　胶质细胞及ME、 NAME处理的胶质细胞对神经元存活、 突起生长的影响
Table 1　Survival and neurite outgrowth of neurons growing on glia, ME-treated and NAME-treated glia

Neuron on	Number of viable neurons	Neurite outgrowth /μm
		Total	Longest
	25.25±7.15 (n=20)	43.82±20.46 (n=42)	28.71±8.68 (n=42)
glia	59.75±26.46^* (n=20)	62.98±18.89^* (n=46)	39.16±16.49^*(n=46)
ME-treated glia	80.01±13.21^+(n=20)	71.05±18.24^+(n=46)	46.75±15.79^+(n=46)
NAME-treated glia	125.25±13.75(n=20)	114.80±29.99(n=42)	83.92±36.72(n=42)

^*P<0.01 vs neuronal culture; ⁺P<0.05, P<0.01 vs glial-neuronal coculture.

2.2　脑啡肽处理的胶质细胞对神经元GAP-43 mRNA表达的影响
　　胶质细胞-神经元共培养GAP-43 mRNA原位杂交显示, GAP-43 mRNA主要分布于神经元胞体部分, 突起的近胞体端亦有少量的分布(图2, 见图版Ⅳ), 图像处理结果显示, 预先经ME处理的胶质细胞与神经元共培养组单个神经元平均IOD为48.79±5.89 (n=90), 比生理盐水对照组的38.63±6.88 (n=90)明显增加(P<0.05), 加ME抗体阻断ME作用后, 神经元GAP-43 mRNA表达(IOD为34.18±7.70, n=51)明显低于ME预处理组(P<0.05), 说明ME处理的胶质细胞可增加神经元GAP-43 mRNA的表达, ME的这种作用可被ME抗体所阻断。
2.3　NAME处理的胶质细胞对神经元生长的影响
　　培养的中枢胶质细胞能生成大量NO^［7］, 用NAME阻断NO合成后行胶质细胞-神经元共培养, 2d后NSE免疫组化显示神经元的存活、 突起的生长与生理盐水组相比较均成倍增加, 差别有极显著的统计意义(P<0.01), 而且突起更加粗大(图1B和D, 见图版Ⅳ。表1), 表明在该培养条件下, 大鼠大脑皮层胶质细胞生成的NO的综合作用表现为对神经元存活及生长的抑制。

2.4　脑啡肽对胶质细胞生成NO的影响
　　实验观察了不同浓度的ME对新生大鼠大脑皮层胶质细胞生成NO的影响。 结果显示, 在10^－12 mol/L这一较低浓度时, ME即能抑制胶质细胞NO的生成; 在10^－10, 10^－8mol/L, 作用比较明显, 阿片受体拮抗剂Nal能部分反转ME的作用(图3)。

图　3　　脑啡肽对培养胶质细胞生成NO的影响
Fig.3　Effect of ME on NO production of cultured glia
^*P<0.05 vs control．

3　讨论

　　实验中, 我们首先在大鼠大脑皮层胶质细胞-神经元共培养的基础上, 以神经元存活和突起生长为指标验证了培养早期胶质细胞的神经营养作用, 结果与文献报道相符^［3］, 培养早期的胶质细胞能明显促进神经元的存活及突起生长, 具有较强的神经营养作用。 在此基础上, 实验进一步观察了ME对胶质细胞神经营养作用的影响。 在胶质细胞培养中加入ME后行胶质细胞-神经元共培养, 观察神经元的生长情况。　结果显示, 在该培养条件下神经元的存活和突起生长与生理盐水组相比均有不同程度的增加。
　　由于在培养中加入神经元行胶质细胞-神经元共培养前已将加入的ME进行了清洗, 在本实验中能基本上排除ME对神经元的直接作用。 因此，　本实验提示ME可能是通过增强胶质细胞的神经营养作用而间接促进神经元的存活和生长。 胶质细胞对神经元生长、 存活的影响是其分泌、 表达的多种因子共同作用的结果, 因其分泌、 表达因子的种类及量的不同而具有神经营养或神经抑制作用^［2,3］, 而且ME作用极其广泛, 因此ME影响胶质细胞神经营养作用的机制可能相当复杂。
　　GAP-43是一种神经元特异性蛋白质, 它的表达不仅可以作为神经生长、 再生的指标, 还是一个影响神经元生长、 再生的神经元内在性因素^{［12，13］}。 基于以上观点, 我们用培养细胞原位杂交实验, 检测了预先经ME处理的胶质细胞对神经元GAP-43mRNA表达的影响。 实验中观察到, ME预处理组神经元GAP-43mRNA的表达明显高于生理盐水组, 用ME抗体阻断ME作用后GAP-43mRNA表达量明显下降, 进一步提示ME可能增强胶质细胞的促神经生长作用, 而且这种作用不是一般多肽及其降解产物的非特异性营养作用, 而是ME所特有的, 同时也提示经脑啡肽作用的胶质细胞能使影响神经再生的神经元内在性因素GAP-43表达增加, 有可能增加神经元对其生存微环境改变的敏感性。
　　培养中加入ME抗体阻断ME作用后, 神经元GAP-43mRNA的表达不仅低于ME预处理组, 而且低于生理盐水组(P<0.05)。由于培养的星形胶质细胞可分泌大量的ME^［6］, 因此可能的解释是, ME抗体不仅阻断了外源性ME的作用, 而且中和了胶质细胞内源性产生的ME, 因而阻断了其可能具有的通过自分泌、 旁分泌机制增强胶质细胞神经营养功能的作用^［6］。
　　培养的胶质细胞均可产生NO^［7］, NO是一种作用复杂的活跃分子, 一般认为它的过量表达能通过多种机制导致组织、 细胞的损伤, 亦有人认为NO依其氧化还原状态的不同而起神经营养或神经毒作用。 为此, 实验中首先观察了培养胶质细胞生成的NO对神经元作用的性质。 用非选择性NOS抑制剂NAME阻断胶质细胞NO生成后, 神经元存活和突起生长成倍增加, 表明在体外培养中, NO的综合作用是抑制神经元的存活和生长, 表现为神经毒作用, 结果与文献报道相符^［8］。 然后又观察了ME (10^－6～10^－12mol/L)对培养胶质细胞生成NO的影响, 结果表明浓度为10^－8, 10^－10mol/L的ME能明显抑制其产生, 提示ME增强胶质细胞促神经元生长、 存活作用可能与其抑制NO的生成有关。 实验观察到, ME浓度增高(10^－6mol/L)对胶质细胞生成NO的抑制作用反而减弱, 有人在ME促大鼠脾淋巴细胞增殖实验中也观察到类似现象^［14］, 但机理不明。
　　NO的生成涉及一氧化氮合酶的表达量及活性、 NO的释放、 合成原料精氨酸的供给等多个环节。 文献报道ME能抑制NO的跨膜释放, 10^－10mol/L的ME对NO释放的抑制效率达82%^［9］, ME对胶质细胞NO释放及生成中其他环节的影响有待进一步的实验研究。
　　综上所述, 实验提示脑啡肽能增强胶质细胞的神经营养作用, 其机制之一可能是通过抑制胶质细胞NO的生成。

^*国家教委博士点基金(No.9506197)、 国家自然科学基金重点项目(No.39730510)资助
^**联系作者
^*Supported by the Doctorial Foundation of National Education Committee of China (No.9506197) and the National Natural Science Foundation of China (No.39730510)
^**Corresponding author.

作者单位：上海医科大学神经生物学教研室, 医学神经生物学国家重点实验室， 上海 200032

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1998-07-04收稿　　1998-10-28修回