败血症大鼠心肌核被膜和肌浆网ryanodine受体的变化^*

王培勇　杨　军　董林旺　王晓红　唐朝枢　刘乃奎

摘　要　　为观察败血症时心肌肌浆网(SR)和核被膜(NE)的ryanodine受体的变化,采用结扎及穿刺盲肠(CLP)制作败血症动物模型,用密度梯度离心分离SR和NE,用放射配体结合法研究ryanodine受体的特征。结果表明,大鼠早期败血症(CLP后9h)时,SR的ryanodine受体的最大结合(B_max)增加23%, NE的ryanodine受体的B_max则增加1倍,二者比值降低39%(P<0.01); 在晚期败血症(CLP后18h)时, SR ryanodine受体的B_max降低了38%, NE的ryanodine受体的B_max增加1.6倍, 二者比值降低76%; SR和NE ryanodine受体的离解常数无显著改变。败血症时, SR ryanodine受体早期上调,晚期下调,而NE ryanodine受体均上调,这些变化可能与休克时相有关。
关键词: 败血症; 肌浆网; 核被膜; ryanodine受体
学科分类号: R515.3

ALTERATION OF RYANODINE RECEPTORS IN
CARDIAC SARCOPLASMIC RETICULUM AND
NUCLEAR ENVELOPE OF RATS DURING SEPSIS^*

WANG　PEI-YONG^**，　YANG　JUN，　DONG　LIN-WANG，
WANG　XIAO-HONG，　TANG　CHAO-SHU^#,　LIU　NAI-KUI
(Cardiovascular Basic Research Institute, Beijing Medical University, Beijing 100083；
^#Research Institute of Cardiovascular Disease, The First Clinical Medical College,
Beijing Medical University, Beijing 100034, China)

ABSTRACT　　To investigate changes of ryanodine receptors in the sarcoplasmic reticulum (SR) and the nuclear envelope (NE) of rat cardiac myocytes during sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), myocardial SR and NE were fractionated with density gradient centrifugation and the characteristic of ryanodine receptor was assayed with a method of radioreceptor binding assay. The result showed that B_max of ryanodine receptors in cardiac SR was increased by 23% during early sepsis (9h after CLP), but decreased by 38% during late sepsis (18 h after CLP). B_max of ryanodine receptors in cardiac NE, on the other hand, was increased by 100% and 160% during early and late sepsis respectively. Kd of ryanodine binding to SR and NE remained unchanged during sepsis. These results demonstrated up-regulation of ryanodine receptors in SR occurred during early sepsis and down-regulation of these receptors in SR occurred during late sepsis, while up-regulation of ryanodine receptors in NE occurred during both the early and the late sepsis.
Key words: sepsis; sarcoplasmic reticulum; nuclear envelope; ryanodine receptor

　　败血症及败血症休克大鼠血液动力学变化具有时相性, 即早期(early sepsis, ES)呈现高动力循环状态, 晚期(late sepsis, LS)呈现低动力状态。 败血症的时相变化发生的机理目前尚未完全阐明。 最近我们的研究已证实, 在心肌细胞核上也存在Ca²⁺调节系统^［1］, 但其生理意义尚不明确。 Ryanodine受体是心肌细胞内肌浆网Ca²⁺调控Ca²⁺ 释放通道, 在心肌纤维兴奋-收缩偶联中具有重要作用^［2］。 最近证实, 在心肌细胞核上也存在此种受体^［3］。 本研究在大鼠实验败血症模型上, 观察肌浆网和核被膜(nuclear envelope, NE) ryanodine受体的变化, 并探讨其与败血症时心功能变化的关系。
　　实验选用雄性Sprague-Dawley大鼠(体重270～320g, 禁食过夜, 自由饮水)。 分为三组: 对照组、 早期败血症组(ES)、 晚期败血症组(LS)。 败血症模型按Wichterman介绍的结扎盲肠和穿孔的方法^［4］(稍作改进), 氟烷麻醉下, 做剖腹术(切口2cm), 以3～0号丝线结扎盲肠并用18号针头穿刺2次, 将盲肠放回腹腔, 逐层关腹。 假手术对照组不做盲肠结扎和穿刺。 术后自由饮水, 禁食。 术后9h为ES组, 18h为LS组。大鼠死亡率为: 对照0(0/39), ES 11%(5/44), LS 20%(10/49)。 用多道生理记录仪通过股动脉和心室腔测定血流动力学参数。 取血样测定血浆葡萄糖和乳酸浓度。 然后, 取出心脏迅速置于冰冷的0.9% NaCl溶液中。 将心室肌匀浆并低速离心(3800g×20min), 沉淀用于制备核被膜(nuclear envelope, NE), 上清用于制备肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)。 NE按Guihard介绍的方法略作改进^［3］制备, 而SR按Kranias介绍的方法^［5］制备。 心肌匀浆、 SR和NE以Lowry法行蛋白定量。 测定下述标志酶以鉴定膜制备的纯度: Na⁺-K⁺-ATPase (质膜的标志)、 azide-sensitive ATPase (线粒体的标志)和葡萄糖-6-磷酸酶(作为SR的标志)。 所制备的NE和SR以液氮速冻后置于－80℃保存备用。
　　为测定［³H］-ryanodine结合^［3,5］, NE和SR在下述缓冲液中(30℃)孵育90min(mmol/L): imidazole 25 (pH 7.4), KCl 1.0, CaCl₂ 1.103, EGTA 0.95 (20μmol/L Free Ca²⁺)。 ［³H］-ryanodine的浓度范围为0.5～15nmol/L, 取适量(0.15ml)用无Ca²⁺冲洗液(mmol/L: KCl 166.6, imidazole 33.3, NaN₃ 16.7)稀释10 倍后, 用Millipore过滤(0.45μm), 以5 ml冰冷的缓冲液冲洗(mmol/L: imidazole 25, KCl 1000.0, CaCl₂ 1.103, EGTA 0.95, pH 7.2)。 滤膜干燥后加入闪烁液, 用液闪计数仪 (PACHARD, TRI-CARB 1600 TR) 测定放射强度。 在2μmol/L非标记ryanodine条件下测定非特异性结合, 为总结合的5%～10%。 实验所用的试剂除［³H］ryanodine (30.2 TBq/nmol)购于Dupont New England Nuclear公司外, 其它试剂均购自Sigma公司。

1.　大鼠败血症时血液动力学参数的变化

　　在ES, 血压和左室输张末压(LVEDP)无显著改变, 但心率(HR)、 心输出量(CO)、 左室发展压(±dp/dt_max)分别增加29%, 24%, 18%(与对照组相比, P<0.01), 血浆葡萄糖和乳酸浓度分别增加21%和4倍(P<0.01), 说明机体处于高动力状态。 LS时, 各血液动力学指标均显著降低, BP, HR, CO, +dp/dt_max, －dp/dt_max分别降低21%, 39%, 26%, 28%, 67％, 而LVEDP则增加3倍, 血浆中葡糖和乳酸浓度分别降低69%和增加6.6倍, (P均<0.01), 说明机体处于低动力循环状态, 循环趋向衰竭。 结果如下表1所示。

表 1　大鼠败血症时血流动力学参数的变化
Table 1　Changes in hemodynamic parameters of rats during sepsis

Group	Control	Early sepsis	Late sepsis
MABP (kPa)	15.96±1.46	16.09±1.73	12.64±2.13^**
HR (beats/min)	396±21	509±42^**	242±61^*
CO (ml/100　g^.min^－1)	40.3±3.2	50.1±4.0^**	29.7±2.4^**
+dP/dtmax (kPa/s)	687±39	809±45^**	49.2±65^**
-dP/dtmax (kPa/s)	645±49	622±38^**	215±46^**
LVEDP (kPa)	0.466±0.035	0.865±0.600	1.955±0.811^**
Plasma glucose (mmol/L)	7.0±0.26	8.5±0.5^**	2.2±0.5^**
Plasma lactate (mmol/L)	1.0±0.26	4.9±0.5^**	7.6±0.5^**

±s, n=7. MABP=mean arterial blood pressure; CO=cardiac output; LVEDP, left ventricular end-diastolic pressure; ^*P<0.05, ^**P<0.01 compared to the control.

2.　肌浆网和核被膜制备

　　对照、 ES和LS三组大鼠心肌SR制备中G-6-Pase活性较匀浆中该酶的活性分别高18, 20和17倍, 而Na⁺-K⁺-ATPase和Azide-ATPase活性则远低于心肌肌膜和线粒体中上述酶的活性。 三组大鼠心肌NE制备中的Na⁺-K⁺-ATPase, G-6-Pase和Azide-ATPase活性同样远低于肌质膜、 SR和线粒体中上述各酶的活性。 说明本研究分离的SR和NE纯度高。

3.　大鼠败血症时SR和NE的ryanodine受体结合特征的变化

　　将制备的心肌SR和NE与［³H］ryanodine (0.5～15nmol/L)共同孵育(30℃, 90min)进行配体受体结合饱和测定。 结果显示, ES时大鼠心肌每毫克蛋白SR的ryanodine受体的最大结合(B_max)较对照组大鼠增加23% (P<0.01), 而LS时B_max则降低了38% (P<0.01)。 在对照、 ES和LS三组, 受体与配体结合的离解常数(Kd)相近, 无显著性变化。
　　大鼠心肌NE的ryanodine受体配体结合实验结果显示, ES时B_max较对照组增加1倍(P<0.01); 而LS时B_max进一步增加, 较对照组高1.6倍(P<0.01)。 在对照、 ES和LS三组, Kd相近, 无显著性不同。 SR与NE的B_max比值于ES时较对照组降低39%(P<0.01), 至LS时进一步降低76% (P<0.01)。 如图1、表2所示。

图　1　［³H］ryanodine与肌浆网和核被膜结合的饱和曲线以及Scatchard plot作图
Fig.1　A saturation curve and Scatchard plot for ［³H］ryanodine binding to SR(A)and NE(B)
±s, n=8, each experiment used a mixture of 4 hearts.

表 2　［³H］ryanodine与肌浆网和核被膜结合的动力学参数
Table 2　［³H］-ryanodine binding to myocardial SR and NE during sepsis

	SR		NE		Bmax ratio of SR/NE
	Bmax/mol^.mg^－1	Kd /nmol^.mg^－1	Bmax /mol^.mg^－1	Kd /nmol^.mg^－1
Control	3.48±0.79	1.17±0.40	51.37±19.29	0.718±0.204	68.25±20.25
ES	4.29±1.16^**	1.13±0.40	102.54±28.96^**	0.704±0.286	41.84±11.82^**
LS	2.17±0.51^*	1.18±0.57	132.57±28.91^**#	0.691±0.277	16.37±6.25^**##

±s, n=8. P<0.01 compared with control. ^#P<0.05,^##P<0.01 compared with early sepsis.

　　SR ryanodine在心肌细胞兴奋-收缩偶联中起重要作用。 心肌兴奋时, 胞外Ca²⁺通过电压依赖通道内流, 激活SR ryanodine受体, 诱发SR内Ca²⁺大量释放入胞内^［7］。 有证据提示, ryanodine受体也调节核Ca²⁺释放^［8］。 已知 SR ryanodine 受体的变化参与许多病理生理过程, 如缺血损伤、缺血及再灌注时SR受体数目减少, 但亲和力不变, 心肌肥大及心力衰竭时, 受体数目减少, 亲和力下降^［9，10］。 有关ryanodine受体, 特别是心肌核上的ryanodine受体与败血症休克时心功能的关系尚未阐明。 本工作表明, 败血症早期(ES)动物出现高动力和高代谢状态, SR ryanodine B_max显著增加, 与心功能(心输出量及左室发展压)增加的幅度一致; 败血症晚期(LS)则出现相反变化,动物出现低动力循环和低代谢状态,SR ryanodine受体B_max降低; 但Kd值保持不变, 提示心肌SR受体数目发生改变, 但与配体亲和力无显著变化。 与以往发现败血症休克时肌膜电压依赖Ca²⁺通道的变化一致。 ryanodine受体的变化必然导致SR Ca²⁺释放功能的相应的改变。 因此, 本工作观察到的SR ryanodine受体ES时上调与LS时下调是败血症时从高动力循环状态到低动力循环状态改变的原因之一。
　　有意义的是,本实验还观察到随败血症时相的变化,ES时NE上的ryanodine受体B_max显著增加,且幅度较SR变化更显著;LS时当SR的ryanodine受体数目降低时,NE上的受体B_max处于更高水平, Kd值无论在ES还是LS时均未改变,表明受体特性未受影响。此结果表明,败血症时不但SR Ca²⁺调节失衡, 而且心肌核Ca²⁺稳态发生更显著的改变。由于败血症不仅引起全身各组织器官机能紊乱,还可导致细胞核反应异常, 如基因表达改变、细胞凋亡等^{［11，12］}。 因此,有理由推测, 败血症时心肌核Ca²⁺调节改变必然引起核反应的改变。

^*国家自然科学基金资助　(No.39570300和39870347)
^**通讯地址: 第三军医大学高原医学研究室， 病理生理教研室， 重庆　400038
^*Project supported by Natural Science Foundation of China (No.39570300 and 39870347)
^**Current address: Institute of High Altitude Medicine, Department of Pathophysiology, Third Military Medical College, Chongqing 430038, China

作者单位：王培勇　杨军　董林旺　王晓红　刘乃奎　北京医科大学心血管基础研究所, 北　　　　　　京 100083；
　　　　　唐朝枢　北京医科大学第一临床医学院心血管病研究所, 北京 100034

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1998-05-04收稿　　1998-08-03修回