重组人肝细胞生成素的生物学性能^*

张咏　杨哓明　王　阁^**　贺福初^***

摘　要　　利用MTS及³H-TdR掺入法, 首次观察了重组人肝细胞生成素(recombinant human hepatopoietin, rhHPO)在体外对原代培养大鼠肝细胞及肝癌细胞增殖的正向调控作用。 结果表明rhHPO是一种重要的肝细胞增殖刺激因子, 可望成为临床治疗肝病的新药物。 同时也观察到rhHPO可以在体外抑制肺癌细胞DNA的合成, 为探究其作用机理提供了有益的提示。
关键词: 人肝细胞生成素; 生物学性能
学科分类号: R363; Q28

BIOLOGICAL ACTIVITY OF RECOMBINANT
HUMAN HEPATOPOIETIN^*

ZHANG　YONG，　YANG　XIAO-MING，　WANG　GE，　HE　FU-CHU^**
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850)

ABSTRACT　　We examined the effects of rhHPO on the cell growth and DNA synthesis of both rat primarily cultured hepatocytes and hepatic carcinoma cell line in vitro by MTS and ³H-TdR in corporation methods. It was indicated that rhHPO is an important stimulating factor of regeneration, which may be developed as a potential drug for the treatment of severe hepatic diseases. We also found an inhibitory effect of rhHPO on the DNA synthesis of lung cancer cell lines GLC-82 in vitro, which might provide a valuable indicator for the study of its specificity and mechanisms.
Key words: recombinant human hepatopoietin (rhHPO); biological activity

　　我们在人胎肝cDNA文库中克隆到一种新型的肝细胞增殖刺激因子cDNA, 并完成了高效表达菌株的构建及系统制备工艺, 得到了高纯度的rhHPO^［1］。 本文首次利用基因工程产品rhHPO, 以多种细胞系为靶细胞, 对rhHPO的生物学活性进行了较全面的研究。
　　动物及药品　　雄性Wistar大鼠, 体重200±20g, 本院实验动物中心提供。 rhHPO的制备由自行构建的pBV-hALR表达株, 经实验室诱导表达、 纯化, 纯度大于95%, N-端氨基酸序列测定正确。 细胞株: HTC细胞, 大鼠肝癌细胞系, 美国UCSF细胞中心惠赠。 SMMC7721细胞, 人肝癌细胞系, 上海第二军医大学建株。 HepG2细胞, 人肝癌细胞系、 Hep2细胞, 人喉癌细胞系、 K562细胞, 人红白血病细胞系、 HL-60细胞, 人粒系白血病细胞系、 Dami细胞, 人巨核系白血病细胞系、 HEL细胞, 人红白血病细胞系, 本室保存。 GLC-82细胞, 昆明医学院第一附属医院所建肺腺癌细胞系^［2］。 ³H-TdR (3.7×10⁴kbq/ml) 购自中国原子能研究所。 MTS［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxypheryl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt］ 试剂盒, PROMEGA公司产品。 Ⅳ型胶原酶, SIGMA公司产品。 FCS, GIBCO/BRL Lot No.42N5442 (胎牛血清)。 DMEM GIBCO公司产品。 猪肝细胞生长因子 (PHGF), 广州空军总院提供。
　　肝细胞的分离和培养　　大鼠肝细胞分离方法采用原位二步灌注法^［3］。 取Wistar大鼠, 用0.5%戊巴比妥钠麻醉, 固定, 无菌处理后开腹。 门静脉插管。 灌注先经37℃水浴并通氧气的无Ca²⁺、 Mg²⁺离子的Hanks液, 以洗去肝中血液。 待肝颜色变白后, 换用经37℃水浴并通氧气的0.02%的Ⅳ型胶原酶继续灌注。 约10min 后取出肝脏, 绞碎过滤离心700rpm/min 3次。 将细胞悬浮于含10% FCS 10^－9mol/L胰岛素, 10^－9mol/L地塞米松及青、 链霉素的DMEM中。 计数后, 将细胞铺于96孔Costar培养板中(5×10³个细胞/孔), 于37℃含5% CO₂的孵箱中培养。
　　MTS测试方法　　将贴壁后的上述原代细胞上清吸弃, 加入含不同浓度的 rhHPO (0～20ng/ml)的DMEM 100μl/孔继续培养72h后, 每孔加入MTS 10μl, 3.5 h后在酶联仪上测其OD₄₉₂值。
　　各种癌细胞株培养　　将HTC、 SMMC7721、 HepG2、 Hep2、 GLC-82等细胞株用0.5%胰酶消化后, 离心去掉胰酶加入含10%　FCS的DMEM重新悬浮。 计数后, 铺于96孔Costar培养板(3×10³～5×10³个细胞/孔)中, 在37℃含5% CO₂条件下培养。
　　DNA合成检测　　将贴壁后的上述细胞上清吸弃, 加入不同浓度的rhHPO(0～32ng/ml)的DMEM 100μl/孔继续培养48h, 每孔加～³H-TdR 3.7 kBq 3h 后收集细胞于49号滤纸上。 晾干后, 加入闪烁瓶中以液闪仪计数CPM值。 结果如下:

1.　rhHPO促进肝细胞增殖作用

　　体外无血清原代肝细胞培养体系中, rhHPO可刺激肝原代细胞增殖。 rhHPO20ng/ml剂量组OD₄₉₂均值是对照组均值的1.67倍, 统计学上有显著差异(P<0.01, n=3)。 rhHPO浓度为0～10ng/ml时, 随着rhHPO剂量增大, 组中OD₄₉₂值均数也随之明显加大(图1)。

图　1　　rhHPO对原代肝细胞的刺激作用
Fig.1　Effect of rhHPO on the primary culture of adult rat hepatocytes

2.　rhHPO对肝癌细胞的刺激作用

　　由表1可以看出, rhHPO在体外剂量为20ng/ml时, 可使SMMC7721 DNA合成增加2.11倍, HepG2增加14.95倍, HTC增加4.66倍, 其中以对HepG2细胞的刺激效果最好。 rhHPO不同剂量组对HepG2细胞和HTC细胞作用结果不同, 随着剂量增加其刺激效果增强, 大约在 10ng/ml浓度时趋于饱和剂量(图2, 图3)。

图　2　　rhHPO对HTC细胞系细胞的刺激作用
Fig.2　Effect of rhHPO on HTC cell line

图　3　　rhHPO对HepG2细胞系细胞的刺激作用
Fig.3　Effect of rhHPO on HepG2 cell line

3.　rhHPO对GLC-82细胞的抑制作用

　　为了进一步探究肝脏以外的器官对rhHPO的反应性, 我们选取了一些造血细胞系、　喉癌细胞系及肺癌细胞系作了观察。 结果发现rhHPO对所选取的这些细胞中肝源性以外的大多数细胞系均无刺激作用, 但对GLC-82细胞则有较为明显的抑制作用(表1)。 进而对GLC-82作了剂量效应实验, 结果发现, 当rhHPO剂量为2、 4、 8、 16ng/ml时, 其DNA合成分别是不加rhHPO时DNA合成量的0.96、 0.69、 0.51和0.17倍, 具有非常明显的抑制活性(图4), 且呈量效负相关(y=－305.99x+5640.51, r=0.9811)。

图　4　　rhHPO对GLC-82细胞系细胞的刺激作用
Fig.4　Effect of rhHPO on ³H-TdR of GLC-82

表 1　rhHPO对不同细胞株细胞的作用
Table 1　Effect of rhHPO on the various cell line

Cell	CPM value of ^3H-TdR corporation (±s)
	Control	rhHPO (20ng/ml)
K562	18611.5±2130.7	21504.7±1221.7
HEL	7320.6±1083.7	7006.1±1056.3
HL-60	4857.9±288.0	5875.7±938.9
SMMC7721	3571.8±309.9	7537.9±838.5^**
HepG2	111.1±13.8	1659.0±138.0^**
Hep2	4839.4±1895.5	5910.5±533.3
Dami	1869.0±443.2	1774.5±213.7
GLC-82	20928.3±1421.5	13359.7±663.2^**
HTC	28550.4±3464.3	50242.7±4429.7^**

Data were based on the results of three experiments (three samples for each).^**P<0.01 compared with control.

　　目前认为, 真正支持肝再生的是一类来源于肝脏本身, 特异性刺激肝脏增殖的小分子物质。 1994年8月, Hagiya等首先从新生大鼠中分离和克隆出一种热稳定小分子的肝细胞增殖因子, 称为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)^［4］。 我们从人胎肝cDNA文库中克隆到的新型肝再生刺激因子cDNA其核苷酸序列测定与前者有86%的同源性, 因而提示HPO为ALR的人类同源性分子^［1,5,6］。 但经反复实验证实, HPO与国外大鼠ALR生物学活性研究结果不同, HPO不仅可促进原代大鼠肝细胞的增殖, 而且对肝源性肝癌细胞系有促DNA合成的作用(后者只观察到整体上的作用), 而HPO对绝大多数非肝源性细胞, 如HL-60, Hep-2, Dami等细胞无促DNA合成的作用, 无明显的剂量效应关系, 说明HPO生物学功能具有一定的组织细胞特异性。 另外还观察到HPO对肺癌细胞系GLC-82的DNA合成有抑制作用。 HPO特异性地显著刺激肝源性细胞DNA的合成, 说明HPO是一种重要的与肝再生相关的生长因子, 它的生物学功能的研究, 对于阐明肝再生分子生物学机理, 临床上寻找真正的特异性支持肝再生的药物都具有重大的意义。

^*国家863项目 (No.102-08-05-1)资助项目
^**第三军医大学大坪医院消化科 (400042)
^***联系人
^*The project was supported by High-Tech Program (No863-102-08-05-1).
^**Corresponding author

作者单位：北京放射医学研究所, 北京100850

参考文献

　［1］　Yang XM (杨晓明), Qiu ZH (邱兆华), Xie L (谢　玲), et al. Human augmenter of liver regeneration: molecular cloning bioloical activity and roles in liver regeneration. Sci Chin (Series C) (中国科学C辑) (英文), 1997, 40 (6): 642～647.
　［2］　Liang MD (梁明达), Jia W (贾 伟), Hu MY (胡美英) et al. Establishment of lung adenocarcinoma cell line in GEJIU (GLC-82) and study of its biologic properties. Chin J Oncol (中华肿瘤学杂志), 1985, 7 (2): 81～82 (in Chinese with English abstract).
　［3］　Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol， 1976, 13: 29～83.
　［4］　Hagiya M, Francavilla A, Polimeno L, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. PNAS， 1994, 91: 8142～8146.
　［5］　Yang XM (杨晓明), Xie L (谢　玲), Qiu ZH (邱兆华), et al. Human augmenter of liver regeneration: molecular cloning and bioloical activity. Acad Sci (Series C)(中国科学C辑), 1997, 27 (5): 463～468. (in Chinese).
　［6］　Yang XM (杨晓明), Xie L (谢　玲), He H (何　浩), et al. Expression and activity of recombinant human augmenter of liver regeneration. Acta Biochem Biophys Sino， 1997, 4: 421～425 (in Chinese).

1998-04-06收稿　　1998-07-20修回