血管活性肠肽对清醒大鼠催乳素分泌的影响*

朱宝长　韩菊花　Sara R. CHIOCCHIO**

摘　要　　在离体研究中发现, 血管活性肠肽(VIP)对催乳素分泌的促进作用因垂体所取自的动物模型的不同而异。 本实验则以不同生理状态的大鼠为动物模型, 于清醒自由活动状态下, 检验VIP的静脉注入对催乳素释放的影响。 结果表明, 在VIP注入后10min时, 其外周血液的浓度达到最高值(21.32±2.33)ng/ml, 并至少持续30min。 在本实验的所有动物模型中, VIP均诱导出了显著的催乳素分泌峰(P<0.05), 就其提高程度而言, 雄性鼠最高(158.04±37.06)ng/ml, 未经吸吮刺激的哺乳母鼠最低(31.05±4.42)ng/ml, 而经过吸吮刺激的哺乳母鼠则居于两者之间(90.10±36.00)ng/ml。 VIP在不同动物模型中所表现出的这些差异, 提示其作用方式和/或作用部位可能受到整个机体内分泌环境和神经刺激的整合。
关键词: 清醒大鼠; 血管活性肠肽; 催乳素; 动物模型
学科分类号: Q450

VASOACTIVE INTESTINAL POLYPEPTIDE INDUCED
PROLACTIN RELEASE IS MODEL DEPENDENT IN
FREE-MOVING RATS*

ZHU　BAO-CHANG，　HAN　JU-HUA，　SARA　R.CHIOCCHIO**
(Department of Biology, East China Normal University, Shanghai 200062;
**Instituto de Neurobiologia, Buenos Aires, Argentina)

ABSTRACT　　Our previous experiments in vitro showed that the stimulating effects of vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on pituitary (PRL) depended on the endocrinal status of the animals. The present investigation was to determine whether the effect of VIP varied in vivo with changes of different physiological conditions. For infusion of VIP (5μg/100g body weight) and collection of blood sample, all the animals were cannulated with silicon tube into jugular vein 2～3d before the experiments. The results showed that VIP concentration in blood was increased rapidly after the infusion (maximum: 21.32±2.33ng/ml at 10min and lasting more than 30min). The concentration of PRL in blood of all the animals tested was increased significantly (P<0.05) after VIP infusion. The increase rate of PRL induced by VIP was higher in male rats (158.04±37.06), but lower in the female (Diestrus: 50.42±16.44, Proestrus: 62.67±21.34) and in Suckling-depended lactating ones (Suckled 90.00±36.00vs. Separated 31.05±4.42). The above observations suggest that the VIP action in vivo depends on the endocrinal and/or neural status of the animals.
Key words: Free-moving rats, VIP, prolactin, animal models

　　在下丘脑业已发现有血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)的存在, 它在垂体门静脉的浓度也远高于外周血液, 而且在离体和活体条件下, 都能够刺激催乳素的释放, 是公认的催乳素释放激素之一。 后进一步证明, 静脉注入VIP抗血清分别能够推迟或阻止由吸吮和应激诱导的催乳素释放［1］, 说明VIP也参与了前述两过程中催乳素的释放。 此外, 它还能以旁分泌和自分泌因子的形式参与调节催乳素的分泌［2,3］。 我们过去的实验表明, 在离体培养中, 由VIP诱导的催乳素释放取决于取样前动物所处的内分泌状态, 即雄性、 发情前期、 发情间期及与幼子分离一定时间之后的哺乳和非哺乳母鼠［7］, 然而, 活体状态下是否仍然如此却不清楚, 尽管VIP在哺乳母鼠的作用偶有报道, 但是, 不同的麻醉方式和实验条件使得各实验结果难以比较。 因此, 本实验拟以清醒状态下可自由活动的大鼠为实验对象, 研究静脉内注入VIP在不同动物模型中对催乳素分泌的作用。
　　实验动物大鼠(Sprague-Dawley)饲养在温度(22℃)和光照(8∶00～21∶00h)控制环境下, 自由采食和饮水。 本实验选用体重在250～350g的成年大鼠为实验动物。 雌性动物的周期由每天的阴道抹片来确定, 哺乳鼠则选自产后8～12d具有8～10个幼仔的个体, 并单独笼养, 而雄性大鼠则均具有交配和产仔记录。 以上各组均随机分为实验组和对照组。
　　所有实验动物均在实验前2～3d做右侧颈静脉导管［4］, 以便在实验期间注入药品和采集血样。 手术后, 除了哺乳母鼠仍与其幼仔同处外, 其它动物均采用单独笼养。 在实验开始前至少1h, 将静脉导管与外接导管(PE50)相连接,采样前30min, 所有实验动物均通过上述导管接受350 IU的肝素以便实验操作。
　　实验中每只动物每10分钟采血一次, 共4次(0.5ml×4)。 尔后再输入等量的供体红血球生理盐水, 以避免可能的血沉变化干扰实验［5］。 血沉变化超过5%的动物将从实验中除去。 第一次血样采集后, 立即用蠕动泵将VIP(5μg/100g 体重, Peninsula Lab.)或者其载体缓慢注入动物血液系统中, 此操作过程持续1min±10s。 整个实验过程中, VIP的操作均严格按其理化特性要求在冰浴条件下进行, 所得血样也在同样条件下操作, 在最后一次采样后20min内, 血浆样品立即贮存于-70℃冰箱内, 所有样品测定均在3个月内完成。
　　哺乳母鼠在实验前先与其幼仔分离4h, 然后, 一部分直接进入实验(非吮吸组), 而另一部分则再使幼仔对其进行10min的吸吮刺激(吸吮刺激组)。 另外, 在吸吮刺激前后加采两个血样, 以测定催乳素的诱导峰和监控刺激效果。
　　血浆催乳素的放射免疫法测定以NIADDK提供的试剂进行, 所有血样均在同一批次内以双管完成测定, 其批内变异系数为6.9%, 各组在每个时间点上的重复(动物)数为11～14个, 各组数据均以g-12.gif (166 bytes)表示。
　　血浆VIP的放射免疫法测定按已有报道进行［6］, 同位素碘(125I)标记的VIP 购于New England Nuclear, VIP抗血清以合成VIP (Peninsula Lab.)为抗原在英格兰大白兔体内产生。 VIP抗血清与以下所测多肽的交叉反应均低于0.1%: somatostatin, secretin, glucagon, GH-RH及substance P, 放射免疫测定所用抗血清稀释度为1∶60000, 测定灵敏度为15pg/管, 批内变异系数为4.8%。 所有实验数据均以Student′s t　test 方法进行统计处理。
　　静脉内注入VIP使动物循环血液中的VIP浓度迅速增高(P<0.001), 10min内达到峰值, 并稳定持续到注入后40min(表1)。

表 1　VIP注入后在血液中的浓度
Table 1　VIP concentration (ng/ml) in plasma after VIP infusion

 

Group

Time

0

10

20

30

　40 (min)

Control

4.20±1.77

　4.06±1.91

　4.16±1.68

　4.22±1.87

　4.17±1.99

VIP

4.00±1.80

21.32±2.33*

21.11±2.20*

20.02±2.17*

18.40±2.08*

 


g-13.gif (166 bytes), *P<0.001.

　　如图1所示, 在所有的内分泌模型中, VIP都能诱导出催乳素释放显著增加(P<0.05), 其数值均在处理后10min达到峰值。 催乳素对VIP的这种反应在雄性模型高于各雌性模型, 前者在20min时明显减弱, 在30min时恢复到处理前的基值(图1E), 而在其它模型中(图1A, B), 催乳素在20min时就已经恢复到基值。
　　在泌乳鼠, VIP在幼仔分离组(Separated)中(图1C)只诱导了一个小而显著的峰值(VIP vs saline: 31.50±4.42 vs 13.14±0.67, P<0.05), 相反在幼仔吸吮刺激组(suckled)中(图1D)VIP却诱导出一个较强的峰值(VIP vs saline:90.10±36.00 vs 11.14±1.60, P<0.05)。

 

64.gif (2535 bytes)

65.gif (2742 bytes)

66.gif (2661 bytes)

67.gif (2721 bytes)

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图　1　注入VIP(■)或生理盐水(□)对间情期雌鼠(A)、发情前期雌鼠(B)、与幼子分离后无吸吮刺激(C)或有吸吮刺激(D)的哺乳鼠及雄鼠(E)的血浆催乳素浓度的影响
Fig.1　Effects of VIP (■) or saline (□) infusion on plasma PRL in diestrus (A), proestrus(B), separated (C) and suckled lactating (D) female rats and male (E) ones.
g-14.gif (166 bytes). *P<0.05; ***P<0.001.

　　虽然VIP的促催乳素释放作用在离体和活体都有过报道, 但由于实验条件和动物模型不同, 使其结果的比较显得非常困难甚至相互矛盾。 本实验则在清醒自由活动状态下研究VIP在不同动物模型中对催乳素分泌的影响, 发现VIP的作用不仅在各种动物模型之间不同, 而且与类似的体外实验也有差异。 与我们过去的离体实验［7］相反,本实验中, VIP的催乳素释放作用雄性高于雌性。 这种差异可能是在活体状态时,VIP的垂体作用与垂体以外的作用部位发生相互影响。 尽管其机理尚不清楚,但垂体外作用部位(或位点)可能是在体实验中雄性大鼠催乳素释放高于雌性的重要原因。也不能排除VIP受体在雄性大鼠的中枢系统高于雌性的可能性,但这有待于中枢神经系统中VIP受体数量及其亲和力的研究来证实。
　　另一种可能是雌性垂体门脉系统中的VIP浓度高于雄性, 这种高浓度导致了对VIP刺激的脱敏性也高于雄性, 因而表现出低于雄性的敏感性。 多巴胺是公认的催乳素释放抑制激素, 垂体柄漏斗部多巴胺神经的活性在雌性高于雄性, 这一现象可能是VIP诱导的催乳素释放在雌性低于雄性的另一个原因。 然而, 有报道表明, 与TRH不同, 在垂体细胞培养系统中短期除去多巴胺［8,9］或者在活体实验中用多巴胺拮抗物短期抑制多巴胺活性［10～12］, 并不能显著提高VIP对催乳素释放的刺激作用, 因此, 尚有待于进一步的研究。
　　对哺乳母鼠来说, 未经幼仔吸吮刺激的母鼠对VIP刺激表现出一个较小的催乳素释放峰, 这很可能是VIP对垂体直接作用的结果。 因为这个结果与我们在同样动物模型的体外实验结果完全一致［7］, 并且与Escalada［13］等的分子生物学研究结果吻合。 他们发现, 虽然哺乳母鼠的垂体对VIP的刺激比较敏感, 然而, VIP在下丘脑的这种作用主要是在分泌水平上的, 因为下丘脑VIP的mRNA含量并未发生显著的变化。 而对于经过幼仔吸吮刺激之后的母鼠来说, VIP诱导出了一个相当高的催乳素峰值。 由此可见, 幼仔的吸吮刺激对于母鼠来说起着非常重要的易化作用, 然而, 其机理尚不清楚。 Haisenleder等［11］的实验表明, 该作用可能与吸吮刺激所诱导的多巴胺下降无关, 因为, 由药理学方法所诱导的多巴胺下降并不能增强VIP的催乳素释放作用, 而Balsa等［3］以雄性成年大鼠的垂体前叶细胞为对象进行研究, 认为VIP能够以自旁分泌(autoparacrine)的形式对受多巴胺控制的催乳素分泌进行调节, 显然, 该研究并没有考虑来自不同动物模型的催乳素细胞对VIP反应的差异性。
　　由于TRH也有促进催乳素分泌的作用, VIP的促进催乳素分泌作用是否与TRH有关尚不清楚。 此外, 由于VIP和PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating peptide)有一段相同的氨基酸序列, 内源性PACAP与VIP交互作用的可能性也不能排除［14,15］。 因为, 本研究严格地控制了所有的实验操作时间, 可以肯定, 催乳素的排卵前高峰和每日节律性分泌高峰在本研究中均不占居重要地位, 这方面与前人的研究结果相符。 但是, 由于serotonin的介入, 在催乳素每日节律分泌中, 使得其作用机理比已有的模型都更为复杂。 本研究揭示了VIP在不同动物模型中促进催乳素分泌功能的复杂性, 提示有关研究应予以高度的重视。

*阿根廷国家科学研究基金资助 (No.K6H35832)
*Supported by Argentine Research Council (CONICET)(No.K6H35832)

作者单位：朱宝长　韩菊花　华东师范大学生物系, 上海 200062;
　　　　　Sara R. CHIOCCHIO　神经生物研究所, 布宜诺斯艾利斯, 阿根廷

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1998-04-27收稿　　1998-07-13修回