内皮素对培养心肌细胞内
游离钙浓度的作用^*

王庭槐　吴　滨　朱小南　潘敬运

摘　要　　实验用培养新生SD大鼠心室肌细胞, 以Fura-2/AM 荧光指示剂负载检测心肌细胞内游离钙浓度(［Ca²⁺］_i)的变化, 探讨内皮素-1(ET-1)对［Ca²⁺］_i的作用及其机制。结果显示: ET-1引起心肌细胞［Ca²⁺ ］_i升高有两个时相, 瞬时相和持续相。ET-1 诱导的瞬时相［Ca²⁺］_i升高呈浓度依赖性, 预先用ET_A特异性受体阻断剂BQ123 处理, 可阻断ET-1引起的［Ca²⁺］_i 升高, 提示上述作用是通过ET_A受体介导的; 除去胞外Ca²⁺ 后, ET-1仅引起瞬时相的 ［Ca²⁺］_i 升高, 持续相消失; PKC 的激活剂PMA预处理, 能明显减弱ET-1诱导的瞬时相［Ca²⁺］_i 的升高。氨氯吡咪和硝苯吡啶不能阻断ET-1诱发的［Ca²⁺］_i 变化; 用百日咳毒素(PTX)预处理细胞24 h, ET-1仍可诱导瞬时相的［Ca²⁺］_i 升高, 但持续相消失。以上结果表明: 瞬时相［Ca²⁺］_i升高可能与百日咳毒素不敏感的G-蛋白有关, 持续相主要由胞外Ca²⁺内流引起的, 并与PTX敏感G-蛋白有关。蛋白激酶C 在该效应中起重要作用, Na⁺/H⁺交换在ET-1引起的［Ca²⁺］_i升高过程中不起关键性作用。
关键词: 内皮素-1; 细胞内游离钙浓度; 百日咳毒素; 硝苯吡啶; 佛波酯
学科分类号: Q463; R331.3

EFFECT OF ET-1 ON INTRACELLULAR FREE
CALCIUM IN CULTURED NEONATAL MYOCARDIAL CELLS^?

WANG　TING-HUAI，　WU　BIN，　ZHU　XIAO-NAN，　PAN　JING-YUN
(Department of Physiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089)

ABSTRACT:In this present study, the effects of ET-1 on intracellular free calcium concentration (［Ca²⁺］_i) and the underlying mechanisms were investigated in cultured neonatal rat myocardail cells loaded with fura-2/AM. The results are as follows. ET-1 induced an increase of ［Ca²⁺］_i in a dose-dependent manner, which consisted of a transient and sustained phase. BQ123, a selective ET_A receptor antagonist, blocked the ET-1 induced ［Ca²⁺］_i responses, suggesting that these responses were mediated by ET_A receptors. After removal of extracellular Ca²⁺, ET-1 induced the transient increase of ［Ca²⁺］_i without the sustained change. Protein kinase C (PKC) agonist PMA attenuated the ET-1 induced transient ［Ca²⁺］_i increase. Amiloride and nifedipine did not block the ［Ca²⁺］_i change induced by ET-1. After pretreatment of myocardial cells with pertussis toxin, ET-1 also induced the transient increase of ［Ca²⁺］_i but did not affect the sustained increase. These results suggest that the transient ［Ca²⁺］_i increase may involve pertussis toxin-insensitive G protein and the sustained one may be caused by extracellular calcium influx, in which pertussis toxin sensitive G protein is involved. Furthermore, PKC, but not Na⁺/H⁺ exchange, plays an important role in these effects.
Key words: endothelin-1; intracellular free calcium concentration; pertussis toxin; nifedipine; phorbol ester

　　现已证实, 心肌细胞可以合成内皮素-1 (ET-1)^［1］并含有ET-1受体^［2］。ET-1 对心肌有显著的正性肌力作用, 且能刺激心肌细胞产生肥大反应^［3］。在心肌正性肌力作用和肥大反应中, 细胞内游离Ca^2＋浓度(［Ca²⁺］_i)的变化起重要作用。本实验用培养新生大鼠心肌细胞研究ET-1 诱导［Ca²⁺］_i 升高的机制。

1　材料和方法

1.1　心肌细胞培养　　按本实验室所用的方法培养新生Spraque-Dawley大鼠心肌细胞^［4］: 取出1～3 d龄大鼠的心脏, 切成约1 mm³大小的碎块, 用0.125% 胰蛋白酶溶液消化, 然后于37℃、 5% CO₂的细胞培养箱(Heraeus West Germany)内孵育2 h。用差速贴壁法去除非心肌细胞。收集细胞悬液, 配成2.5×10⁵ 细胞/ml悬液。在培养的最初2 d, 加入0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿嘧啶核苷, 以抑制非心肌细胞生长。
1.2　［Ca²⁺］_i 测定　　将培养4 d的心肌细胞用0.125%胰蛋白酶和0.02% EDTA溶液消化、吹散、 离心(1?000 r/min)弃上清, 用新配制的M199培养液将沉淀反复洗3次, 然后稀释细胞,使其浓度为1×10⁶细胞/ml。将心肌细胞悬液置于细胞培养瓶中,加入含Fura-2/AM　(终浓度为1 μmol/L)的负载液, 放入二氧化碳培养箱内孵育30 min, 然后将培养瓶中的细胞移到离心管, 用不含Fura-2/AM的负载液反复轻洗3次, 然后去上清液, 用HEPES缓冲液［成分(mmol/L): 98 NaCl, 10 NaHCO₃, 10 NaH₂PO₄, 4.7 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.2 MgSO₄, 1.25 CaCl₂, 10 HEPES, 10葡萄糖, 0.1% 牛血清白蛋白］稀释。使其浓度为1×10⁶个细胞/ml, 然后进行［Ca²⁺］_i测定。测定时, 取心肌细胞悬液1 ml, 置于石英杯内, 用磁力搅拌器搅拌, 维持心肌细胞的悬浮状态, 测试温度为37℃。平衡10 min后, 用荧光分光光度计检测^［5］。测定参数如下: 激发波长340 nm, 裂隙宽度3 nm, 发射波长500 nm, 裂隙宽度10 nm。［Ca²⁺］_i浓度按下列公式计算:
　　　　［Ca²⁺］_i=Kd ［(F－F_min)/(F_max－F)］(nmol/L)
Kd为解离常数(224 nmol/L), F为测定的荧光强度, F_max为加入1% Triton X-100后测得的最大荧光强度, F_min为加入EGTA (10 mmol/L)后测得的最小荧光强度。
1.3　药品与试剂　　Fura-2/AM, 硝苯吡啶, 佛波酯 (4-phorbol,12-myristate,13-acetate PMA), ET-1, BQ123, 氨氯吡咪(amiloride)均为Sigmas产品。
1.4　统计学处理　　数据用表示,用配对t检验作统计学分析。

2　结果

2.1　不同浓度的ET-1对心肌细胞［Ca²⁺］_i的作用
　　取心室肌细胞混悬液1 ml (以下各实验均相同), 分别加入不同浓度的ET-1, 每毫升细胞悬液只用一种ET-1浓度。ET-1引起［Ca²⁺］_i升高分两个时相: 瞬时相和持续相(图1A)。在1×10^－11mol/L～10^－7 mol/L范围内引起瞬时相的［Ca²⁺］_i 升高, 呈浓度依赖性(图1B)。使瞬时相［Ca²⁺］_i升高的峰值ET-1浓度为10^－7 ml/L, 瞬时相的［Ca²⁺］_i 从对照103.15±6.5 nmol/L升高到196.7±8.8 nmol/L, 持续相为120.5±5.6 nmol/L。

图　1　A. ET-1(1×10^－8 mol/L)对心室肌细胞［Ca²⁺］_i 的作用．　B. ET-1诱导［Ca²⁺］_i 升高的量-效曲线
Fig.1　A. Effect of ET-1 on ［Ca²⁺］_i in cultured neonatal ventricular myocytes. R: transient phase; S: sustained phase. ～^*　P<0.05, ～^*　*　P<0.01 vs control.
B. Dose-response curve for the increase in ［Ca²⁺］_i-induced by ET-1 in cultured neonatal ventricular myocytes. n=6 for each dose. ～^*　P<0.05, ～^*　*　P<0.01 vs control.

2.2　BQ123的作用
　　BQ123是ET_A受体特异性拮抗剂。在培养心肌细胞中预先加入1×10^－6 mol/L BQ123后, 心肌细胞［Ca²⁺］_i变化不明显(加药前为101.1±54 nmol/L, 加药后为 98.8±6.7 nmol/L) (P>0.05); 5 min 后再加入1×10^－8 mol/L ET-1, 未见心肌细胞［Ca²⁺］_i出现显著性变化(P>0.05)。
2.3　百日咳毒素的作用
　　百日咳毒素是G蛋白抑制剂。用150 ng/ml百日咳毒素预处理心肌细胞24 h, 心肌细胞［Ca²⁺］_i (102±6.9 nmol/L)与对照组(103.2±6.5 nmol/L)相比无显著性差异(P>0.05)。加入1×10^－8 mol/L ET-1后, 仍引起瞬时相的［Ca²⁺］_i 升高(188.3±28.6 nmol/L)(P<0.001), 但无持续相(图2)。

图 2　百日咳毒素对ET-1 (1×10^－8 mol/L)诱导［Ca²⁺］_i 升高的影响
Fig.2　Effect of pertussis toxin on ET-1-induced in～crease in ［Ca²⁺］_i in cultured cardiac myocytes
^*　*　P<0.01 vs control. R: transient phase; S: sustained phase. n=6 for each group.

2.4　PKC的作用
　　用PKC激动剂佛波酯(PMA)(1×10^－8 mol/L)预处理心肌细胞24 h以耗竭PKC。 PMA处理后, 心肌细胞的［Ca²⁺］_i (97.3±1.8 nmol/L)与对照组(103.2±6.5 nmol/L)相比, 无显著性差异(P>0.05); 加1×10^－8 mol/L ET-1后, 瞬时相的［Ca²⁺］_i轻度升高, 显著低于PMA预处理前ET-1诱导的心肌细胞［Ca²⁺］_i的升高(193.4±10.1 nmol/L)(P<0.01), 而持续相不受影响(图3)。

图　3　PMA对 ET-1诱导［Ca²⁺］_i 升高的作用
Fig.3　Effect of PMA on ET-1-induced increase in ［Ca²⁺］_i in cultured cardiac myocytes
～^*　P<0.05, ～^*　*　P<0.01 vs control. R: transient phase; S: sustained phase. P+R: transient phase with PMA pretreatment; P+S: sustained phase with pretreatment.

2.5　细胞外 Ca²⁺的作用
　　加入1 mol/L EGTA络合钙, 心肌细胞［Ca²⁺］_i 明显降低。然后, 加入1×10^－8 mol/L ET-1, 仍引起心肌细胞瞬时相的［Ca²⁺］_i 升高, 但无持续相。当悬浮液的Ca²⁺浓度恢复至1.25 mmol/L后。心肌细胞［Ca²⁺］_i 恢复至对照水平, 此时加入ET-1又出现瞬时相和持续相的［Ca²⁺］_i 升高(图4)。

图　4　除去细胞外Ca²⁺后ET-1对心肌细胞［Ca²⁺］_i的影响
Fig.4　Effect of ET-1 on ［Ca²⁺］_i in cultured neonatal ventricular myocytes after removal of extracellular calcium
～^*　P<0.05, ～^*　*　P<0.01 vs control. n=6 for each group.

2.6　硝苯吡啶的作用
　　硝苯吡啶是L-型钙通道阻断剂。加入1×10^－6 mol/L 硝苯吡啶, 心肌细胞［Ca²⁺］_i (n=6)与对照组(n＝6)相比无显著变化(98.2±7.6 nmol/L对比97.6±7.4 nmol/L)(P>0.05), 10 min后加入1×10^－8 mol/L ET-1(n=6),仍引起瞬时相［Ca²⁺］_i(181.7±5.2 nmol/L)和持续相［Ca²⁺］_i(121.3±3 nmol/L)升高。
2.7　氨氯吡咪的作用
　　氨氯吡咪是Na⁺/H⁺ 交换抑制剂。加入3 μmol/L氨氯吡咪后, 心肌细胞［Ca²⁺］_i 无显著变化, 对照组(n=6)为102.7±6.9 nmol/L, 氨氯吡咪组(n＝6)为100.9+9.5 nmol/L)(P>0.05), 5 min 后再加入1×10^－8 mol/L ET-1(n=6), 引起心肌细胞瞬时相(188±14.7 nmol/L)和持续相(125.6±11.3 nmol/L)的［Ca²⁺］_i 升高 。

3　讨论

　　本实验观察到, ET-1诱导的心肌细胞［Ca²⁺］_i升高有两个时相: 初始而短暂升高的瞬时相和随后持续升高的持续相, 瞬时相的［Ca²⁺］_i升高与ET-1呈剂量依赖性, 这两个时相的［Ca²⁺］_i升高可被特异性受体ET_A拮抗剂BQ123所阻断。用EGTA 络合悬浮液中的Ca²⁺去除心肌细胞外液的Ca²⁺, ET-1仍引起心肌细胞的瞬时相［Ca²⁺］_i 升高, 但持续相消失。表明ET-1诱导的瞬时相可能主要与胞内Ca²⁺释放有关, 持续相可能主要与胞外的Ca²⁺内流有关。
　　对于胞内Ca²⁺释放及胞外Ca²⁺内流的机制仍未充分了解。我们用PTX 预处理心肌细胞, ET-1诱导瞬时相的［Ca²⁺］_i升高不受影响, 而持续相消失。表明ET-1诱导瞬时相的［Ca²⁺］_i升高是不与百日咳毒素敏感G蛋白耦联的, 而持续相升高可能是通过百日咳毒素敏感G蛋白耦联的。用佛波酯预处理心肌细胞耗竭其PKC, 显著减弱了ET-1诱导瞬时相的［Ca²⁺］_i 升高, 说明PKC在ET-1诱导的瞬时相［Ca²⁺］_i 升高中起重要的作用。至于持续相心肌细胞［Ca²⁺］_i升高, 胞外Ca²⁺通过细胞膜上的哪一种Ca²⁺通道内流仍有争论。 Lauer 等^［6］在兔的心肌细胞中证实, ET-1通过G蛋白间接激活电压依赖性的L-型钙通道; 我们用L-型电压依赖性钙通道拮抗剂硝苯吡啶, 未影响ET-1引起的［Ca²⁺］_i升高, 提示ET-1引起的心肌细胞的胞外Ca²⁺内流不是通过L-电压依赖性钙通道。Benchekraun等^［8］ 在兔主动脉平滑肌条的实验中证实, ET-1诱导的细胞外Ca²⁺内流是通过isradipine-敏感的R型Ca²⁺通道。Furukawa等^［7］在培养新生大鼠心室肌细胞中用膜片箝方法分析了Ca²⁺ 内流的通道。他们证实, ET-1是激活T型钙通道而引起Ca²⁺内流的; Tang等^［9］通过片膜箝技术证实, 氨氯吡咪可选择性阻断包括豚鼠心房肌在内的多种细胞的T型钙通道。我们用氨氯吡咪不改变ET-1诱导的持续相的［Ca²⁺］_i 升高, 提示胞外Ca²⁺内流与T-型钙通道无关。究竟持续相［Ca²⁺］_i升高与哪种钙通道有关值得进一步讨论。氨氯吡咪在高浓度时抑制Na⁺/H⁺交换。我们的结果显示, 氨氯吡咪不影响ET-1诱导的两个时相的［Ca²⁺］_i升高, 这表明ET-诱导的［Ca²⁺］_i变化与Na⁺/H⁺交换关系不大。但在酸中毒条件下, ET-1可刺激乳头肌细胞的Na⁺/H⁺ 交换, 提高细胞内pH, 延长［Ca²⁺］_i升高的时程, 增强张力发生^［10］。
　　总之, 我们的结果证明, ET-1刺激新生大鼠心室肌细胞［Ca²⁺］_i升高, 呈两相反应, 即瞬时相和持续相。这种作用是由ET_A受体介导的; ET-1刺激心肌细胞的瞬时相［Ca²⁺］_i升高可能与百日咳毒素敏感G-蛋白无关, PKC在该效应中起重要作用, 而持续相的［Ca²⁺］_i升高主要是由胞外Ca²⁺内流引起的, 与百日咳敏感的G-蛋白有关; ET-1引起的［Ca²⁺］_i升高过程似乎不涉及Na⁺/H⁺交换。

^*国家自然科学基金资助项目 (No.39470810); 高等学校博士点专项基金资助 (No.93151)生理学报，1999年8月，51(4)，391～396
中山医科大学生理教研室, 广州 510089

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^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39470810) and Higher Education Doctoral Science Foundation of China (No.93151)

1998-06-21收稿　　1998-11-03修回
Acta Physiologica Sinica
Aug. 1999, 51 (4), 391～396