反义MAPK寡核苷酸对AngⅡ及EGF
诱导的心肌成纤维细胞增殖的抑制效应^*

丁　波　黄韶铃^**　李云霞

摘　要　　血管活性肽和生长因子是性质不同且胞浆头端信号通路各异的两种具有丝裂原活性的物质。本文研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和表皮生长因子(EGF)诱导的心肌成纤维细胞(FB)分裂反应中的作用及反义MAPK寡核苷酸的抗分裂作用和机制。结果如下: (1)AngⅡ或EGF(浓度均为10^－8 mol/L)处理培养新生大鼠FB 24 h, FB数增加39%和68%, DNA合成速率(～³H-thymidine 掺入法)增加60%和102%; (2)FB经AngⅡ (5 min)或EGF(10 min)处理后, MAPK活性(γ-～³²P掺入法)分别增加202%和305%; 磷酸化MAPK蛋白含量(免疫印迹法)增加545%和646%; (3)脂质体转染法将反义MAPK寡脱氧核苷酸(ODN)导入FB, MAPK蛋白表达显著被抑制; AngⅡ 或EGF诱导的FB DNA合成速率比脂质体对照组分别降低58%和46%, 细胞数降低38%和44%; 磷酸化MAPK含量降低85%和90%, MAPK活性降低74.2%和65.9%。 结果提示, 在AngⅡ或EGF诱导的心肌FB分裂反应中均有MAPK激活过程参与, 而反义MAPK ODN通过阻断MAPK蛋白表达抑制AngⅡ或EGF诱导的分裂反应。
关键词: 心肌成纤维细胞; 分裂; 血管紧张素Ⅱ; 表皮生长因子; 丝裂素活化蛋白激酶; 反义寡脱氧核苷酸
学科分类号: Q463

INHIBITORY EFFECTS OF ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES
TARGETING MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE (MAPK)
mRNA ON NEONATAL RAT CARDIAC FIBROBLAST
PROLIFERATION INDUCED BY AngⅡ AND EGF^?

DING　BO，　HUANG　SHAO-LING^**，　LI　YUN-XIA
(Laboratory of Cardiovascular Physiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)

ABSTRACT:In the present study, the antisense oligodeoxynucleotide (ODN) approach was used to investigate whether mitogen-activated protein kinase (MAPK) is necessary for the pro～lifer～ation response in neonatal rat cardiac fibroblast (FB) induced by angiotensinⅡ (AngⅡ) or epidermal growth factor (EGF), the proximal cytosolic signal transduction path～ways which are quite different processes. A phosphorothioate-protected 17-mer directed against the initiation of translation sites P⁴² MAPK mRNA was introduced into FB by liposomal transfection. The results showed that (1) after a 24 h treatment with AngⅡ or EGF (all 10^－8 mol/L), the FB numbers were increased by 39% and 68%, while the rate of DNA synthesis increased by 60% and 102%, respectively. (2) Following 5 min or 10 min stimulation with AngⅡ or EGF, MAPK activity (［γ-～³²P］ATP incorporation) increased by 202% and 305%, and phospho-MAPK protein content increased by 545% and 646% correspondingly. (3) As compared with lipofectin+AngⅡ/EGF control, after pre～treat～ment with MAPK antisense ODN, the MAPK protein expression was inhibited significantly; the rate of DNA synthesis of FB induced by AngⅡ or EGF was reduced by 53% and 46%, cell numbers by 38% and 44%, respectively. Meanwhile, MAPK activity was decreased by 74.2% and 65.9%, phospho-MAPK protein content by 85% and 90%. The sense or random ODN has not much effect on them. Consequently, it can be concluded that (1) MAPK activity is essential in the event of involving FB proliferation response reduced by AngⅡ and EGF, and (2) FB proliferation response could be inhibited by the MAPK antisense ODN through depletion of MAPK.
Key words: cardiac fibroblast; proliferation; angiotensin Ⅱ; epidermal growth factor; mitogen-activated protein kinase; antisense oligonucleotide

　　心肌间质纤维化和心肌细胞肥大是压力超负荷肥大心肌的两个主要病理成分, 而心肌间质成纤维细胞(fibroblast, FB)过度分裂是导致心肌纤维化, 进而引起心肌间质重建, 引发心肌衰竭的关键病理变化^［1］。因此, FB生长调控机制的研究受到广泛重视。近年研究表明, 血管活性肽以及多肽生长因子不但能刺激心肌细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)生长或分裂, 对心肌FB也具有很强的丝裂原活性^［2,3］, 另一方面, 在VSMC和心肌细胞上的研究证实, 这两种活性物质不仅化学性质不同, 而且它们介导生长信号的胞浆头端信号通路也是不相同的^［4］。问题是, 为什么它们都能引起相同的生物学效应细胞生长、分裂。
　　90年代大量研究工作证实, 丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)级联反应是多种细胞膜受体(生长因子受体和G蛋白偶联受体)介导的细胞生长和分裂信号由胞浆越核膜传递的最后共同通路^［5］。 本室前段工作揭示, 新生大鼠FB MAPK, 包括分子量分别为44 kD和42 kD的两个同型体P⁴⁴ MAPK 和P⁴² MAPK, 在介导心肌FB分裂反应中起关键作用^［6］。已经知道, 与特定基因mRNA互补的反义寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)具有阻断该基因翻译、消除相应编码蛋白表达的分子生物学特性^［7］。因此, 本文采用脂质体转染法将针对 P⁴⁴ MAPK 和P⁴² MAPK的mRNA的反义ODN导入培养新生大鼠心肌FB, 观察它对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和表皮生长因子(EGF)诱导的FB ～³H-thymidine掺入速率、 MAPK蛋白含量和酶活性的影响, 以了解MAPK在两种不同性质丝裂原诱导的FB分裂反应中的作用, 以及MAPK反义 ODN的抗分裂效应和机制。

1　材料和方法

1.1　新生大鼠心肌成纤维细胞培养和实验分组　　胰蛋白酶液消化(37℃, 10 min) 1～3 d龄Wistar大鼠(本院提供)左心室碎块, 收集各次消化的上清, 用含10%小牛血清的 M199培养液制备成细胞悬液, 差速贴壁法除去心肌细胞, 贴壁细胞培养至第6 d传代^［8］。实验采用第二代FB, 用含10%小牛血清的M199培养液配成2.5×10⁵个/ml细胞悬液备用。
　　实验分AngⅡ和EGF两个系列(干预浓度皆为10^－8 mol/L), 各含6个实验组: (1)空白对照组(Ctrl): 加等体积M199培养基; (2)AngⅡ组 (AngⅡ): ［Sar¹］AngⅡ 10^－8 mol/L, 测FB细胞数和DNA合成速率, 处理时间为24 h; 测MAPK活性和磷酸化MAPK蛋白含量, 处理时间为5 min; (3)MAPK反义ODN组(Ant); (4)MAPK正义ODN组(Sen); (5)MAPK随机ODN组(Ran); (6)脂质体对照组 (Lipo)。(3),(4),(5),(6) 4组脂质体转染法分别将反义、 正义和随机ODN或单纯脂质体导入FB, 24 h后加AngⅡ, 随后的处理同AngⅡ组。
　　EGF系列实验中, 除测MAPK活性和MAPK含量时EGF处理时间为10 min外, 余同AngⅡ系列。
1.2　FB分裂指标的检测^［8］　　将FB悬液以每孔1　ml的密度种植于24孔板, 无血清培养饥饿24 h, 加入AngⅡ或EGF(均10^－8 mol/L, 空白对照加等体积培养基)18　h后, 加～³H-thymidine(74　kBq/孔)继续孵育6 h。弃培养液, 胰蛋白酶消化使细胞脱落, 将细胞收集在玻璃纤维滤膜上, 10%三氯乙酸破碎细胞并将滤膜烘干后置于闪烁瓶中, 加入闪烁液, 测定其放射性强度以反映FB DNA合成速率。置未加同位素孔的细胞于血球计数板内计数。
1.3　MAPK活性测定 ^［9］　　把FB悬液种植于12孔板(2 ml/孔), 与AngⅡ或EGF分别孵育5或10 min后, PBS洗板, 加入细胞裂解液Buffer A 冰浴30 min后, 超声处理5 s, 离心后收集的上清液即为FB裂解液。取50 μl FB裂解液与10 μl 6×buffer B 于30℃ 反应15 min。取40 μl点样于P81滤纸上, 75 mol/L 冰冷磷酸溶液漂洗 6×10 min。红外烤干后, 测定其放射活性。另取20　μl FB裂解液按Bradford法^［10］测定蛋白含量。MAPK活性单位以pmol/min*mg protein表示。
　　Buffer A组成(mmol/L): HEPES 10 pH 7.4, 焦磷酸钠50, leupeptin 0.5, NaF 50, NaCl 50, EGTA 5, EDTA 5, Na₃VO₄ 0.1, 0.1% (Vol/Vol) Triton-100; buffer B 组成(mmol/L): HEPES 120 pH 7.2, Na₃VO₄ 3.0, MgCl₂ 60, MnCl₂ 12.0, ATP 0.3, 蛋白激酶抑制肽 0.03, DTT 12.0, BSA 0.6 mg/ml, MBP 6.0 mg/ml, 444 kBq ［γ-³²p］ATP。
1.4　免疫印迹法^［11］测定MAPK含量　　25 μl FB裂解液经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳, 经电转移至硝酸纤维素膜上, 丽春红S染色标记标准蛋白Marker所在位置。含5% (Wt/Vol) BSA的PBST ［mmol/L: Na₂HPO₄ 80, NaH₂PO₄ 20, NaCl 100, 0.05%　(Vol/Vol) Tween-20］室温封闭1 h, 先后加入一抗(兔抗大鼠MAPK单克隆抗体, 1∶10?000稀释度)和二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG, 1∶1?000稀释度)室温下分别孵育1 h。膜与化学发光增强剂反应1 min, X光片压片曝光。经显影和定影, 激光光密度扫描仪(Pharmacia LKB. Ultro ScanXL)测定免疫印迹区带的光密度。
1.5　寡脱氧核苷酸(ODN)　　采用硫代磷酸修饰的ODN, 三种ODN(MAPK反义ODN, 正义ODN和随机ODN)均含17个碱基, 其序列参照文献^［12］确定, 由美国辛辛那提大学DNA中心合成纯化。MAPK反义ODN (antisense ODN, Ant)为直接针对大鼠P⁴²MAPK mRNA翻译起始部位的17个碱基的ODN, 序列为 5′-GCC GCC GCC GCC GCC AT-3′; 正义ODN (sense ODN, Sen), 序列为5′-ATG GCG GCG GCG GCG GC-3′; 随机ODN (random ODN, Ran), 所含碱基的种类和数量与反义ODN相同, 但顺序随机排列: 5′-CGC GCG CTC GCG CAC CC-3′。
1.6　ODN的脂质体转染法　　DMEM/M199 (4∶1)将ODN和Lipo分别稀释成0.8 μmol/L和80 μg/ml, 两者等容积混合, 制备成脂质体包裹的ODN母液。将ODN母液加入FB培养板中, 加入培养液调节ODN终浓度为0.2 μmol/L, Lipo终浓度为20 μg/ml, 培养10 h。弃上清培养液, 再加入含相同ODN浓度的培养液, 继续作用24 h, 即可进行各项干预实验。
1.7　荧光标记ODN脂质体转染检测　　FAM 标记的反义ODN(终浓度为0.4 μmol/L)按1.6法转染FB, 经不同时间收集细胞, D-PBS洗涤4次, 2%甲醛溶液室温固定20 min, D-PBS洗涤3次, 磷酸甘油封片, 于荧光显微镜(Nikon)下观察照相。
1.8　材料和试剂　　M199, M199-2 SFRE, ［Sar¹］AngⅡ, 兔抗大鼠MAPK单克隆抗体, 过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(IgG)、　蛋白激酶抑制肽(氨基酸序列为TTYADFIAS GRRAN-AIHD), leupeptin, PMSF, MBP均购自Sigma公司; 化学发光增强剂, ［γ-～³²P］ATP (111 TBq/mmol^.L^－1) 购自杜邦公司; PD98059, 兔抗大鼠MAPK总蛋白单克隆抗体购自New England Biolabs, Inc; ³H-thymidine (1110 GBq/mmol^.L^－1, 37 MBq/ml)购自中国科学院上海原子核研究所。
1.9　统计方法　　共进行了3～5批实验。 在同一批实验中, 每个实验组的数据为4个平行孔数据的平均值, 结果以表示。两组间或多组间数据分别采用组间t检验或ANOVA进行统计学分析。

2　结果

2.1　AngⅡ 或EGF对心肌FB分裂的刺激作用
　　由实验结果可以看出: AngⅡ或EGF处理24 h后, ～³H-thymidine 掺入速率(cpm/孔)由对照1?306±39分别增至2?084±150和2?635±206, 即升高60%和102%; 细胞数目分别增加39.2%或67.9%(P<0.01, 图1)。
2.2　AngⅡ或EGF对心肌FB MAPK活性的影响
　　培养新生大鼠心肌FB MAPK活性较低, 仅为22.1±7.9 pmol/min^.mg^－1 Pr。AngⅡ 或EGF(分别处理5或10 min)促使MAPK活性显著升高, 分别达66.8±11.8 和89.6±7.2 pmol/min^.mg^－1 Pr, 即比对照组升高202%和305%(图2)。

图　1　AngⅡ或EGF对培养新生大鼠心肌FB ～³H-胸腺嘧啶掺入的刺激作用及MAPK反义ODN对AngⅡ或EGF刺激作用的影响
Fig.1　Stimulatory effect of AngⅡ or EGF on ～³H-thymidine incorporation in cultured neonatal rat cardiac fibroblast and the effect of MAPK antisense ODN on ³H-thymidine incorporation stimulated by AngⅡ or EGF
^**　P<0.01 vs control, ^##　P<0.01 vs lipofectin control. n=5 for each group.

图　2　AngⅡ或EGF对培养新生大鼠心肌FB MAPK活性的刺激作用及MAPK反义ODN对AngⅡ或EGF刺激作用的影响
Fig.2　Stimulatory effect of AngⅡ or EGF on MAPK activity in cultured neonatal rat cardiac fibroblast and the effect of MAPK antisense ODN on MAPK activity stimulated by AngⅡ or EGF
～^*　*　P<0.01 vs control, ～^#　#　P<0.01 vs lipofectin control. n=3 for each group.

2.3　AngⅡ或EGF对心肌FB MAPK磷酸化的影响
2.3.1　AngⅡ刺激后心肌FB MAPK蛋白磷酸化时效关系　　用10^－8 mol/L AngⅡ分别以不同时间作用于心肌FB。免疫印迹法显示, 培养新生大鼠心肌FB MAPK存在分子量分别为44和42 kD的两个同型体P⁴⁴MAPK和P⁴²MAPK。 MAPK蛋白的磷酸化在AngⅡ作用2 min便开始激活, 5 min达高峰(1.983±0.2590 AU/mm²), 随后迅速下降, 直至120 min内呈低水平状态(图3)。

图　3　AngⅡ (10^－8 mol/L) 刺激心肌FB MAPK蛋白磷酸化时效关系
Fig.3　Time-dependence of cardiac fibroblast MAPK protein phosphorylation stim～u～lated by AngⅡ (10^－8 mol/L)
Upper panel: MAPK immunoblots. Lower panel: quantification of MAPK immunoblots using laser densitometry.

图　4　AngⅡ (5　min) 刺激心肌FB MAPK蛋白磷酸化量效关系
Fig.4　Does-dependence of cardiac fibroblast MAPK protein phosphorylation stim～u～lated by AngⅡ (5 min)
Upper panel: MAPK immunoblots. Lower panel: quantification of MAPK immunoblots using laser densitometry.

2.3.2　AngⅡ刺激后心肌FB MAPK蛋白磷酸化的量效关系　　以不同浓度的AngⅡ作用于心肌FB 5 min, 免疫印迹显示AngⅡ于10^－12 mol/L浓度时既能激活MAPK磷酸化, 于10^－6 mol/L时达高峰(1.315±0.1270 AU/mm² 积分值), 随后开始下降(图4)。
2.3.3　PD98059对AngⅡ刺激的心肌FB MAPK磷酸化的影响　　PD98059是MAPK激酶(MEK　1/2)的特异性抑制剂, 可特异性地抑制MAPK的磷酸化。以30 μmol/L PD98059预处理培养心肌FB 30 min, AngⅡ(10^－8 mol/L)作用5 min, 免疫印迹显示, 磷酸化MAPK含量显著降低, 与单纯AngⅡ 刺激组相比, 下降了62%(图5)。

图　5　　PD98059 (30 μmol/L)对AngⅡ刺激的心肌FB MAPK蛋白磷酸化的抑制效应
Fig.5　Inhibitory effect of PD98059 on cardiac fibroblast MAPK protein phospholation stimulated by AngⅡ　(10^－8 mol/L)
Upper panel: MAPK immunoblots. Lower panel: quantification of MAPK immunoblots using laser densitometry.

2.4　荧光标记反义ODN转染心肌FB观察
　　培养心肌FB在转染8 h后, 荧光标记的ODN逐步穿过细胞膜进入胞浆并向胞核方向移动(图6)。

图　6　反义MAPK ODN转染心肌FB 8 h的荧光显微图片(左)及相应相差显微图片(右)
Fig.6　Fluorescence micrograph (left) and identified phase contrast micrograph (right) of cardiac fibroblasts transfected by MAPK antisense ODN labeled with FAM for 8 h.

2.5　反义MAPK ODN对AngⅡ 和EGF 诱导的FB分裂反应的抑制作用
　　脂质体转染法将三种ODN导入培养心肌FB后, (以单纯脂质体组作对照, Lipo), 再分别加入AngⅡ或EGF, 结果发现反义MAPK对两种丝裂原诱导的分裂反应均有明显抑制作用: ～³H-thymidine 掺入率和细胞数目两个指标在反义MAPK+AngⅡ组比Lipo组分别下降54%和38%; 反义MAPK+EGF 组比Lipo组下降46%和44%, 反义MAPK处理后的数据均与未经AngⅡ或EGF处理的空白对照组相近。表明MAPK反义ODN完全阻断了两种丝裂原诱导的分裂反应, 而正义MAPK和随机MAPK对～³H-TdR掺入速率和细胞数目与Lipo组无明显差别(图1)。
2.6　反义MAPK ODN可以抑制AngⅡ或EGF诱导的MAPK活性增高
　　无论是AngⅡ还是EGF, 对FB MAPK活性的刺激作用均可被反义MAPK ODN取消; 反义MAPK+EGF组, MAPK活性(pmol/min*mg^－1 Pr)明显低于脂质体+EGF对照组(22.1±7.4 vs 67.7±9.2), 接近未加任何处理的空白对照组(22.1±7.9)。反义MAPK+AngⅡ组, MAPK活性为15.0±9.0, 明显低于脂质体+AngⅡ对照组(58.1±12.9)(图2)。
2.7　反义MAPK ODN通过下调MAPK蛋白表达而取消AngⅡ或EGF对MAPK磷酸化的刺激作用
　　AngⅡ或EGF可明显促进MAPK蛋白磷酸化, 与空白对照组相比分别升高545%和646%。MAPK蛋白表达的作用在转染24～36 h后可被反义MAPK ODN显著抑制, 而AngⅡ或EGF所刺激的蛋白磷酸化程度也相应显著降低。与脂质体对照组相比较, 反义MAPK ODN+AngⅡ组, 磷酸化MAPK含量下降85%; 反义MAPK ODN+EGF组, 磷酸化MAPK含量下降90%(图7、8)。

图　7　　反义MAPK ODN转染培养新生大鼠心肌FB后对AngⅡ(10^－8 mol/L)刺激的MAPK蛋白表达的影响
Fig.7　Effect of MAPK antisense ODN on MAPK protein 　expression of cultured neonatal rat cardiac fibroblasts stimulated by AngⅡ (10^－8 mol/L)
Upper panel: MAPK immunoblots. Lower panel: quantification of MAPK immunoblots using laser scanning densitometry.

图　8　AngⅡ或EGF对培养新生大鼠心肌FB MAPK磷酸化的刺激作用及MAPK反义ODN对AngⅡ或EGF刺激作用的影响
Fig.8　Stimulatory effect of AngⅡ or EGF on MAPK phosphorylation in cultured neonatal rat cardiac fibroblast and the effect of MAPK antisense ODN on the function of AngⅡ or EGF
Upper panel: representative immunoblot showing P⁴⁴MAPK and P⁴²MAPK in presence of AngⅡ or EGF treated series. Lower panel: quantification of immunoblots of MAPK using laser densitometry.～^*　*　P<0.01 vs control, ～^#　#　P<0.01 vs lipofectin control. n=3 for each group.

3　讨论

　　本文获得两项重要结果: (1)AngⅡ 或EGF对心肌FB均具有丝裂原活性, 在浓度10^－8 mol/L时即可促进FB分裂, 而MAPK的激活参与AngⅡ和EGF诱导的分裂反应; (2)反义MAPK ODN通过抑制或消除MAPK蛋白表达, 发挥抗FB分裂反应的作用。
　　已有研究表明, AngⅡ和EGF调节心肌细胞和VSMC生长和分裂的胞浆头端信号通路是不相同的, AngⅡ通过膜表面G蛋白偶联Ⅰ型受体和肌醇磷脂系统激活PKC-Zeta, 随后通过某种途径向核内传递, 诱导立早型原癌基因的一过性表达, 进而调控细胞的生长和分裂。而生长因子通过膜上具有蛋白酪氨酸激酶活性的生长因子受体, 激活胞浆RAS激酶, 再通过Ras-Raf通路介导生长因子的促分裂信号。因此阻断Ras-Raf通路可取消生长因子的促分裂作用, 但不影响AngⅡ的效应; 而下调PKC-zeta可阻断AngⅡ的促生长效应, 但不影响生长因子的作用^［4］。 问题是, 为什么胞浆头端信号通路不同的两种活性物质能“聚合”产生性质相同的最终细胞效应FB增殖？
　　MAPK级联反应(多步骤的磷酸化级联反应)是源自多种膜受体传导的生长信号越核膜传递的交汇点或最后共同通路^［5］。本文观察到, AngⅡ或EGF, 在刺激FB分裂情况下, 均出现MAPK的激活; 而MAPK反义ODN片段, 在消除MAPK蛋白表达的同时, 无论是AngⅡ或 是EGF诱导的FB分裂反应均受到明显抑制。这项结果支持MAPK是生长分裂信号通路“聚合点”的观点。换言之, 不同受体和信号通路介导的生长信号均通过MAPK级联反应向核内传递, 进而诱导相同的基因表达程序, 是不同丝裂原产生相同生物学效应的原因。
　　血管活性肽和生长因子对MAPK的激活是双相性的, 包括急速短暂的瞬时高峰时相和随后长达150 min左右的低平持续相。在VSMC, AngⅡ在2～5 min内即可促使MAPK活性迅速升高并达峰值^［9］, 而生长因子启动的瞬时峰相稍后于血管活性肽^［3］。从AngⅡ刺激的时效曲线可知, MAPK激活在5 min时达高峰, 随后时相呈低水平, 与文献报道一致。本文AngⅡ 处理FB 5 min, EGF处理10 min, FB MAPK活性明显比基础值增高2倍或3倍, MAPK蛋白磷酸化也大幅增加, 表明这两种活性物质可以迅速激活MAPK。
　　MAPK存在多个同型体。Boulton等^［13］报道人类心脏组织存在4种密切相关的MAPK同型体P⁴⁰, P⁴¹/42, P⁴⁴和P⁶³。另一些作者采用免疫印迹法在培养大鼠VSMC、 新生大鼠心肌细胞^［12］和心肌FB^［9］标本上均观察到可被AngⅡ, ET 和PE (phenylephrin)等激动剂刺激的两种同型体-P⁴⁴MAPK和P⁴²MAPK。本文也显示培养新生大鼠心肌FB有P⁴⁴和P⁴²两个同型体, 而且进一步表明这两个同型体不仅接受AngⅡ的刺激, 而且生长因子EGF也可刺激两个同型体蛋白的磷酸化明显增高。
　　反义ODN路线不但是研究细胞生物学信号传导机制的一项生物高技术, 而且近年已有不少临床资料证明它对细胞生长分裂异常性疾病也具有显著的治疗效果^［7］。有许多研究资料表明, 核转录因子基因或细胞周期调节基因(如c-myc, c-myb, c-fos, cyclin等)的反义ODN对血管病理损伤(血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化等)时VSMC的分裂增殖反应有明显的抑制作用^［14］。但在心肌FB标本上研究反义ODN作用的报道极少。本文设计选择细胞生长信号传导通路中十分重要的信号分子MAPK作为反义ODN攻击的靶点。 结果表明, 0.2 μmol/L的MAPK反义ODN可以完全取消MAPK(两个同型体)蛋白表达进而抑制AngⅡ或EGF对MAPK蛋白磷酸化的刺激作用, 并对它们诱导的FB分裂反应产生明显的抑制效应。而正义ODN和随机ODN均不能抑制MAPK的表达, 也不能抑制FB分裂反应。表明反义ODN的抑制作用是序列特异性的。Glennon等在培养心肌细胞上也观察到MAPK的反义ODN在消除MAPK表达的同时, 产生抗心肌肥大的作用^［12］。本结果一方面进一步证明MAPK是AngⅡ和EGF两种丝裂原诱导的FB分裂反应的“共同”信号分子, 也提示反义MAPK ODN可能具有抗FB增殖进而抗心肌纤维化的药用前景。
　　另一方面, 本实验与其他报道相同, 正义ODN和随机ODN也有轻度抑制MAPK表达的作用, 这可能是ODN的一种非常复杂的“非反义效应”^［15］。此外, 脂质体包裹ODN可避免细胞内外环境中核酸酶对ODN的破坏和增加细胞摄取, 但脂质体本身表现出一定的抑制作用^［15］。深入研究ODN的非反义效应, 探讨更好的转染方法, 是反义技术的基础和应用研究中须进一步探讨的问题。

^*国家自然科学基金资助项目 (NO.39700176)
^**湖南医科大学分子药理研究室生理学报，1999年8月，51（4），397～406
作者单位:湖南医科大学心血管生理研究室, 长沙　410078^*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39700176)
^**Laboratory of Molecular Pharmacology, Hunan Medical University; Changsha 410078406

参　考　文　献

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1998-07-20收稿　　1998-10-12修回