内皮素-1前体基因反义寡核苷酸对
正常和高血压大鼠血流动力学的影响

杜云鹏　胡清华　王建枝　王迪浔

摘　要　　我们筛选出针对内皮素-1(ET-1)前体基因反义硫代寡核苷酸片断(ETASODN), 已证明ETASODN能显著抑制培养内皮细胞ET-1的生成(P<0.05)。本实验应用该片断, 对正常和腹主动脉狭窄-高盐摄入型高血压大鼠侧脑室进行注射, 记录注射前后血流动力学指标、注射后侧脑室周围组织中ET-1的含量及分布, 观察ETASODN对正常和高血压大鼠的影响, 发现高血压大鼠脑干ET-1含量明显高于正常大鼠(P<0.05); ETASODN能降低高血压大鼠脑干ET-1水平(P<0.05)、平均动脉压(MAP)(P<0.01)、心率、左心室收缩压(P<0.05), 降低正常大鼠下丘脑ET-1水平、MAP (P<0.05); 注射ETASODN后, 大鼠高血压组△MAP显著低于正常组。结果表明: ETASODN能抑制大鼠部分心血管中枢ET-1的生成, 参与正常和腹主动脉狭窄-高盐摄入型高血压大鼠血压的中枢调节机制。
关键词: 高血压; 内皮素-1; 反义寡核苷酸; 脑室注射
学科分类号: Q463; R544.1

EFFECT OF ET-1 ANTISENSE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE
ON THE HEMODYNAMICS OF NORMAL AND
EXPERIMENTAL HYPERTENSIVE RATS

DU　YUN-PENG, 　HU　QING-HUA, 　WANG　JIAN-ZHI, 　WANG　DI-XUN
(Department of Pathophysiology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)

ABSTRACT:It was previously found that a phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotide (ETASODN) significantly inhibits production of endothelin-1 (ET-1). The purpose of the present study was to determine whether intracerebroventricular injection of ETASODN targeted to prepro-ET-1 is capable of exerting the same preventing effect on the aorta narrowing of experimentally modeled hypertensive rats. Radioimmunoassay showed that ET-1 level in the brain stem of hypertensive rats was significantly elevated. In addition to down-regulating the ET-1 level, astisense could also reduce mean arterial pressure (MAP), heart rate and LVSP in model rats. The antisense also down-regulated the ET-1 level in hypothalamus and brain stem, reducing MAP in normal control rats. After treatment with the antisense, the value of △MAP was markedly lowered in experimental hypertensive rats as compared to the control ones. Thus it appears that (1) ET-1 might play an important role in central cardiovascular regulation in rats and (2) antisense ETASODN might be used in treatment of hypertension via inhibiting ET-1 production.
Key words: hypertension; endothelin-1; DNA antisense; intracerebroventricular injection

　　内皮素(ET)是近年发现的一种血管活性多肽, 是目前所知作用最强的长效血管收缩因子^［1］。最近研究发现, ET广泛存在于中枢神经系统, 尤其是ET-1, 作为一种新的神经多肽, 参与血压的调节和心血管疾病的发病机制^［2,3］。反义寡核苷酸(ETASODN)是根据碱基互补原理设计的与目标靶遗传物质(DNA或RNA)特定互补的短核苷酸片段, 可封闭某个靶基因的表达, 治疗与该基因有关的疾病。我室设计了针对ET-1前体基因的反义硫代寡核苷酸, 它可抑制培养的内皮细胞生成ET-1。为了进一步研究该片段在体内的作用, 本实验观察了侧脑室注射该片段对正常和腹主动脉狭窄-高盐摄入型高血压大鼠血流动力学及中枢部分脑区ET-1含量变化的影响。

1　材料和方法

1.1　ETASODN的设计合成及修饰　　针对猪和人ET-1前体基因cDNA(负6至9位), 设计硫代修饰的互补反义寡核酸片段, 序列为5′-ATAATCCATTCTGAA-3′(分子量4867.5), 由上海生工生物工程公司用美国PE公司391型DNA自动合成仪合成, PAGE纯化, 紫外分光定量。在上述硫代ETASODN的5′端连接异硫氰酸荧光素, 即为荧光标记的ETASODN。
1.2　腹主动脉狭窄-高盐摄入高血压大鼠模型的复制　　雄性Wistar大鼠, 体重250～300 g, 按Anderson PG方法复制高血压模型^［4］: 乙醚麻醉, 严格无菌下行腹正中切口, 于左肾动脉上方用4号丝线将腹主动脉和8号针头结扎, 抽去针头造成动脉狭窄。用常规饲料、1%盐水饲养30 d。假手术组(对照组)动物只切开缝合腹壁, 不结扎动脉, 常规饮食。
1.3　侧脑室注射及血流动力学实验　　按上述方法复制模型30 d后, 在乙醚麻醉下行颈动脉插管, 连接换能器(CY-BK型), 用生理多道记录仪(日本光电公司)记录平均动脉压(MAP), 然后导管逆行插入左心室, 记录左室压和左室压微分值, 用同步记录心电图计算心率(HR), 退出导管, 结扎颈动脉, 缝合皮肤。术后20 min, 选MAP大于20 kPa大鼠各8例, 乙醚麻醉, 经脑立体定位仪按Konig Klippel图谱将外径0.8 mm不锈钢导管插入侧脑室固定, 见透明脑脊液外流后, 插入与微量注射器相连的注药管, 2～5 min恒速注入ETASODN 10 μl(55 μg, 治疗组), 或生理盐水(NS)10 μl(高血压对照组), 10 min后抽出导管, 缝合头皮。饲养48 h后, 在乙醚麻醉下, 于前次结扎的颈总动脉向心端插管, 并记录上述指标。正常大鼠对照组(各7例)的处理均同高血压组, 另取正常大鼠和高血压大鼠, 侧脑室注射荧光素标记ETASODN 10 μl (55 μg), 1 h后处死, 取注射附近脑组织作冰冻切片, 荧光显微镜观察ETASODN的分布和细胞摄取。
1.4　ET-1含量的测定　　取颅内注射后48 h的大鼠脑组织, 分离下丘脑、脑干和小脑, 称重后(125±5 mg)置EP管于－80℃保存, ET-1含量的测定采用放免法(北京邦定公司), 其中ET-AB为抗人ET抗体。
1.5　统计分析　　实验结果以表示, 以方差分析, 组间t检验及直线相关分析作统计学处理。

2　结果

2.1　高血压大鼠与假手术大鼠的血压变化
　　大鼠腹主动脉狭窄-高盐摄入30 d后发生严重高血压, MAP=22.53±0.38 kPa (n=16), 假手术大鼠MAP=13.25±0.27 kPa (n=14), 两者相比, 差异显著(P<0.001)。
2.2　ETASODN对正常和高血压大鼠血流动力学的影响
　　ETASODN颅内注射, 注射后与注射前相比, 正常大鼠MAP略有降低, 但无显著差异, 高血压大鼠MAP显著降低(P<0.01); 注射后高血压大鼠MAP与正常大鼠相比, 有非常显著性差异(P<0.01) (图1)。血压变化值△MAP=MAP1－MAP2, 其中MAP1为注射后48 h的血压, MAP2为注射前的血压。正常大鼠ETASODN组与NS组相比, △MAP显著降低(P<0.05), 其余各指标无显著性差异; 高血压大鼠ETASODN组与NS组相比, △MAP非常显著降低(P<0.01), △HR和和△LVSP显著降低(P<0.05), 注射ETASODN后高血压组与正常组相比, △MAP(P<0.05)显著降低(P<0.01), 其余无显著性差异(表1)。

图　1　　侧脑室注射ETASODN对正常和高血压大鼠MAP的影响
Fig.1　Effects of ETASODN icv on the MAP in normal and hypertensive rats
～^*　*　P<0.01, compared with pre-icv group. ～^△△　P<0.01, compared with normal group.

表 1　侧脑室注射ETASODN 对正常和高血压大鼠血流动力学的影响
Table 1　Effects of ETASODN icv on the changes in hemodynamics of the normal and hypertensive rats (mean±SE)

	Normal group		Hypertensive group
	NS (n=7)	ETASODN (n=7)	NS (n=8)	ETASODN (n=8)
△MAP (kPa)	0.08±0.43	－1.05±0.24^*	－0.58±0.55	－4.87±0.59^**
△HR (beat/min)	5.14±5.17	－3.71±5.36	－3.63±3.71	－18.88±5.51^*
△LVSP (kPa)	0.55±0.79	－0.48±0.75	－0.38±0.65	－5.52±0.92^*
△dP/dtmax(kPa/s)	－3.81±20.09	－21.91±7.08	－15±13.14	－58.33±18.51
△－dP/dtmax(kPa/s)	－6.68±18.79	－17.14±14.76	－6.33±14.19	－36.67±21.93

^*P<0.05,^**P<0.01, compared with NS group; P<0.05, compared with normal group.
2.3　各脑区ET-1含量的变化
　　ET-1标准曲线的相关系数和回归方程分别为r=－0.9897; Y=3.7612－0.76X。正常大鼠ETASODN组与NS组相比, 下丘脑和脑干ET-1含量均显著降低(P<0.05), 小脑含量无差异; 高血压大鼠ETASODN组与NS组相比, 脑干含量显著降低(P<0.05), 下丘脑和小脑含量无差异; 注射NS后, 高血压大鼠脑干ET-1含量显著高于正常组(P<0.05), 下丘脑和小脑含量无差异(表2)。

表 2　下丘脑、脑干和小脑ET-1含量的变化
Table 2　Changes in ET-1 levels in specific brain regions (pg/mg wet weight, mean±SE)

	n	Control group		Hypertensive group
		NS	ETASODN	NS	ETASODN
Hypothalamus	6	8.68±0.59	2.79±0.2^*	10.15±1.68	10.01±1.2
Brain stems	6	22.63±1.13	16.65±0.67^*	27.46±0.39^**	17.5±0.06^*
Cerebellum	6	5.53±0.6	5.51±0.59	5.57±0.46	5.37±0.73

～^*P<0.05, compared with NS group; ～^?P<0.05, compared with normal group.
2.4　脑室周围荧光素标记ETASODN的分布
　　正常和高血压大鼠侧脑室注射荧光素标记ETASODN后, 注射区和脑室周围均有广泛的ETASODN分布, 在注射区较远处有散在分布, ETASODN主要分布在神经细胞内(图2)。

图　2　侧脑室注射荧光素标记ASODN脑室周围ASODN的分布
Fig.2　Distribution of pho～spho～roth～ioated fluorescein-conjugated ASODN (55 μg) 1 h after icv injection
Scale bar: 100 μm.

3　讨论

　　近10年来, ETASODN作为基因治疗药物, 在临床应用方面已取得重大进展, 目前已有数种反义药物进入Ⅱ期临床应用阶段。经过特定修饰的ETASODN(如硫代修饰)具有较强的抗核酸酶活性, 同时对细胞膜的穿透力增强, ETASODN进入细胞后, 可从基因转录和/或剪切、翻译等多个环节特异阻断目标基因的表达^［5］。目前多种动物种属和人的内皮素前体基因已克隆成功, 其中人、猪和大鼠的内皮素前体基因cDNA有高度同源性^［6,7］。本室筛选的硫代型ETASODN, 12 μmol/L 时能显著抑制培养细胞ET-1的产生, 无细胞毒性。在脑脊液(CSF)中, 核酸酶含量和活性均明显低于血浆, 100 μmol/L ETASODN才产生细胞毒性^［8］。本实验注入10 μl (55 μg)ETASODN, 由于大鼠CSF总量约为1 ml, 因此ETASODN的浓度为11.3 μmol/L, 不会产生细胞毒性, 同时针对ET-1的ETASODN经硫代修饰, 可较长时间保持稳定性和完整性。应用荧光素标记ETASODN显示硫代型ETASODN能迅速穿透细胞膜, 在细胞内发挥作用。
　　腹主动脉-高盐摄入能复制大鼠实验性高血压, 血浆和中枢ET-1含量明显改变^［4］, 正常大鼠中枢ET-1含量与心血管功能明显相关^［9］, 提示中枢ET-1参与正常和高血压大鼠心血管功能的调节。研究发现, 在中枢神经系统, ET-1有3/4分布于神经细胞, 并与降钙素基因相关肽(cGRP)共存于运动神经元, 与P物质(SP)共存于感觉神经元。侧脑室注射ET-1, 大鼠MAP、肾交感神经活性、血浆儿茶酚胺(CA)、血管加压素(AVP)的水平均呈剂量依赖性增加, 可被酚妥拉明和AVP受体阻断剂(TMeAVP)消除, ET-1受体拮抗剂FR139317亦能在中枢阻断ET-1的上述作用^［9,10］。关于ET-1的中枢机制, 目前认为是其作用于ETA受体, 升高交感调节神经元内Ca²⁺浓度, 增强交感活性, 使MAP和血浆CA水平升高, 同时ET-1刺激神经垂体, 使AVP释放增多, 共同发挥生理病理作用^［11］。
　　在本实验大鼠中枢注入NS后, 高血压大鼠脑干ET-1含量明显高于正常大鼠, 提示ET-1参与大鼠高血压的形成和发展; 注入ETASODN后, 高血压大鼠脑干ET-1含量显著降低, 并与正常大鼠ETASODN组无差异, 高血压大鼠ETASODN组的MAP、HR、LVSP亦显著降低, 其中MAP显著低于正常大鼠ETASODN组, 提示CSF中ETASODN通过抑制中枢ET-1生成, 对高血压大鼠具有治疗作用; 注入ETASODN后正常大鼠MAP脑干和下丘脑ET-1含量均显著降低, 提示ET-1也参与心血管中枢的正常调节^［12］, ETASODN通过抑制ET-1生成, 产生一定的影响。各组小脑ET-1含量均未改变, 可能因剂量、时间等因素未发挥作用, 高血压大鼠下丘脑ET-1含量未改变的机制不清, 尚有待研究。
　　总之, ETASODN可以抑制中枢ET-1的生成, 影响正常和高血压大鼠心血管的中枢调节, 并引起血流动力学的改变。本实验对分析研究针对ET-1前体基因的ETASODN提供了有益参考, 为内皮素相关疾病的防治提供基因治疗的新途径。

作者单位:同济医科大学病理生理学教研室, 武汉 430030

参　考　文　献

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1998-09-30收稿　　1998-12-04修回