血管活性肠肽、表皮生长因子上调
支气管上皮细胞bcl-2基因表达^*

秦晓群　孙秀泓　罗自强

摘　要　　为探索肺内调节肽血管活性肠肽(VIP)和表皮生长因子(EGF)抗氧化保护的基因机制, 用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及Southern blot杂交等方法检测原代培养的兔支气管上皮细胞(BEC)内bcl-2和c-myc基因的表达情况, 观察VIP、EGF及热应激对这两个基因表达的影响。结果显示:(1)基础情况下BEC内有bcl-2和c-myc基因的低水平表达; (2) EGF和VIP均明显增强bcl-2和c-myc的转录, EGF的作用更强, 而热应激无明显效应;(3) bcl-2和c-myc两者的转录有显著相关性。上述结果提示, VIP和EGF等肺内调节肽可通过上调bcl-2基因表达增强支气管上皮细胞的抗氧化能力;c-myc基因的编码产物可能是bcl-2基因转录的上游调节因子。
关键词: 支气管上皮细胞; bcl-2基因; c-myc基因; 表皮生长因子; 血管活性肠肽
学科分类号: Q47; R332.2

　　血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是存在于局部气道上皮的肺内调节肽, 本实验室曾报道VIP、 EGF等可减轻臭氧对支气管上皮细胞的损伤^［1,2］, VIP的作用可被转录抑制剂放线菌素D或蛋白激酶C(PKC)阻断剂H7所阻抑, 提示其保护作用可能与细胞内某些抗氧化基因的表达有关。bcl-2 基因的编码蛋白能阻止膜成分的脂质过氧化, 可能参与气道局部的抗氧化保护。本文用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测兔支气管上皮细胞 (bronchial epithelial cells,BEC)原癌基因bcl-2的表达, 探讨VIP、 EGF 调控效应的基因机制。

1　材料和方法

1.1　主要试剂和仪器　　RPMI1640培养基、 VIP、 EGF (均为Sigma产品)、 总RNA提取试剂盒(陈泰公司)、 逆转录试剂盒(Promega)、 PCR扩增试剂盒(华美公司)、 ［γ-～³²P］ATP(原子能研究所)、 末端标记试剂盒(Promega); 电泳仪、 紫外透射凝胶数字照相及图形分析系统(Stratagene)、 PCR仪、 电转移仪、 杂交炉; bcl-2、 c-myc及GAPDH扩增引物及bcl-2寡核苷酸杂交探针等系从基因文库查找碱基序列自行设计或根据文献获得序列, 由上海费尔生物技术公司合成。
1.2　兔BEC的提取　　新西兰兔, 雌雄不拘, 体重1.5±0.3 kg。耳缘静脉注射25％氨基甲酸乙酯(1　g/kg)麻醉后股动脉放血处死, 取气管、 支气管, 以0.05%的胰蛋白酶37℃作用1 h后用乳胶刷刷洗, 收集上皮细胞。 用Hanks液 40 ml洗涤、 离心(1?000 r/min,　5 min)3次。1640培养液悬浮细胞成5×10⁶ cell/ml, 涂片用角蛋白单抗免疫细胞化学及电镜鉴定为支气管上皮细胞, H-E染色, 光镜下计数细胞纯度(91±2)％, 台盼蓝排斥法计数细胞成活率(83±5)％。
1.3　细胞的预处理培养及总RNA的提取　　分组: (1)对照组; (2) VIP (10^－8 mol/L)预处理组; (3) EGF (1.6×10^－9 mol/L)预处理; (4)热应激组: 42℃热应激处理30 min。各组经预处理后, 在无血清1640培养液中于37℃饱和湿度空气中稳定孵育2 h。以一步法提取细胞总RNA, 紫外光测定总RNA量为1.8 μg/5×10⁶ cell, OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.77, RNA电泳显示5、 18、 28 S三条区带, 表明RNA无降解。
1.4　RT-PCR的扩增　　 (1)逆转录cDNA合成: 取RNA样品1 μg, 65℃温育5 min, 在逆转录体系中反应, 含AMV逆转录酶3 U、 rRNAsin 1 U、 dNTPs 1 mmol/L、 MgCl₂ 5 mmol/L、 Oligo(dT)1 μg、 缓冲液及水, 总体积 20 μl, 42℃反应60 min。 (2)PCR扩增条件: 逆转录产物 5 μl、 Taq酶3 U、 缓冲液、　4×dNTP 2.5 mmol/L、 引物40 pmol/L, 总体积50 μl, 95℃变性1 min, 55℃复性1 min, 72℃延伸1 min。 循环25次, 72℃保温 10 min, 产物置冰箱4℃保存。 (3)扩增引物: 设置磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内对照, 引物序列为: 上游5′-CC～AA～TA～TG～ATT～CCA～CCCATG-3′, 下游 5′-AG～GT～CCA～CC～ACT～GA CACGTT-3′, 产物长度为600 bp; bcl-2扩增引物序列: 上游5′-GTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′, 下游5′-CTT～CAG～AGA～CAG～CCA～GGAG-3′。 分别位于bcl-2基因的两个外显子编码区, 产物长度为212 bp, 起始于编码区第442位碱基^［3］。 c-myc扩增引物序列: 上游为5′-TTCTCTCCGTCCTCGGATTC-3′, 下游为5′-GTAG～TTG～TGC～TGAT～GTG～TGGA-3′, 产物长度为282 bp。 （4）扩增产物检测: 2%琼脂糖凝胶电泳, 紫外光检测电泳条带, 用PCR Marker作分子量参照, 用Stratagene eagleeye Ⅱ图像处理系统测量区带分子量及密度, 计算样品的bcl-2 区带或c-myc区带与GAPDH区带的密度百分比, 反映各基因mRNA的相对丰度。
1.5　Southern分子杂交　　为了进一步证实PCR产物电泳区带的特异性, 用寡核苷酸探针进行分子杂交。 (1) 将电泳后琼脂糖凝胶经碱变性处理后, 于0.5×TBE缓冲液中电转移至尼龙膜上, 将膜处理固定后密封, 于低温保存; (2) 将［r-^［32］P］ATP标记到bcl-2和GAPDH寡核苷酸探针未端, 37℃反应2 h。bcl-2的寡核苷酸探针碱基长度为19 base, 序列为5′-ATG～ACC～GAG～TAC～CTGA～ACC-3′, 起始于编码区第529位碱基, 位于第一外显子编码区及PCR 扩增产物的中段; (3) 将膜置于杂交炉中55℃预杂交2 h, 55℃杂交18 h, 先后于37℃、 42℃时用不同浓度的液体洗膜, 将膜与X光胶片在－40℃冰箱中放射自显影曝光10 d后, 显影冲洗。
1.6 统计方法　　数据用±s表示, 统计学处理用配伍组方差分析。

2　结果

2.1　BEC的bcl-2基因表达丰度
　　由bcl-2扩增产物的凝胶电泳(图1)可见, 内对照GAPDH在各处理组均有表达, bcl-2扩增产物电泳区带在210 bp位置, 与设计引物的理论值一致。各处理组bcl-2 表达的相对丰度依次为: 对照组18.74±8.81, EGF组35.94±18.90 (P<0.01), VIP组为25.07±6.20 (P<0.05), 热应激组20.29±5.92 (P>0.05)。表明EGF和VIP处理均能增强表达(图2)。PCR产物的Southern印迹杂交放射自显影结果也呈类似分布(图3)。

图　1　RT-PCR扩增支气管上皮细胞bcl-2 mRNA
的电泳分析
Fig.1　Electrophoresis analysis of bcl-2 mRNA
expressed in bronchial epithelial cells by
RT-PCR

图　2　血管活性肠肽、表皮生长因子等对支气管上皮细胞bcl-2基因转录的影响
Fig.2　Effects of vasoactive intestinal peptide and epidermal growth factor on bcl-2 gene transcription in bronchial epithelial cells
n=7. ～^*　*P<0.01, ～^*　P<0.05 vs control.

图　3　RT-PCR扩增的支气管上皮细胞bcl-2 cDNA产物的Southern杂交显影
Fig.3　Southern blot analysis of RT-PCR products (bcl-2 cDNA)from bronchial epithelial cells

2.2　BEC的c-myc基因表达丰度
　　由c-myc扩增产物凝胶电泳(图4)可见, c-myc区带在280 bp附近。 各组的丰度值为: 对照组19.06±3.97, EGF组32.93±7.88 (P<0.01), VIP组25.29±4.7 (P<0.05), 热应激组22.72±3.74 (P>0.05), 表明EGF或VIP预处理能增强c-myc基因表达(图5)。

图　4　RT-PCR扩增的支气管上皮细胞c-myc mRNA的电泳分析
Fig.4　Electrophoresis analysis of c-myc mRNA ex～pressed in bronchial epithelial cells by RT-PCR

图　5　血管活性肠肽及表皮生长因子等对支气管上皮细胞c-myc基因转录的影响
Fig.5　Effects of vasoactive intestinal peptide and epidermal growth factor on c-myc gene transcription in bronchial epithelial cells
n=5. ～^*　*　P<0.01, ～^*　P<0.05 vs control.

2.3　bcl-2与c-myc表达的相关性
　　各处理组的bcl-2与c-myc表达水平均呈平行变化, bcl-2与c-myc表达之间有显著相关性(r=0.98,P<0.01)。

3　讨论

　　细胞内原癌基因bcl-2与细胞的抗氧化损伤保护有关^［4］。由bcl-2 基因编码的Bcl-2蛋白是一种膜结合蛋白, 定位于线粒体、 内质网及核膜上, 参与清除活性氧, 阻抑膜脂质过氧化^［5］, 与细胞内的抗损伤自稳态有关。bcl-2属于低丰度表达基因, 仅在增生活跃的细胞有明显的转录, 在高度分化的正常组织细胞内难以检测到bcl-2 mRNA。本文用较为灵敏的RT-PCR技术,在正常的兔BEC检测到bcl-2基因的持续低水平表达。BEC属终末分化细胞, 上皮细胞的更新率不高^［6］, 经常受到局部理化因素刺激及生理性调节因子的作用, bcl-2基因的持续低水平表达, 可能是BEC的一种适应性反应。
　　已证实VIP、 EGF及热应激^［7］可增强BEC的抗氧化能力, 其保护机制与促进谷胱甘肽(GSH)合成及清除活性氧有关。EGF可促进粘膜或上皮修复, 有报道提到 EGF可加速外源性GSH向细胞内转运^［8］, 与细胞的抗氧化有关。本组曾观察到EGF对BEC的保护是由于促进GSH合成提高了细胞的抗氧化能力^［2］, 但EGF保护作用的基因机制尚未阐明。关于VIP对气道上皮的生物学效应研究报道甚少。本研究证实EGF和VIP均对bcl-2基因表达有较强的促进作用, 通过合成Bcl-2蛋白增强BEC的抗氧化能力。未观察到热应激对bcl-2 表达有明显影响, 热应激的保护作用可能通过诱导热休克蛋白等其它信号转导途径实现。
　　在细胞凋亡的基因控制中, bcl-2与c-myc表现协同作用^［9］。 本文观察到这两者的转录强度呈同步变化。c-myc基因的表达产物为DNA结合蛋白, 可充当转录调节因子。EGF的细胞内信号转导是通过酪氨酸激酶途径, VIP则可激活cAMP-PK系统。 由这两条不同途径生成的第二信使物质均可激活快速反应基因c-myc, 其编码产物c-Myc蛋白作为第三信使(反式作用因子)调控bcl-2的转录水平。EGF和VIP是经常性存在于气道上皮的生长因子和神经肽, 两者都可经自分泌和旁分泌对气道上皮细胞发挥调控作用, 是保持气道上皮完整性、 维持气道局部微环境稳态的重要保护机制。

^*国家自然科学基金资助课题 (No.39400108)生理学报, 1999年8月, 51(4), 419～424
作者单位:湖南医科大学生理学教研室, 长沙 410078

参　考　文　献

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1998-07-26收稿　　1998-09-10修回