褪黑素对大鼠海马神经元
谷氨酸所致毒性的拮抗作用

高鸿翔　张烈雄

摘　要　　在大鼠海马脑片上电刺激Schaffer侧支纤维, 胞外记录CA1区锥体细胞层诱发群体锋电位(population spike, PS), 观察灌流谷氨酸(Glu)和褪黑素(MEL)对PS的影响。 结果显示: 5.0 mmol/L浓度的Glu可使PS值下降至对照值的4.1%; MEL (0.4、0.5 和0.6 μmol/L)与5.0 mmol/L Glu混合给药, PS值分别变化为对照值的14.7%、105.2%、24.3%; MEL (0.5 μmol/L)、Glu (5.0 mmol/L), 与赛庚啶(CDP, 0.5 μmol/L)混合给药, PS值下降至0。上述结果提示, 5.0 mmol/L浓度的Glu有神经毒性作用, 但可为MEL拮抗, 这可能由5-HT受体所介导。
关键词: 谷氨酸(Glu); 神经毒性; 褪黑素(MEL); 大鼠海马脑片; 群体诱发锋电位(PS)
学科分类号: R338

ANTAGONISTIC EFFECTS OF MELATONIN ON
GLUTAMATE-INDUCED NEUROTOXICITY IN
RAT HIPPOCAMPAL NEURONS

GAO　HONG-XIANG，　ZHANG　LIE-XIONG
(Departerment of Biology, East China Normal University, Shanghai 200062)

ABSTRACT:The effects of glutamate (Glu) and melatonin (MEL) on the evoked populaion spike (PS) following stimulation of the schaffer collateral fiber were studied by extracellular recording technique in perfused slices of rat hippocampus: 5.0 mmol/L Glu decreased the PS peak values to 4.1% of control. This effect of Glu (5.0 mmol/L) on PS peak values was changed to 14.7%, 105.2% and 24.3% of control by 0.4, 0.5, 0.6 μmol/L of MEL. But when the interaction between MEL (0.5 μmol/L) and Glu (5.0 mmol/L) was entirely suppressed by CDP (0.5 μmol/L), the PS values reduced to zero. These results suggest that the inhibitory action of MEL on Glu-induced neurotoxicity may be mediated by 5-HT receptors.
Key words: glutamate; neurotoxicity; melatonin; hippocampus slice of rat; population spike

　　过量的谷氨酸(Glu)对神经元具有神经毒性作用, 且其神经毒性与多种神经系统疾病中的神经退化相关。褪黑激素(melatonin, MEL)由松果腺分泌, 其受体在脑内广泛分布^［1,2］, 药理剂量的MEL具有镇静、催眠、抗癫痫效应, 并影响学习与记忆过程^［3,4］; 而生理状态下, MEL可作为一种调质, 维持脑的内环境平衡^［5］。人和许多动物在衰老过程中, 体内MEL合成能力显著降低^［5］。以往研究证实, MEL可抑制大鼠海马脑片上Glu诱发的单位放电^［6］。本研究用电生理学方法, 在大鼠海马脑片上对诱发神经元群体锋电位进行胞外记录^［7］, 着重观察MEL对Glu神经毒性的影响, 并对其可能的机制进行了初步探讨。
　　人工脑脊液 (arificial cerebrospinal fluid, ACSF) 配方如下 (mmol): NaCl 124, KCl 5, NaH₂PO₃ 3, CaCl₂ 3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 23, 葡萄糖10, 上述药品均为分析纯; ACSF通入含95% O₂、 5% CO₂混合气体至饱和, pH 7.3～7.4。其他药品有: 褪黑激素(Sigma公司)、盐酸赛庚啶(CDP, 上海试剂厂)、谷氨酸(上海试剂厂)。上述药品均在临用前用ACSF配成所需浓度, 并以灌流方式给药40 min^［7］。
　　选用成年SD大鼠(150～250 g, 购自上海计划生育研究所实验动物中心, 雌雄兼用), 断头后小心取出脑干以上脑组织, 在1～4℃ ACSF中用振动切片机沿冠状切面切成500 μm厚的脑片。 从大鼠断头至切片结束在5 min内完成。 分离出海马脑片, 用ACSF孵育1 h后, 移至人工浴槽内进行记录。ACSF经蠕动泵恒速推动进入浴槽, 浸没脑片。孵育槽、人工浴槽内槽的温度均保持在(31±0.5)℃。玻璃微电极(灌充ACSF, 阻抗2～5 MΩ)插在CA1区的锥体细胞层做胞外记录。记录信号经微电极放大器和前置放大器放大后, 输入示波器以观察神经元电活动, 同时通过监听器监听, 并在同步触发器控制下将其与刺激触发信号一起输入电脑, 利用SMUP-PC生物信号处理系统的AVERAGE程序, 进行诱发群体锋电位叠加记录、储存和处理。不锈钢双极电极安置在Schaffer侧支部位, 进行顺向刺激。刺激频率0.5 Hz, 波宽0.1～0.4 ms, 幅度6～60 V不等, 以能产生最大幅度场电位为准。刺激每5 min一次, 电脑相应地对原始信号叠加记录、储存, 叠加10次作为一个数据, 记录完毕后停止刺激, 依此类推, 直到实验结束。
　　实验结果均取自状态良好的脑片, 共63片; PS潜伏期0.6～8.6 ms, 平均4.09±1.72 ms; PS幅值0.1～0.55 mV, 平均1.87±2.24 mV; 空白对照实验中, 不加药品而连续刺激70 min, 每5 min刺激1次, PS未发生明显变化。每一实验记录由10次叠加记录的基准活动期、40 min给药处理期和30 min的ACSF冲洗恢复期组成, 共16个数据。每一实验数据的群体锋电位幅度(PS值)均换算成与基准PS值(对照)相比的百分数, 以PS值百分比做数理统计和实验结果比较^［7］。实验结果如下:

1.　谷氨酸对大鼠海马脑片诱发群体锋电位的影响

　　对海马脑片分别给以不同浓度 (1.0、1.25、2.5和5.0 mmol/L) 的Glu连续灌流40 min。70 min末, PS值百分比分别为 (1560.5±1263.6)% (n=3)、(150.7±32.4)% (n=3)、(13.1±22.3)%(n=3)、(4.1±5.0)% (n=3) 。并且Glu浓度高时(2.5或5.0 mmol/L), PS值下降幅度在给药期前半段大, 后半段小; 恢复期末增加刺激强度均不能使PS值升高。

2.　褪黑素对大鼠海马脑片诱发群体锋电位的影响

　　不同浓度(0.4、0.5、0.6和0.7 μmol/L) MEL分别连续灌流40 min。PS值均有波动, 但70 min内波动幅度随浓度升高而变小, 70 min末PS值百分比分别为 (193.8±305.6)% (n=3)、(129±107.3)% (n=3)、(75.2±42.9)% (n=3, 恢复期末增大刺激强度, 则可恢复到100%)、(97.1±18.6)% (n=3)。

3.　褪黑素对谷氨酸神经毒性的影响

　　选用毒性浓度(5.0 mmol/L)的Glu分别与不同浓度的MEL(0.4、0.5和0.6 μmol/L)混合, 灌流给药40 min。PS值在给药早期都大幅度下降, 这与5 mmol/L Glu单独作用的变化相一致。第15 min左右开始发生形式各异的波动: 0.4 μmol/L MEL与5.0 mmol/L Glu联合作用(n=5)下PS值稍有恢复, 70 min末PS值百分比为 (14.7±8.6)%; 0.5 μmol/L MEL与5 mmol/L Glu联合作用(n=5)下, 停药后PS值上升, 70 min末PS值百分比为 (105.2±35.1)%, 表明Glu的神经毒性作用被MEL完全阻断; 0.6 μmol/L MEL与5.0 mmol/L Glu联合作用(n=5)下, PS值在停药后部分恢复, 70 min末PS值百分比为 (24.3±17.8)%。恢复期末增大刺激强度, 则只有0.6 μmol/L MEL与5 mmol/L Glu联合作用组PS值可恢复到100%(图1)。

图　1　褪黑素对谷氨酸神经毒性的影响
Fig.1　Effects of MEL on the neurotoxicity of Glu

4.　褪黑素对谷氨酸神经毒性的抑制作用能被赛庚啶所阻断

　　将0.5 μmol/L CDP、5.0 mmol/L Glu和0.5 μmol/L MEL混合, 灌流给药(n=5)40 min。PS值逐渐下降至0±0, 停药后不再恢复, 表明完全阻断了MEL对谷氨酸神经毒性的阻遏作用(图2)。 但是在海马另一区域以同样方式给药, PS值逐渐下降至零, 停药后可有所恢复, 70 min末PS值百分比为82%, CDP未能阻断MEL对谷氨酸神经毒性的阻遏作用。

图　2　褪黑素对谷氨酸神经毒性的抑制作用被赛庚啶所阻断
Fig.2　Blockage of the inhibition of MEL to the neurotoxicity of Glu by CDP

　　本实验结果表明, 高浓度(2.5、5.0 mmol/L) Glu可对海马神经元产生神经毒性作用, 并且损伤是不可逆的^［7］, 损伤程度随Glu浓度升高而加重。 以往的工作证实, MEL对大鼠海马锥体细胞的自发放电具有明显的抑制作用^［6］, 外源性MEL可通过其自身受体或部分地通过激动5-HT受体而产生效应。在海马脑片上给以CDP, 可部分地阻断MEL对Glu诱发的神经元单位放电的抑制效应^［6］。 而本实验结果表明, MEL对海马锥体细胞有抑制和兴奋两方面影响, 并使细胞生理活性趋于稳定, 这说明MEL作用机制的复杂性有待进一步研究。
　　比较三个浓度(0.4、 0.5、 0.6 μmol/L), 可知MEL对Glu神经毒性的抑制作用发生在给药期的后半段。高浓度MEL (0.6 μmol/L)可抑制Glu神经毒性, 而且使神经元兴奋性降低, 表明恢复期末神经元可能并未完全恢复正常, MEL所引起的抑制效应在恢复期继续起作用。这一过程可能有利于Glu神经毒性引起的细胞功能紊乱得到进一步的改善和恢复。在以往研究中也已发现, 在Glu神经毒性产生时, 除了最初阶段非NMDA受体激活增多引起离子和水大量涌入胞内导致细胞发生可逆的快速肿胀, 及中后期胞内Ca²⁺和自由基异常增多导致延迟的不可逆细胞崩溃^［8～10］以外, 在胞内鸟苷酸环化酶(GC)被激活, cGMP增多, cAMP减少, 据认为这些可能是抗神经毒性损伤的自然保护机制^［8］, 并且cGMP本身是NMDA受体的竞争性拮抗剂, 对非NMDA受体无作用。而MEL对神经细胞功能的影响机制中包括抑制突触体对Ca²⁺的摄取^［4］, 引起cGMP合成增多和cAMP合成减少^［5］, 增强脑吡哆醛激酶的活性^［2,5］等多条途径。在本实验中, CDP (0.5 μmol/L)不能影响Glu神经毒性效应, 却能完全阻断MEL对Glu神经毒性的抑制作用, 而在海马的CA3区的相同实验中, CDP却不能阻断上述反应。这提示5-HT受体可能参与了MEL对Glu神经毒性的抑制作用过程, 但MEL对Glu神经毒性的抑制效应可能是MEL多种效应的共同结果, 并导致了MEL抑制作用的延迟。
　　最近有人证明, MEL能抑制神经元胞内淀粉样蛋白质的堆积, 从而延缓神经元的衰老和死亡^［11］。这与本实验的上述结果极其相似。也有人报道, 松果腺细胞膜上存在NMDA受体, NMDA受体的激活可能抑制MEL的合成^［12］, 阻碍松果腺对光照的节律性反应^［13］。这意味着, MEL的合成、脑细胞内环境中Glu含量变化、以及神经退化性疾病之间可能存在某种相关性, 而MEL除了目前可应用于治疗老年性失眠症外, 可能还有进一步扩大临床应用的价值。

作者单位:华东师范大学生物系生理学实验室, 上海 200062

参　考　文　献

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1998-06-02收稿　　1998-09-15修回