应激引起血压升高大鼠血管
升压素V₁受体mRNA水平改变^*

陆利民　汪　军^**　姚　泰

摘　要　　实验在雄性Sprague-Dawley大鼠上进行。 实验动物被随机分为对照组和应激组, 应激组大鼠每天给予电击足底结合噪声的应激刺激, 每日2次, 每次2 h。 应激组大鼠在接受连续15 d的慢性应激刺激后, 其尾动脉收缩压与对照动物相比有显著升高。 对照组为16.25±0.63 kPa (n=7); 应激组为19.55±1.45 kPa (n=8, P<0.05)。 用RT-PCR结合Southern印迹核酸分子杂交技术观察到, 血管升压素(vasopressin, AVP)V₁受体mRNA广泛存在于大鼠下丘脑、 皮质、 延髓等部位以及心脏、 肝脏、 肾脏等组织中。 用定量PCR方法观察到, 大鼠在接受慢性应激刺激之后, 其大脑顶叶皮质、 下丘脑及延髓组织中AVP V₁受体mRNA水平均显著低于正常大鼠(顶叶皮质: P<0.05; 下丘脑: P<0.01; 延髓: P<0.001), 而心脏、 肝脏及肾脏组织中的AVP V₁受体mRNA水平与正常大鼠相比均无明显差别(心脏: P>0.05; 肝脏: P>0.05; 肾脏: P>0.05)。 上述结果提示, 慢性应激刺激可引起大鼠不同部位脑组织AVP V₁受体合成水平下调, 可能导致上述部位组织中AVP V₁受体密度降低, 而对心脏、 肝脏及肾脏组织中的AVP V₁受体密度则无显著影响。
关键词: 血管升压素V₁受体; 应激; 高血压
学科分类号: Q463; R331.3

CHANGES IN VASOPRESSIN V₁ RECEPTOR mRNA
LEVEL IN RATS WITH HIGH BLOOD PRESSURE
INDUCED BY CHRONIC STRESS^?

LU　LI-MIN，　WANG　JUN^?　?，　YAO　TAI
(Department of Physiology and ～^*　*State Key Laboratory of Neurobiology,
Shanghai Medical University, Shanghai 200032)

ABSTRACT：Using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) combined with Southern blotting hybridization technique, the AVP V₁ receptor mRNA was found to be widely distributed in central neuronal system and other tissues of rats, such as cerebral cortex, hypothalamus, medulla, liver and kidney. The receptor mRNA levels in the cortex, hypothalamus and medulla were decreased significantly in chronically stressed rats, as compared with normal controls (cortex: P<0.05; hypothalamus: P<0.01; medulla: P<0.001). But no significant change was observed in tissues of heart, liver and kidney (heart: P>0.05; liver: P>0.05; kidney: P>0.05). These results suggest that chronic stress may lead to a decrease of AVP V₁ receptor density in the CNS as a result of decreased synthesis.
Key words: vasopressin V₁ receptor; stress; hypertension

　　环境因素对机体影响的研究已越来越多地受到人们的重视, 其中随着现代生活节奏的加快, 人长期处于紧张状态所造成的慢性紧张应激刺激对机体心血管系统的影响已成为一研究热点。 目前临床上心血管疾病的发病率呈上升趋势, 慢性紧张应激刺激被认为是导致高血压、　冠心病等心血管疾病发病率升高的重要因素。 研究结果表明, 应激刺激引起体内神经及多种体液因素的改变, 包括中枢神经肽(如阿片肽)、 神经递质(如乙酰胆碱)及外周肾上腺皮质激素等, 这些变化均参与应激对机体心血管活动功能的影响。 本实验室在过去几年中, 用噪声结合电刺激大鼠足底的手段建立了应激性高血压大鼠模型, 并对其发病机制进行研究^［1］。 实验结果证明, 给予大鼠慢性电击足底结合噪声的应激刺激可导致动物血压持续性地升高, 体内多种因素, 包括中枢乙酰胆碱、 肾上腺皮质激素以及血管紧张素Ⅱ等的改变都参与了应激刺激引起血压升高过程^［1,2］。 近来的研究观察到, 大鼠在接受电击足底结合噪声的应激刺激后, 下丘脑内血管升压素(vasopressin, AVP)的合成和释放有明显增加^［3］, 并通过中枢V₁受体参与应激引起机体血压升高过程。 AVP水平长期持续地改变, 可影响其相应受体密度^［4］。 本实验观察了大鼠接受慢性应激刺激后, 其不同组织中AVP V₁受体的变化。
　　实验动物及处理　　实验动物全部采用雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠, 由上海医科大学实验动物部提供。 动物随机分为对照组和刺激组。 刺激组动物每天给予电击足底结合噪声的刺激, 每天2次, 每次2 h。 刺激时, 将动物放在22 cm×22 cm×26 cm的笼内, 笼底由细的铜栅构成, 通过铜栅给大鼠足底以电脉冲刺激。 刺激脉冲由计算机控制, 每2～25 s之间随机发生一次, 刺激脉冲电压为50～100 V, 持续时间50 ms。 电刺激的同时, 由蜂鸣器发出噪声(80～100 dB, 时程50 ms)。 计算机产生的刺激形式分为两种, 一种为噪声+电击, 另一种为仅给予噪声刺激, 每次刺激的形式由计算机随机控制^［1］。 对照组动物在相同条件下饲养, 不给予任何刺激。 动物于清醒状态下用尾套法测大鼠尾动脉收缩压, 每次测量均在应激刺激停止2 h后进行。
　　动物组织RNA样品准备　　动物腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉后断头处死, 迅速取组织放入预先冰浴冷却的组织裂解液中, 用高速组织分散器打成匀浆, 用改良一步法分离组织总RNA^［5］。 分离得到的RNA经MOPS变性凝胶电泳鉴定, 两条rRNA条带清晰, OD260/OD280比值于1.8～2.0之间才用于以下实验。
　　寡聚核苷酸引物设计　　AVP V₁受体mRNA长1.3 kb, 实验设计下游引物primer-1与AVP V₁受体mRNA上第579～598位碱基互补, 其碱基顺序为: 5′-TAGT～GCC～ATTG～TTCAC～CTCG-3′, 上游引物与AVP V₁受体mRNA第1～21位碱基顺序一致, 其碱基顺序为: 5′-ATGAGTTTCCCGCGAGGCTCC-3′, 并设计引物primer-3其碱基顺序为: 5′-TACAT～CG～CC～G～TGTGC～CA～CCC-3′, 该引物与AVP V₁受体mRNA第444～463位碱基顺序一致, 经标记后, 作为寡聚核苷酸探针, 用于PCR产物的Southern鉴定。 上述引物均由美国Oligos ETC公司合成。 用primer-1和primer-2扩增AVP V₁受体基因所得DNA产物片段长应为598 bp^［6,7］。
　　逆转录合成cDNA　　取动物组织分离得到总RNA 10　μg, 加入AMV 20 U, dNTP (10 mmol/l dNTP each) 2 μl, PCR下游引物primer-1 20 pmol, 5×RT反应缓冲液4 μl, RNasin 30 U, 用DEPC处理水调节反应体系体积至20 μl, 混匀, 置于42℃水浴中保温15 min合成cDNA, 然后置于96℃水浴中3 min使酶灭活。
　　PCR扩增AVP V₁受体基因片段　　取逆转录产物2 μl, 分别加入Taq DNA多聚酶1 U, 10×反应缓冲液3 μl, primer-1 8 pmol, primer-2 10 pmol, dNTP (10 mmol/l dNTP each) 1 μl, 混匀后, 加入适量液体石蜡盖封, 经94℃预变性3 min, 然后94℃ 60 s, 60℃ 60 s, 72℃ 150 s, 扩增30个循环, 再在72℃延伸10 min。
　　RT-PCR扩增产物鉴定　　取PCR产物6 μl, 加1 μl电泳用载样缓冲液, 在2% agarose凝胶中电泳。电泳结果看到,从正常SD大鼠脑顶叶皮质、下丘脑、延髓及心脏、肝脏、肾脏组织中分离得到的RNA,经RT-PCR扩增后在约0.6 kb处均有一条特异性扩增条带(图1)。
　　如果在逆转录体系中不加入逆转录酶, 则PCR扩增产物在约0.6 kb处不能得到特异性扩增条带。 这一结果证实, 实验中0.6 kb DNA扩增片段为mRNA来源, 而非从染色体DNA扩增所得。
　　将PCR产物agarose凝胶电泳结果经Southern印迹转移到尼龙膜上, primer-3用DIG寡聚核苷酸3′末端标记试剂盒 (DIG Oligonucletide 3′-End Labeling Kit)进行3′末端DIG标记后, 作为探针, 对尼龙膜上DNA进行核酸分子杂交检测^［5］, 检测结果如图2所示。

图　1　不同组织来源RNA RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1　Electrophoretic result of PCR products in 2% agarose gel using RT product of RNA isolated from different tissues of rats as template
1. Kidney. 2. Liver. 3. Heart.
4. Medulla. 5. Hypothalamus. 6. Cortex. The expected DNA (size 0.6 kb) is indicated by arrow.

图　2　PCR扩增产物Southern印迹杂交结果
Fig.2　Sketch map showing the Southern blotting of the DNAs in agarose gel to nylon membrane

　　从图2可以看到, 在0.6 kb处均有杂交信号存在, 即0.6 kb DNA扩增片段为特异性AVP V₁受体基因扩增产物, 证实正常大鼠脑顶叶皮质、 下丘脑、 延髓、 心脏、 肝脏及肾脏6种组织来源的RNA中均有AVP V₁ 受体mRNA存在, 即有AVP V₁受体基因表达和AVP V₁受体分布。 本实验中所采用的RT-PCR条件是理想的, 能得到正确的AVP V₁受体mRNA扩增产物。
　　AVP V₁ 受体mRNA水平PCR定量分析　　本实验中采用的PCR定量方法是以单一碱基突变模板作为内标的PCR半定量分析方法。 具体做法与我们过去的报道相同^［10］, 其原理简述如下: 实验中用RT-PCR方法扩增得到AVP V₁受体基因片段, 用计算机对其序列进行限制性酶切谱分析, 观察到该序列中无EcoR Ⅰ酶切位点, 将此序列中第163位碱基A改为T后, 形成的突变模板中就引入了EcoR Ⅰ酶切位点, 这一突变模板AB^*经EcoR Ⅰ酶切后, 分成0.44 kb和0.16 kb两个片段, 而原始RT-PCR产物则不能被EcoR Ⅰ酶切。 在进行PCR定量分析时, 扩增体系中除加入RT产物外, 还加入一定浓度的突变模板AB^*进行同时扩增, 扩增产物经EcoR Ⅰ酶切后电泳, 根据电泳结果中被切开和未被切开产物的相对量的比较, 即可对组织中AVP V₁受体mRNA进行相对定量。 本实验中, 取RT产物2 μl, 加入突变模板约为2×10^－15 g。 图3为一组正常大鼠肝脏组织中AVP V₁受体mRNA水平PCR定量结果。

图　3　　定量PCR结果
Fig.3　Quantitative PCR result
From left to right, line 1: marker; lines 2～9: electrophoretic result of digested PCR products from template AB, AB^*, and AB^* (about 2×10^－15 g) was added into 2 μl reverse transcription products from total RNA isolated from hepatic tissue of rats.

　　用HP Vectra PC (80286)图像处理系统对图中0.44 kb和0.6 kb DNA片段进行光密度扫描, 求出条带的平均光密度和面积, 用平均光密度与面积的乘积代表电泳结果中0.44 kb和0.6 kb DNA相对含量, 用方差分析的统计方法, 分析各组间的差异是否具有显著性。
　　应激刺激对大鼠不同部位组织中AVP V₁ 受体mRNA水平的影响　　应激组大鼠在接受15 d电击足底结合噪声的应激刺激后, 用单碱基突变模板为内标的定量PCR方法观察到, 大鼠脑皮质、 下丘脑及延髓组织中AVP V₁ 受体mRNA水平均有显著下降。 皮质: 对照组为6.641±3.827 (n=6), 应激组为1.626±0.133 (n=5, P<0.05); 下丘脑: 对照组为2.380±0.232 (n=6), 应激组为1.789±0.286 (n=5, P<0.01); 延髓: 对照组为6.174±1.279 (n=6), 应激组为1.029±0.196 (n=6, P<0.001); 而心脏、 肝脏及肾脏组织中AVP V₁ 受体mRNA水平与对照组动物比较均无显著差别。 心脏: 对照组为7.241±1.886 (n=6), 应激组为7.824±3.857(n=6, P>0.05); 肝脏: 对照组为18.43±6.019 (n=6), 应激组为21.59±9.877 (n=5, P>0.05); 肾脏: 对照组为7.416±1.421 (n=6), 应激组为8.915±4.737 (n=6, P>0.05), 见图4。

图　4　　应激刺激对大鼠不同部位组织中AVP V₁ 受体mRNA水平的影响
Fig.4　Effects of stress stimulation on the AVP V₁ receptor mRNA level in different tissues of rats
^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001.

　　给予动物电击足底结合噪声的应激刺激时, 大鼠出现呼吸加深加快、 直立、 企图逃避等一系列紧张表现。 经过多次刺激后, 仅给予噪声刺激动物也会出现上述一系列反应。 15 d后, 应激组大鼠尾动脉血压为19.55±1.45 kPa (n=8), 显著高于对照组大鼠尾动脉血压水平(对照组16.25±0.63 kPa, n=7, P<0.05), 这一结果与我们过去观察到的结果一致, 即慢性紧张应激可引起大鼠血压出现持续升高。
　　本实验用RT-PCR的方法观察到, 在大鼠脑的顶叶皮质、 下丘脑、 延髓、 心脏、 肝脏及肾脏6种组织中均有AVP V₁ 受体mRNA存在, 证实上述6种组织均有AVP V₁ 受体分布。 在慢性应激引起血压显著升高的大鼠中, 用定量PCR的方法观察到大鼠在电击足底结合噪声的应激刺激后, 大鼠脑顶叶皮质、 下丘脑及延髓等不同部位脑组织中AVP V₁ 受体mRNA水平显著降低, 而心脏、 肝脏及肾脏组织中的AVP V₁ 受体mRNA水平则无明显改变。 上述结果提示, 慢性应激刺激可导致顶叶皮质、 下丘脑及延髓组织中的AVP V₁ 受体蛋白合成水平下调, 导致上述组织中AVP V₁ 受体密度下降。 而心脏、 肝脏及肾脏组织中AVP V₁ 受体的合成在应激之后则未出现明显改变。
　　大量的实验资料证实, 递质或激素水平的长期持续改变可引起受体密度及亲和力的改变。 在血管升压素的研究中也有报道, AVP水平长期持续改变后, 引起AVP受体密度发生改变。 如Steiner报道, 禁水使血浆AVP浓度持续高于正常水平之后, 肾脏组织AVP受体密度出现下调^［8］。 在对糖尿病大鼠的研究中也观察到, 由于血浆渗透压的升高, AVP血浆浓度持续高于正常, 随之出现AVP受体密度下调^［9］。
　　本实验中观察到, 大鼠接受慢性应激刺激之后, 中枢神经组织中AVP V₁ 受体出现下调, 而其他组织中AVP V₁ 受体并未出现明显改变, 我们推测这可能也与AVP水平的持续改变有关。 我们过去的研究曾观察到, 电击足底结合噪声的慢性应激刺激可引起大鼠下丘脑内AVP的合成及释放增加^［3］, 应激之后AVP的改变与应激引起大鼠血压升高有关, AVP的作用主要通过中枢V₁ 受体实现。 结合过去的研究结果, 我们推测, 应激引起AVP合成增加可能主要通过中枢神经系统发生作用, 应激刺激之后大鼠中枢神经组织中AVP水平出现持续高于正常, 导致中枢神经组织AVP V₁ 受体下调, AVP V₁ 受体mRNA水平下降。 而血浆中AVP水平并未出现明显改变, 这是否与其他组织AVP的改变不如中枢神经组织显著有关还有待进一步研究, 当然, 不能排除其它因素参与应激引起AVP V₁ 受体改变过程。

^*国家教育委员会博士点基金(No.1332104)和美国纽约中华医学基金会(No.90-527)资助项目生理学报，1999年8月，51（4），471～476
^*This study was supported by the State Education Commission of China (Grant 1332104) and the China Medical Board of New York (Grant 90-527).
作者单位：上海医科大学生理学教研室, ^**上海医科大学神经生物学国家重点实验室, 上海 200032

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1998-08-09收稿　　1998-11-15修回