应激抑制淋巴细胞转化的时间效应

邱一华　彭聿平　程　纯^?　戴　丽

摘　要　　本研究使用束缚方法使大鼠接受应激刺激, 然后分别取大鼠应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的淋巴结、脾脏提取物和血清, 与刀豆素A同时加入正常大鼠肠系膜淋巴结细胞悬液中孵育72 h后用噻唑蓝(MTT)比色分析法检测肠系膜淋巴结细胞的转化(以光密度OD值表示), 来观察应激抑制淋巴细胞转化作用的出现和消失过程。结果如下: (1) 应激3和6 h大鼠的淋巴结、脾脏提取物和血清对淋巴细胞的转化都没有明显的影响; (2) 应激12 h, 大鼠的淋巴结、脾脏提取物和血清都出现对淋巴细胞转化的明显抑制作用, 应激18 h的作用更强; (3) 淋巴结和脾脏提取物对淋巴细胞转化的抑制作用一直持续至束缚解除后96 h仍然较强, 但血清对淋巴细胞转化的抑制作用在束缚解除后逐渐减弱, 至96 h, 作用基本消失。上述结果说明, 大鼠束缚应激12 h以上, 其淋巴结、脾脏和血清同步出现对淋巴细胞转化的抑制作用; 这种抑制作用即使在束缚解除后仍能存在较长时间; 血清的抑制作用时间短于淋巴结和脾脏的抑制作用时间。结果提示, 束缚应激可引起淋巴组织产生一种能抑制免疫功能的应激免疫抑制蛋白(ISPS), 并释放到血液中, 对细胞免疫发挥较长时间的抑制作用。
关键词: 应激; 淋巴细胞转化; 细胞免疫; 神经免疫调节
学科分类号: R392

TIME EFFECT OF RESTRAINT STRESS-INDUCED
SUPPRESSION OF LYMPHOCYTE TRANSFORMATION

QIU　YI-HUA，　PENG　YU-PING，　CHENG　CHUN^*，　DAI　LI
(Department of Physiology and ～^*Department of Microbiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)

ABSTRACT：In the present study, restraint, which caused no direct tissue damage, was selected as a method of stress to investigate time effect of stress-induced suppression of lymphocyte transformation in rats. The lymph node and spleen extract or the serum from rats restrained for 3, 6, 12, 18 h or 12, 24, 48, 72, 96 h after restraint, with concanavalin A (Con A), was added to the lymphocyte suspension of rat mesenteric lymphnode and was ncubated for 72 h. The optical density (OD) value indicating the level of lymphocyte transformation was determined by colorimetric assay of methylthiazol tetrazolium bromide (MTT). The results are as follows. (1) The lymph node and spleen extract or the serum from the rats restrained for 3 or 6 h did not markedly affect the lymphocyte transformation. (2) The lymph node and spleen extract or the serum from the rats restrained for 12 h or 18 h significantly inhibited the lymphocyte transformation and stronger inhibition occurred at 18 h. (3) Up to 96 h after restraint, the suppressive effect of the lymph node or spleen extract on the lymphocyte transformation still existed, but the suppression of the serum on the lymphocyte transformation almost disappeared. These results suggest that the restraint of rats may cause lymphoid tissues to produce some immune suppressive protein of stress, which is released into blood leading to a generalized suppression of cellular immunity.
Key words: restraint stress; lymphocyte transformation; cellular immunity; neuroimmunomodulation

　　应激是机体遇到各种有害刺激, 如缺氧、创伤、手术、饥饿、疼痛、寒冷和精神紧张等时, 机体所作的一系列反应。应激刺激对机体免疫功能的影响十分显著, 包括对细胞免疫和体液免疫等的抑制^［1～3］。范少光实验室的研究表明, 小鼠或大鼠在束缚应激时, 由淋巴组织产生一种能抑制免疫功能的蛋白质(应激免疫抑制蛋白, immune suppressive protein of stress, ISPS), 释放到血液中, 可抑制由刀豆素 A(Con A)诱导的淋巴细胞转化^［4～6］。为进一步研究应激诱导的ISPS的出现和作用时间, 我们观察了大鼠束缚应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的淋巴结、脾脏提取物和血清对Con A诱导的淋巴细胞转化的影响。
　　实验用SD大鼠, 体重180～250 g, 雌雄兼用, 由本院实验动物中心提供。
　　细胞培养液为含10%灭活的新生小牛血清的RPMI 1640 (Gibco,美国)。Con A(Sigma, 美国)用生理盐水配成1 mg/ml。噻唑蓝(MTT,Fluka)溶解于生理盐水中, 配成5 mg/ml。
　　束缚应激方法　　用胶布将大鼠四肢绑在网架上, 强迫其仰卧位且不能动弹, 束缚时间根据实验要求而定, 最长为18 h。去除束缚后动物按常规饲养, 自由活动, 观察至96 h。对照组常规饲养, 自由活动, 不予惊动。
　　血清、肠系膜淋巴结和脾脏提取物的制备　　大鼠乙醚麻醉后, 置冰台上无菌抽取心脏血, 置于4℃ 6 h, 待血清析出后离心(3?000 r/min×30 min, 4℃), 取上清－20℃保存。同时无菌取出肠系膜淋巴结和脾脏, 称重按1∶10 (w∶v) 加入0.005 mol/L盐酸, 在冰浴中制成匀浆, 离心(3?000 r/min×30 min, 4℃), 取上清冷冻干燥, －20℃保存。使用时用细胞培养液复溶至原体积。
　　MTT比色分析法检测Con A诱导的淋巴细胞转化　　将Mosmann的方法^［7］略加改良。断头放血处死大鼠, 无菌取出肠系膜淋巴结, 制成单细胞悬液, 浓度为1×10⁶细胞/ml悬液。在悬液中加入有丝分裂原Con A (5 μg/ml), 然后取此悬液100 μl加入96孔细胞培养板中, 置CO₂细胞培养箱(ESPECBNA-311, 日本)内孵育(5% CO₂, 饱和湿度, 37℃)68 h。取出培养板, 在每孔中加入10 μl MTT溶液, 再置CO₂细胞培养箱内孵育4 h。在各孔中加入100 μl 0.04 mol/L HCl-异丙醇, 充分混匀, 静置数分钟, 用酶联免疫检测仪(DG3022, 华东电子管厂)选择波长570 nm, 测定各孔光密度(optical density, OD)值。
　　统计学处理　　每项实验的实验组动物数和对照组动物数均为9只。结果用配伍组试验的方差分析和q检验(Newman-Keuls法)比较各实验组与对照组的均数间差异有无显著意义, 凡P<0.05为有统计学显著性。
　　实验结果为:

1.　应激大鼠淋巴结提取物抑制淋巴细胞转化的时程观察

　　分别取束缚应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的大鼠淋巴结提取物加入正常大鼠肠系膜淋巴结细胞悬液中, 提取物与细胞培养液的浓度比为1∶640, 并加入Con A共同孵育。对照为同浓度的未应激大鼠的淋巴结提取物。束缚应激3、6、12、18 h和束缚解除后12、24、48、72、96 h的OD x±s分别为: 0.546±0.053; 0.542±0.044; 0.496±0.046; 0.464±0.057; 0.469±0.064; 0.462±0.059; 0.478±0.064; 0.479±0.058; 0.474±0.052。对照组为0.579±0.040 (见图1)。

图　1　应激大鼠淋巴结和脾脏提取物及血清抑制淋巴细胞转化的时程
Fig.1　Time course of suppressive effect of lymph node, spleen ex～tract and serum from stress rats on lymphocyte trans～for～mation
Each point is mean and standard error of OD value of 9 rats. In abscissa, “L” represents the duration after the restraint. ^**P<0.01, compared with the control.

2.　应激大鼠脾脏提取物抑制淋巴细胞转化的时程观察

　　分别取束缚应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的大鼠脾脏提取物加入到正常大鼠肠系膜淋巴结细胞悬液中, 其浓度比为1∶640, 并加入Con A共同孵育。对照为同浓度的未应激大鼠的脾脏提取物。结果如下: 束缚应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的OD x±s分别是0.522±0.052; 0.519±0.041; 0.478±0.059; 0.456±0.060; 0.460±0.052; 0.454±0.037; 0.460±0.044; 0.464±0.054; 0.461±0.056。对照为0.526±0.059 (见图1)。

3.　应激大鼠血清抑制淋巴细胞转化的时程观察

　　分别取束缚应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的大鼠血清加入正常大鼠肠系膜淋巴结细胞悬液中, 其浓度比为1∶16, 并加入Con A共同孵育。以同浓度的未应激大鼠的血清作为对照。束缚应激3、6、12、18 h和解除束缚后12、24、48、72、96 h的OD x±s分别为: 0.642±0.042; 0.648±0.035; 0.580±0.045; 0.544±0.043; 0.571±0.040; 0.576±0.052; 0.590±0.042; 0.580±0.048; 0.638±0.049。对照为0.661±0.049 (见图1)。
　　大鼠束缚应激是一种非创伤性应激的动物模型。范少光实验室首先发现, 小鼠或大鼠束缚10～20 h后, 其血清对由Con A诱导的淋巴细胞转化有明显的抑制^［4］。本研究结果与此相符, 提示非创伤性应激可抑制细胞免疫功能。 范少光等^［5,6］进一步研究发现, 在束缚应激时, 血清、肠系膜淋巴结和脾脏中出现一种具有一定耐热性和耐酸性, 其活性组分分子量为155和375 kD的蛋白质能抑制淋巴细胞的转化, 称为ISPS, 在脑和骨骼肌中没有发现。进一步证明了这种ISPS是在束缚应激时由淋巴组织产生后释放到血液中发挥作用的。
　　本研究表明, 大鼠束缚应激3和6 h的淋巴结、脾脏提取物和血清对淋巴细胞的转化都无明显的影响, 而束缚应激12 h的淋巴结、脾脏提取物和血清对淋巴细胞的转化都出现明显的抑制作用, 束缚应激18 h的抑制作用更强。说明淋巴结、脾脏提取物和血清抑制淋巴细胞转化作用的出现需要一定的时间, 且三种组织的作用出现基本同步, 作用效应基本相似。提示这种抑制作用是由束缚应激引起的, 有可能是淋巴结、脾脏和血清中同一种物质的作用。本工作从ISPS的产生部位和不同侧面, 证明了范少光实验室以前报道的结果。
　　我们给大鼠束缚18 h后解除束缚给予正常饲养, 观察至96 h, 发现淋巴结和脾脏提取物对淋巴细胞转化的抑制作用仍然存在, 且两者的时程曲线很相似, 在96 h内都处于相对稳定的抑制状态, 与束缚18 h的作用相比无明显差异。上述结果提示, 在去除应激源后的较长时间里, 淋巴组织仍有ISPS存在。但血清对淋巴细胞转化的抑制作用在束缚解除后逐渐减弱, 96 h后抑制作用基本消失, 而且血清引起与淋巴结、脾脏提取物基本相同程度的淋巴细胞转化抑制的浓度远比淋巴结和脾脏提取物的浓度高。说明血清与淋巴结、脾脏提取物的抑制作用的时程和效应是有区别的, 但这种差别的确切原因还不清楚。是否是淋巴组织产生的ISPS在解除束缚后释放入血液中的量逐渐减少, 以致在96 h后血清对淋巴细胞转化的抑制作用已基本消失。

　　本工作得到北京医科大学范少光教授的诸多指导, 特此诚谢。

作者单位：南通医学院生理学教研室, ～^*微生物学教研室, 南通 226001

参考文献

　［1］　Zalcman S, Anisman H. Acute and chronic stressor effects on the antibody response to sheep red blood cells. Pharmacol Biochem Behav, 1993, 46 (2): 445～452.
　［2］　Dhabhar FS, Miller AH, Stein M, et al. Diurnal and acute stress-induced changes in distribution of peripheral blood leukocyte subpopulations. Brain Behav Immun, 1994, 8 (1): 66～79.
　［3］　Fleshner M, Hermann J, Lockwood LL, et al. Stressed rats fail to expand the CD45RC+CD4+ (Th1-like) T cell subset in response to KLH: possible involvement of IFN-gamma. Brain Behav Immun, 1995, 9 (2): 101～112.
　［4］　Zha HB, Ding GF, Fan SG. Serum factor(s) induced by restraint stress in mice and rats suppresses lymphocyte proliferation. Brain Behav Immun, 1992, 6: 18～31.
　［5］　Fan SG, Gao S, Shao L, et al. A factor in lymph node and spleen induced by restraint stress in mice and rats suppresses lymphocyte proliferation. Neuroimmunomodulation, 1995 2: 274～281.
　［6］　Fan SG (范少光), Zha HB (查宏斌), Shao L (邵 黎), et al. A suppressive protein is generated in peripheral lymph tissue induced by restraint stress. Chin J Neuroimmun Neurol (中国神经免疫学和神经病学杂志), 1997, 4: 11～14 (in Chinese with English abstract).
　［7］　Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Meth, 1983, 65: 55～63.

1998-10-04收稿　　1998-12-07修回