大鼠肾上腺髓质儿茶酚胺分泌的在体伏安法测定

张春光　徐建军　陈宜张

摘　要: 　 应用碳纤微电极直接测定大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺浓度的在体伏安法。首次报道了大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺的基础浓度为0.1～0.5 μmol/L, 缺血时髓质中儿茶酚胺的浓度显著增加, 严重缺血时可达到5～30 μmol/L。肾上腺髓质能自发分泌儿茶酚胺, 缺血时自发分泌儿茶酚胺的幅度和频率都大大增加, 提示缺血对大鼠是一种强烈的应激。测定结果还表明, 乙酰胆碱能剂量依赖性地刺激肾上腺髓质嗜铬细胞分泌儿茶酚胺。
关键词: 在体伏安法; 碳纤电极; 肾上腺髓质; 儿茶酚胺
学科分类号: Q454; R657.1

Determination of catecholamine secreted from
rat adrenal medulla by in vivo voltammetry

ZHANG Chun-Guang, XU Jian-Jun, CHEN Yi-Zhang
(Departments of Physiology and The Second Military Medical University, Shanghai 200433)
CHEN Yi-Zhang
(Neurobiology, The Second Military Medical University, Shanghai 200433)

Abstract: 　 In vivo voltammetry using carbon fiber electrodes was employed to determine the catecholamine secreted from the adrenal medulla. The basal level of catecholamine in the medulla was between 0.1 and 0.5 μmol/L, but it increased markedly up to 5～30 μmol/L when the gland was made ischemic. The spontaneous release of catecholamine from the medulla was observed in both normal and ischemia conditions, but the frequency and amplitude of spontaneous release were increased significantly by ischemia. This implied that the animal was under serious stress condition. The above results also show that acetylcholine can induce the secretion of catecholamine in a dose-dependent manner.
Key words: in vivo voltammetry; carbon fiber electrode; adrenal medulla; catecholamine

　　肾上腺髓质激素中的儿茶酚胺是一种重要的内分泌激素, 它可帮助动物应付各种紧急情况。血液和尿液中儿茶酚胺的测定是临床上鉴定嗜铬细胞肿瘤以及其它疾病的常用方法, 因此绝大多数文献都集中在血液和尿液中儿茶酚胺的测定^［1］。也有用离体灌流和微透析方法进行测定的^［2］, 但肾上腺髓质中儿茶酚胺浓度的在体直接测定未见报道。伏安法用于大鼠中枢神经系统单胺类递质及其代谢物的测定已有20多年的历史^［3］。它在研究中枢神经系统中单胺类递质的分泌和摄取方面取得了丰富的成果^［4,5］。近10年来, 碳纤电极伏安法在单个细胞胞吐机制的研究中得到迅速的发展并取得了非常的成功^［6］。尽管伏安法以其在体测定的优越性^［4,5］以及很高的时间^［6］和空间分辨能力^［7］在中枢神经系统和和单个细胞胞吐研究中发挥了重大作用^［4,8］, 却很少有人将这些优点用于肾上腺髓质中儿茶酚胺的测定。因此, 本文的目的就是用在体伏安法测定大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺的基础浓度以及缺血和外源性乙酰胆碱(ACh)对分泌的影响。
　　实验用雌性Sprague-Dawley大鼠 (250～300 g)。 腹腔注射氨基甲酸乙酯 (1.5 g/kg)麻醉。 气管插管。沿正中线打开腹腔(3～4 cm), 腹主动脉插管, 管口靠近肾动脉开口处。小心游离左侧肾上腺, 确保肾上腺动静脉完整。轻轻将腺体抬高, 挂在特殊固定架的双钩上, 使之不随呼吸而移动并确保血液供应。适当增加血管张力即可使肾上腺处于缺血状态。从腹主动脉给予ACh, 生理盐水对照。实验室温度保持在25±2℃。
　　碳纤维电极的制作方法与Wightman等人报道的类似^［9］。本文方法是: 将长为2～3 cm的碳纤维(直径7 μm, Goodfellow Co. England)吸入长约5 cm的GG17玻璃毛细管(中国科学院上海生理研究所科达生物技术有限公司)的一端, 将该端朝上安装在微电极拉制仪(Narishige Scientific Instrumental Lab, Japan)上使加热电阻丝位于碳纤维的上半段, 即可拉出玻璃密封和绝缘的碳纤维电极。最佳加热电流为11 A, 拉力为自身重力。在玻璃毛细管中填充石墨粉, 插入细铜丝作导线, 用环氧树脂将导线和毛细管固定。 最后用手术刀将伸出毛细管尖端的碳纤维切短, 使其长度为100～200 μm。
　　髓质中儿茶酚胺的测定采用微电极在体伏安法^［10］。将碳纤维电极固定在江湾I型C立体定向仪(上海第二军医大学)上, 调节电极尖端位置, 对准腺体中心, 直至插入到肾上腺髓质中央。将甘汞参比电极和铂丝辅助电极放置在大鼠的腹腔中。通过循环伏安仪(中国科学院上海原子核研究所)在碳纤维工作电极上施加一定的电压。当电极探头周围存在容易被氧化的物质（如儿茶酚胺）时, 这些物质就能通过扩散接近电极表面并失去电子, 产生法拉第电流, 经循环伏安仪的电流放大器放大后输出到XYT记录仪(上海大华仪表厂), 就能检测到这些物质的电流信号。本实验根据不同实验目的, 采用不同的伏安技术来测定髓质中儿茶酚胺的浓度。由于一般循环伏安法适合于检测恒定的或缓慢变化的浓度如基础浓度, 而恒电位法适合于检测快速变化的浓度如激动剂引起的分泌。因此, 在测定基础和缺血状态的儿茶酚胺浓度以及鉴定检测信号的化学性质时, 采用循环扫描伏安法。即在碳纤电极上施加在－0.20 V～+0.60 V 之间循环扫描（变化）的电压, 电压扫描速率为100 mV/s, 采样电位为+0.25V, 连续循环扫描3～5周并取平均值, 采样间隔由实验情况决定。在检测ACh诱发分泌的儿茶酚胺时, 采用间歇式恒电位伏安法。即于给药前后这段时间内在碳纤电极上施加+0.40 V 的电压。
　　实验结果如下:

1．电极的选择性和灵敏度

　　在肾上腺髓质中, 抗坏血酸的浓度比较高(250 μmol/L), 未处理的碳纤维电极对抗坏血酸和儿茶酚胺的氧化没有选择性^［4］。因此为了排除抗坏血酸的干扰, 必须对电极进行处理。本实验的处理方法是: 将电极浸入0.5 mol/L NaOH溶液中于-0.2～1.0 V 以100 mV/s循环扫描10 min, 然后在1% Nafion乙醇溶液（一种阳离子交换剂,美国杜邦公司生产, 购自Sigma-Aldrich公司。5％（w/w）浓度的溶液型Nafion稀释后常用来修饰碳纤电极, 排除抗坏血酸和DOPAC等阴离子生物小分子的干扰）中浸30 s并在100℃ 烘1 h。经此处理后, 同样浓度的肾上腺素和抗坏血酸在电极上的氧化电流之比为1000∶1^［11］, 抗坏血酸对儿茶酚胺的测定没有干扰。图1a结果表明, 当采用恒电位（E=+0.4 V）方法进行测定时, 肾上腺素在这种电极上的氧化电流与其浓度在0.1～50 μmol/L之间具有线性关系, 检测限为0.1 μmol/L。由于大鼠肾上腺髓质中肾上腺素与去甲肾上腺素之比为4∶1^{［12 ］}, 而且去甲肾上腺素和肾上腺素在碳纤维电极上的氧化电位、选择性相同（虽然肾上腺素在+1.3 V 的高氧化电位下能出现第二个氧化峰, 但本实验的氧化电位在＋0.60 V 内, 它们的第一个氧化峰是重叠的）^［12］, 因此本实验所检测的是去甲肾上腺素和肾上腺素（儿茶酚胺）的总浓度。

图1.　测量前（a）和测量1 h后（b）肾上腺素在电化学处理和Nafion修饰碳纤电极上的响应电流的校正曲线
Fig.1.　Typical response current curves of adrenaline on the electrochemically pretreated and Nafion coated carbon-fiber electrode before (a) and after (b) in vivo measurement for 1 h determined by holding the electrode potential at +0.40 V. Adrenaline was increasingly added to the physiological buffer solution (pH 7.4) containing 250 μmol/L ascorbic acid.

　　由于在体测定后电极的灵敏度有所下降, 因此实验后必须取出电极进行后校正。校正方法是将电极取出后用蒸馏水冲洗掉表面粘附的血液和蛋白质, 浸入含250 μmol/L抗坏血酸和加入0～10 μmol/L肾上腺素的磷酸缓冲液（pH　7.4）中, 用与在体检测时相同的伏安法（间歇式恒电位或循环伏安法）测定不同浓度的肾上腺素在电极上的氧化电流, 绘制校正曲线。最后将实验数据插入校正曲线中求出相应的儿茶酚胺浓度。如图1b所示, 在体测量后电极的灵敏度会下降60%左右, 但其对儿茶酚胺的响应仍保持线性关系。

2.　电极位置的确定和分泌物的鉴定

　　如图2b所示, 肾上腺素在循环伏安曲线上的氧化峰电位为+0.25 V, 当插入肾上腺的电极检测到如图2c所示的肾上腺素特征氧化峰时, 说明电极已插入到髓质的嗜铬细胞群中, 所检测的分泌物为儿茶酚胺。

图2.　确认碳纤电极插入肾上腺中的位置以及响应电流所对应的分泌物的化学性质的循环伏安图
Fig.2.　Cyclic voltammograms used to check the implanted position of the electrode in the adrenal and to identify the secreted substance.a. In physiological buffer solution (PBS). b. In PBS with 5 μmol/L adrenaline. c. In vivo detection when stimulated by ACh administrated via ventrical aorta.

3.　基础水平和缺血的影响

　　在部分实验中, 我们使用了循环伏安法和间歇恒式电位法两种技术。在测定大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺的基础水平和缺血不同时间后的水平时, 均采用循环伏安法, 即在每个采样时间点于-0.20 V～+0.60 V之间循环扫描3～5周。由于自发分泌信号变化较快, 因此在监测其分泌的最大幅度时, 采用了恒电位伏安法。本实验统计结果表明, 大鼠腺髓质中儿茶酚胺的基础浓度为0.1～0.5 μmol/L（n=10）。由于肾上腺抬高后很容易导致缺血, 因此研究了缺血对分泌的影响。图3结果表明, 当腺体轻度缺血时（缺血2～5 min）,髓质儿茶酚胺浓度升高到0.5～2 μmol/L, 严重缺血时(缺血10～60 min)可达到5～30 μmol/L。在实验中, 我们发现肾上腺髓质能自发分泌儿茶酚胺。不缺血时, 17次实验中观察到4次自发分泌, 其幅度比较小, 最大的一次为9 μmol/L, 出现的频率比较低; 缺血时, 17次实验中观察到8次自发分泌, 其幅度和频率度增加了, 最大幅度达到28 μmol/L, 最大频率达到5次/20 min。

图3.　缺血不同时间后用碳纤电极在同一只大鼠的肾上腺髓质中检测的儿茶酚胺浓度
Fig.3.　Effect of ischemia time on the catecholamine levels in the same rat adrenal medulla detected with carbon fiber electrode (n=3).

4．　乙酰胆碱引起的儿茶酚胺分泌

　　支配肾上腺髓质的交感神经末梢释放的递质是乙酰胆碱, 因此我们用乙酰胆碱来刺激肾上腺髓质分泌儿茶酚胺。在体情况下,持续恒电位方法会使碳纤电极的灵敏度下降, 通过研究我们发现采用间歇式恒电位方法可使电极的灵敏度得到很大恢复。也就是说, 在每次给予ACh之前2 min开始在工作电极上加上+0.4 V 电压并保持5 min, 其它时间使电极处于开路状态。连续两次给予ACh的时间间隔一般不小于15 min。通过腹主动脉给予乙酰胆碱, 每次给予100 μl, 给药时间间隔为15～20 min。图4结果表明, 乙酰胆碱能剂量依赖性地刺激肾上腺髓质分泌儿茶酚胺。大鼠对乙酰胆碱敏感性存在一定的差异。

图4.　经腹主动脉给予100 μl乙酰胆碱诱发肾上腺髓质分泌的儿茶酚胺峰值浓度与乙酰胆碱浓度的关系
Fig.4.　Depndence of the peak amplitude of catecholamine secreted from three rat adrenal medulla on the concentration of ACh (100 μl) administrated via ventrical aorta.

　　由于大鼠肾上腺位于膈肌下面,容易受呼吸的影响, 因此肾上腺的固定是本实验成功的关键。当腺体抬得太高时很容易造成缺血, 使ACh不能到达髓质中。因此, 本实验中基础浓度的测定以及ACh刺激的分泌实验都是在腺体固定得非常好的情况下进行的, 这样的成功机会只有25%。实验测得大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺的基础浓度为0.1～0.5 μmol/L。这与人的肾上腺静脉血中儿茶酚胺的浓度（0.27 μmol/L）可以相比较（至今还没有大鼠肾上腺静脉数据可直接比较）^［1］。 缺血时肾上腺中儿茶酚胺浓度大大增加, 而且自发分泌的幅度和频率也相应增加, 说明缺血对动物是一种强烈的应激。 经腹主动脉给予乙酰胆碱能刺激肾上腺髓质分泌儿茶酚胺, 而且具有量效关系, 与Wakade的离体灌流结果相符合^［2］。肾上腺髓质在不缺血时也有小幅度和低频率的自发分泌。本文在肾上腺髓质中儿茶酚胺的在体伏安法测定方面为首次报道。

Corresponding author. Present addres: Institute of Biophysics and Biochemistry, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074;
Tel: 027-87543104; E-mail: zcg999@990.net
张春光(第二军医大学基础部生理学教研室)
徐建军(第二军医大学基础部生理学教研室)
陈宜张(第二军医大学基础部生理学教研室)
陈宜张(神经生物学教研室, 上海 200433)

参　考　文　献

　［1］　Chi ZS (池芝盛). 内分泌基础与临床. 北京, 北京科学技术出版社. 1992, 351～375.
　［2］　Wakade AR.Studies on secretion of catecholamine evoked by acetylcholine or transmural stimulation of the rat adrenal gland. J Physiol, 1981, 313: 463～480.
　［3］　Kissinger PT, Hart JB, Adams RN. Voltammetry in brain tissuea new neurophysiological measurement. Brain Res, 1973, 55: 209～213.
　［4］　Adams RN.　 In vivo 　electrochemical　 measurement 　in　 the CNS. Prog Neurobiol， 1990, 35: 279～311.
　［5］　Stamford JA，　Justice JB-Jr. Probing brain chemistry. Anal Chem， 1996, 68: 359A～363A.
　［6］　Jankowski JA, Schroeder TJ, Ciolkowski EL et al. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamine from adrenal medullary cells. J Biol Chem, 1993, 268: 14694～14700.
　［7］　Schroeder TJ, Jankowski JA, senyshyn J et al． Zones of exocytotic release on bovine adrenal medullary cells in culture. J Biol Chem, 1994, 269: 17215～17220.
　［8］　Tavis EK, Wightman RM. Spatio-temporal resolution of exocytosis from individual cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1998, 27: 77～103.
　［9］　Wightman RM, Wipf DO. Electroanalytical Chemistry. In: Bard AJ ed. New York Marcel Dekker. 15: 267～353.
［10］　Akiyama A, Kato I, Ishii K et al. In vitro measurement of dopamine concentration with carbon fiber electrode. Analyt Chem， 1985, 57: 1518～1522．
［11］　Brazell MP, Feng J, Kasser RJ et al. An improved method for Nafion coating carbon fiber electrodes for in vivo electrochemistry. J Neurosci Meth， 1987, 22: 167～l72.
［12］　Pihel K, Schroeder TJ, Wightman RM. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analyt Chem， 1994, 66: 4532～4537.

Received 1999-07-16　　Revised 1999-09-28