Received
2000-01-09 Accepted 2000-04-18
*Project
surpported by National Natural Science Foundation of China (39870888)
**Corresponding
author. Tel: 020-87330647; E-mail: Jing@gzsums.edu.cn
生理学报, Oct. 2000,
52 (5): 365～370
Acta
Physiologica Sinica
MKP-1在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的调控作用
刘培庆**, 鲁伟, 王庭槐, 潘敬运
(中山医科大学生理学教研室, 广州 510089)
摘要: 本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)角度,
研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标,
以凝胶内MBP原位磷酸化测定MAPK活性, 以免疫印迹法(Western boltting)分别测定MKP-1及磷酸化p44MAPK、p42MAPK蛋白表达。结果发现:
(1)AngⅡ(10－７ mol/L)处理48 h, 心肌细胞 3H-亮氨酸掺入率、蛋白含量及细胞表面积明显增加, AngⅡ增加 3H-亮氨酸掺入的作用可被血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)拮抗剂CV11974(10－6
mol/L)明显抑制(抑制85%), 被MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(5×10－5 mol/L)部分抑制(抑制32.5%); (2)
CV11974或PD098059可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达及MAPK酶活性(以γ-32P-ATP掺入表示); (3)以磷酸化MAPK蛋白表达反映MAPK活性,
可见AngⅡ处理心肌细胞 5 min, MAPK活性即开始增加, 30 min左右达到高峰, 2 h后基本恢复正常; 而MKP-1蛋白表达30 min即见增加,
持续2 h以上; (4) 用放线菌素D (actinomycin D)处理心肌细胞30 min可明显抑制MKP-1的表达, 同时使AngⅡ致磷酸化MAPK蛋白表达时间延长至2
h以上。以上结果表明, MAPK激活在AngⅡ导致的心肌肥大反应中具有重要作用, MKP-1通过使活化的MAPK去磷酸化而使MAPK失活, 从而参与对心肌肥大反应的调节。
关键词: 丝裂原活化蛋白激酶; 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶;
心肌细胞; 肥大反应; 血管紧张素Ⅱ
学科分类号: Q463; R331.36
MKP-1 regulates the cardiomyocyte hypertrophic responses
induced by angiotensin Ⅱ
LIU Pei-Qing,
LU Wei, WANG Ting-Huai, PAN
Jing-Yun
(Department of
Physiology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089)
Abstract: The aim of this study was to determine
the regulation by MKP-1 of MAPK activity and protein expression in
cardiomyocyte hypertrophic response induced by Ang Ⅱ. Neonatal rat
cardiomyocyte hypertrophic response was assayed by cell surface area, protein
synthesis rate and protein content. MAPK activity was determined by an in-gel
kinase assay. Protein expression of MAPK and MKP-1 were detected by Western
blotting. The results are as follows. (1) Ang Ⅱ induced promotion of 3H-leucine incorporation and increase
in cell protein content and cell surface area in a dose-dependent manner. Pretreatment
with a selective AT1 receptor
antagonist CV11974 or a
specific MEK inhibitor PD098059, cardiomyocyte hypertrophic response induced by
Ang Ⅱ was inhibited by 85% and 32.5%, respectively. (2) After pretreatment with
PD098059 or CV11974, AngⅡ-induced increases in p44MAPK and p42MAPK protein expression and enzyme
activity (expressed by γ-32P-ATP incorporation) were all inhibited obviously. (3) With treatment of
myocytes by Ang Ⅱ for 5 min, MAPK activity determined by p44MAPK and p42MAPK
protein expression began to increase, while MKP-1 protein expression was
detected within 30 min and lasted more than 2 h following treatment with Ang Ⅱ.
(4) Pretreatment of cardiomyocytes with actinomycin D (3 μg/ml) for 30 min inhibited MKP-1 protein expression,
while p44MAPK and p42MAPK protein expression was still detected 120 min after AngⅡ
treatment. The above results demonstrate that activation of MAPK plays an important role in Ang Ⅱ-induced cardiomyocyte hypertrophic
response in neonatal rat
cardiomyocytes through
MKP-1 mediated inactivation of
p44MAPK and p42MAPK.
Key
words: mitogen-activated protein
kinase; mitogen-activated protein kinase phosphatase-1; cardiomyocyte; hypertrophic response;
angiotensin Ⅱ
许多研究证明, 在压力超负荷等病理因素所导致的心肌肥大反应中, 血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是重要的刺激因子, 而血管紧张素转化酶抑制剂及AT1受体拮抗剂是目前治疗高血压心肌肥厚的重要药物[1,2]。但对AngⅡ导致心肌肥大反应的细胞内信号调控机制尚未完全阐明。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein
kinase, MAPK)是目前发现的最主要的一个生长信号调节蛋白, 广泛分布在细胞浆内, 其成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal
regulated kinase, ERKs, 主要为p44 MAPK和p42 MAPK)与细胞生长、分化和增殖的调控关系最为密切[3]。研究显示, MAPK激活(即Thr183和Tyr185残基磷酸化)在AngⅡ等多种致肥大因子介导的心肌肥大反应中起关键作用,
活化的MAPK主要被其磷酸酶去磷酸化而失活, 其中磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,
MKP-1)最为重要[4,5]。本研究旨在利用培养的新生大鼠心肌细胞, 主要从MKP-1对MAPK去磷酸化调控的角度, 研究MAPK信号途径在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的作用及调控机制,
为深入研究心肌肥大的发生、发展和逆转机制提供新的思路和依据。
１材料和方法
1．1心肌细胞培养 按Simpson等描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以0.06%胰蛋白酶分离1～3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞, 采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养前的48
h, 在心肌细胞培养液中加入 0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿苷, 以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液, 72 h时开始用于药物实验。
1．2心肌细胞蛋白质含量和细胞表面积的测定 将心肌细胞分别接种于25 ml的培养瓶(测定细胞的蛋白质含量)或24
孔培养板(测定细胞直径、周径和表面积)中, 48 h后换无血清培养液,
72 h换入含有各种干预因素的无血清培养液。之后每2天换液1次, 到第8天收集细胞。用Bradford法[13]测定心肌细胞蛋白质含量, 并根据各瓶细胞数,
计算出每瓶细胞的总蛋白含量和每个心肌细胞的蛋白质含量。将贴壁生长的心肌细胞消化脱落后, 用IBAS图像处理系统测定心肌细胞直径、周径和表面积, 每孔测5个视野,
每个视野测10～15个细胞, 取其平均值。
1．3心肌细胞 3H-亮氨酸掺入测定 调细胞浓度至3×105/ml, 接种于24孔培养板上, 每孔1
ml。培养48 h后换为无血清培养基, 培养24 h后加入37 kBq
3H-亮氨酸及各种处理因子,继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定,洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中,
以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。
1．4MAPK活性测定[6] 用各种干预因素处理心肌细胞不同时间后, 弃去培养瓶中液体, 加入0.15 ml蛋白提取液,
其组成为(mmol/L):β-磷酸甘油 20, benzanidine 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl 50, EDTA 5, EGTA 5, Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH 7.4),
Triton X-100 0.1%(v/v), PMSF 0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, β-巯基乙醇
0.3%(v/v)。收集细胞提取物, 4℃离心(13?000 r/min×10 min), 取上清液, 按Bradford法测量蛋白浓度, 调蛋白浓度至200
μg/ml, 免疫沉淀法提取MAPK蛋白。方法简述如下: 以琼脂糖结合的兔抗MAPK抗体(1∶20)于4℃共同振荡孵育2 h, 低温离心(4℃, 12?000
r/min 4次, 每次10 s)。其间以洗脱液充分洗脱沉淀, 最后用洗脱液悬浮, 得到MAPK蛋白的提取液。蛋白定量后加入等体积载样缓冲液, 加热变性蛋白(95℃,
5 min), 离心取上清进行SDS-PAGE。 凝胶内含有MBP(MAPK底物, 0.5 mg/ml), 电泳后凝胶经过异丙醇溶液洗脱、盐酸胍溶液变性、β-巯基乙醇和Tween-40溶液复性后在室温下分别与孵育缓冲液A及B(其组成参见文献[6],
孵育缓冲液B中含185 kBq的γ-32P-ATP)各孵育1 h, 以三氯乙酸洗脱凝胶, 进行放射自显影, 用IBAS图像处理系统扫描胶片测定感光区带的感光密度,
并进行积分处理。
1．5免疫印迹法测定MAPK蛋白表达[7] 用以上免疫提取液进行SDS-PAGE电泳, 电印迹转移法转至硝酸纤维素膜上,
以含1%BSA的TBST溶液室温封闭1 h, 分别与一抗(小鼠来源MAPK单克隆抗体, 1∶10?000稀释度)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG)室温各孵育1
h, 与ECL试剂反应1 min, X光胶片压片曝光1 min, _肐BAS图像处理系统对胶片扫描测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。
1．6免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达[7] 方法参见1.5, 以兔抗鼠MKP-1单克隆抗体为一抗, HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,其稀释度为1∶5?000,
蛋白杂交法测定MKP-1蛋白表达。
1．7试剂 小鼠来源MAPK磷酸化单克隆抗体、琼脂糖结合的兔抗MAPK抗体、兔抗大鼠MKP-1单克隆抗体、leupeptin、apoprotin、PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为:
TTYADFIASGRRANAIHD)、AngⅡ、放线菌素D均购自Sigma公司, 化学发光增强剂(ECL)购自基因公司, 其中含辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,
[γ-32P]ATP、 3H-亮氨酸购自北京原子能研究所, CV11974由日本爱媛大学小野知原教授惠赠, MBP、PD098059、胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司,
其它试剂均为国产分析纯。
1．8统计学处理 数据以x±s表示, 进行秩和检验, P<0.05表示差异有显著性意义。
2结果
2．1AngⅡ对蛋白质合成速率、蛋白质含量和细胞表面积的影响
在无血清培养液中, AngⅡ显著增加新生大鼠心肌细胞的 3H-亮氨酸掺入、蛋白质含量和心肌细胞表面积, 在10－8～10－6 mol/L范围内呈明显剂量依赖性。AngⅡ各浓度组细胞数目无显著性差异(P>0.05,
n=4)。 3H-亮氨酸掺入速率为蛋白合成的关键指标, 以10－７ mol/L作为AngⅡ的标准实验浓度, AngⅡ(10－７ mol/L)增加心肌细胞
3H-亮氨酸掺入的
图1.不同浓度AngⅡ对培养新生大鼠心肌细胞 3H-亮氨酸掺入、蛋白质含量和心肌细胞表面积的影响
Fig. 1.Effect of angiotensin Ⅱ of different concentrations on 3H-leucine incorporation, protein
content and surface area in cultured neonatal rat myocyte.
作用可被AT1受体阻断剂CV11974(为TCV-116活性代谢产物, 10－6 mol/L)明显抑制(蛋白掺入增加率由40%±8%降为6%±4%),而MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059
(5×10－5 mol/L)可部分抑制该反应(蛋白掺入增加率由40%±8%降为27%±8%)。以上结果表明, AngⅡ主要通过AT1受体介导心肌肥大反应, 抑制MAPK的激活,
可减轻但不能完全消除AngⅡ介导的心肌肥大反应(图1、2)。
图2.CV11974及PD098059对AngⅡ促进培养新生大鼠心肌细胞 3H-亮氨酸掺入的影响
Fig. 2.Effect
of CV11974 and PD098059 on promotion of
3H-leucine incorporation induced by angiotensin Ⅱ in cultured neonatal
rat myocytes.
2．2AngⅡ对MAPK活性的影响
凝胶内MAPK原位磷酸化结果显示, AngⅡ(10－７ mol/L)可明显增加新生大鼠心肌细胞p44MAPK和p42MAPK活性, 以p44MAPK和p42MAPK两个同型体的积分光密度之和表示MAPK活性。由于AngⅡ处理心肌细胞10 min作用最为明显, 故以AngⅡ处理10
图3.CV11974及PD098059对AngⅡ激活MAPK的影响
Fig. 3.Effect of CV11974 and PD098059 on MAPK activity stimulated by
angiotensin Ⅱ.
min为例。 AngⅡ(10－７ mol/L)可使凝胶感光密度较对照组增加169%±70%
(P<0.01, n=4)。而预先以CV11974 (10－４ mol/L)或PD098059(5×10－5 mol/L)处理心肌细胞, 相同浓度的AngⅡ(10－７ mol/L)仅使凝胶感光密度较对照组增加11%±6.2%及22%±15.5%,
明显低于单用AngⅡ处理组。 提示CV11974或PD098059可抑制AngⅡ对MAPK的激活, 结果见图3。
2．3AngⅡ对MAPK及MKP-1蛋白表达的影响
以针对 p44MAPK和p42MAPK两个同型体的MAPK单克隆抗体对 SDS-PAGE的凝胶结果进行免疫分析, 结果显示新生大鼠心肌细胞中MAPK这两个同型体皆有表达。用AngⅡ(10－７ mol/L)处理心肌细胞5 min,磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK及p42MAPK)表达即开始增加,
5、10、15、30 min及2 h时分别增加86%±39%、152%±32%、79%±31%、62%±32%、15%±13%,
说明AngⅡ增加心肌细胞磷酸化MAPK蛋白表在10 min左右时最明显, 可持续30 min以上, 2 h时磷酸化MAPK蛋白表达基本恢复正常(图4)。以AngⅡ处理心肌细胞10
min,磷酸化MAPK蛋白(p44MAPK及p42MAPK)表达为标准,
图4.AngⅡ诱导磷酸化MAPK蛋白表达的时效关系及放线菌素D对AngⅡ作用的影响
Fig. 4.Effect of angiotensin Ⅱon phosphorylated MAPK protein expression
and the influence of actinomycin D
on the action of angiotensin Ⅱ.预先以CV11974(10－6 mol/L)或PD098059(5×10－5
mol/L)处理心肌细胞, 可明显抑制AngⅡ(10－７
mol/L)诱导的磷酸化MAPK蛋白表达。这与凝胶内MAPK原位磷酸化测定MAPK活性结果一致, 提示磷酸化MAPK表达增加主要由于蛋白磷酸化程度增加而非MAPK蛋白含量增加。
图5.CV11974及PD098059对AngⅡ诱导磷酸化MAPK蛋白表达的影响
Fig. 5.Effect of PD098059 and CV11974 on phosphorylated MAPK protein
expression induced by angiotensin Ⅱ.
图6.AngⅡ诱导MKP-1蛋白表达的时效关系及放线菌素D对其的影响
Fig. 6.Effect of angiotensin Ⅱ on MKP-1 protein expression and the
influence of actinomycin D on the action of angiotensin Ⅱ.
放线菌素D为MKP-1蛋白表达的抑制剂[9], 实验以放线菌素D (3 μg/ml)预先处理心肌细胞30 min, 再给予AngⅡ(10－７ mol/L)刺激, 可见各时间点MKP-1蛋白表达皆低于单用AngⅡ刺激组。但放线菌素D
处理组AngⅡ刺激2 h时心肌细胞磷酸化MAPK蛋白表达明显高于同时间单用AngⅡ刺激组(与刺激前相比, 分别增加76%±9%及15%±13%), 提示放线菌素D抑制MKP-1蛋白表达的同时延长了MAPK活化的持续时间,
结果见图4、5、6。
3讨论
本研究表明, AngⅡ可剂量依赖性地诱导培养的新生大鼠心肌细胞的肥大反应及MAPK激活, 这种作用主要通过AT1受体介导。AngⅡ亦可诱导MKP-1蛋白表达,
以放线菌素D抑制AngⅡ诱导的MKP-1蛋白表达可延长MAPK活化的持续时间, 提示AngⅡ诱导的MKP-1蛋白表达可能与MAPK失活有关。
MKP-1是重要的MAPK磷酸酶, 可使MAPK的双磷酸化位点去磷酸化而失活[7,8], 但对诱导心肌细胞MKP-1蛋白表达的途径及机制尚不完全清楚,
其在心肌肥大反应中的作用也有待深入研究。本文观察到, 在AngⅡ介导的心肌细胞肥大反应中, 伴随着MAPK的激活, MKP-1蛋白表达增加, 若以AT1受体阻断剂CV11974或MAPK激酶特异性抑制剂PD098059抑制MAPK激活,
同时也抑制了MKP-1蛋白表达, 提示MAPK的激活可能是MKP-1蛋白表达的诱导因素之一。放线菌素D为MKP-1蛋白表达的抑制剂[9], 放线菌素D抑制AngⅡ诱导的MKP-1蛋白表达可延长MAPK活化的持续时间,
提示在AngⅡ介导的MAPK通路激活过程中, 可能存在以下环路联系:
众多资料表明, AngⅡ作为一种重要的致心肌肥大因子, 对MAPK信号途径的逐级激活可能是导致心肌肥大的重要机制[10]。MAPK是90年代以来发现的最重要的生长信号调节蛋白,
其在细胞信号传导方面有两个重要特征: (1)活化的MAPK通过转位方式进入细胞核, 激活其下游底物, 主要是一些编码核转录因子的早反应基因(如原癌基因c-fos、
c-myc、c-jun和Erg-1等)表达, 调控细胞生长反应; (2) MAPK可将多个不同受体系统(如G-蛋白耦联受体和蛋白酪氨酸激酶受体)介导的信号加以整合,
起多种信号的交汇点或共同通路的作用[11]。但激活的MAPK很快被细胞内的磷酸酶去磷酸化而失活, 因此, MAPK活性受其上游MAPK激酶及其下游MAPK磷酸酶的双重调控。从目前研究来看,
在细胞内的磷酸酶中, MKP-1对MAPK去磷酸化有较高特异性, 在MAPK活性调节方面起重要作用[12～14]。以往人们主要从抑制MAPK激活的角度研究MAPK与心肌肥大的关系,
本文从MKP-1对MAPK的调控角度, 研究MAPK信号途径在AngⅡ导致心肌肥大中的作用。结果提示, 在AngⅡ导致心肌肥大反应过程中, MAPK与MKP-1之间可能存在环路联系。由于MAPK激活是介导心肌肥大反应的关键环节,
而MKP-1对MAPK的反馈调节在心肌肥大反应中的意义, 则是我们今后重点研究的问题。
参考文献
[1]Watson PA. Mechanical activation of signaling pathways in the
cardiovascular system. Trends
Cardiovasc Med, 1996,
6: 73～79.
[２]Menard J, Campbell DJ, Azizi M
et al. Synergistic
effects of ACE inhibition and AngⅡantagonism on blood pressure,cardiac weight,
and renin in spontaneously hypertensive rats. Circulation,
1997, 96: 3072～3078.
[３]Post RP,Goldstein D, Thuerauf DJ et al. Dissociation
of p44 and p42 mitogen-activated protein kinase activation from
receptor-induced hypertrophy in neonatal rat ventricular myocyte. J Biol Chem,
1996, 271 (14): 8452～8458.
[４]Anita MP,
Rim CS, Yao H et al. A novel
mitogen-activated protein kinase phosphatase. J Biol Chem, 1996, 270 (24): 8452～8458.
[５]Fuller SJ,
Davies EL, Gillespie BJ et al. Mitogen-activated
protein kinase phosphatase 1 inhibits the stimulation of gene expression by
hypertrophic agonists in cardiac myocytes. Biochem J, 1997, 323 (Pt 2): 313～319.
[６]Gotoh Y,
Nishida E, Yamashita et al. Microtubule associated protein kinase activated by
nerve growth factor and epidermal growth factor in PC12 cells: identity with the mitogen-activated protein kinase of
fibroblastic cells. Eur J Biochem, 1990, 349:
661～669.
[７]Cook
SJ, Beltman J, Cadwallader KA et
al. Regulation of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 expression by
extracellular signal-related kinase-dependent and Ca2+-dependent signal
pathways in Rat-1 cells. J Biol Chem, 1997, 272 (20):
13309～13319.
[８]Kusari AB,
Byon J, Bandyopadhyay D et al. Insulin-induced mitogen-activated protein (MAP)
kinase phosphatase-1 (MKP-1) attenuates insulin-stimulated MAP kinase activity:
a mechanism for the feedback inhibition of insulin signaling. Mol Endocrinol,
1997, 11 (10): 1532～1543.
[９]Duff JL,
Monia BP, Berk BC et al. Mitogen-activated
protein (MAP) kinase is regulated by the MAP kinase phosphatase-1 (MKP-1) in
vascular smooth muscle cells. Effect of actinomycin D and antisense
oligonucleotides. J Biol Chem,
1995, 270: 7161～7166.
[1０]Kojima M,
Shiojima I, Yamazaki T et al. Angiotensin Ⅱ receptor antagonist TCV-116 induces
regression of hypertensive left ventricular hypertrophy in vivo and inhibits the
intracellular signaling pathway of stretch-mediated cardiomyocyte hypertrophy
in vitro. Circulation, 1994,
89: 2204～2211.
[１1]Martin A.
Signaling pathways in cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol,
1997, 29: 2873～2892.
[1２]Anita MP,
Rim CS, Yao H et al. A novel mitogen-activated protein kinase phosphatase. J
Biol Chem, 1996, 270 (24): 8452～8458.
[1３]Darbre A.
Analytic methods. In: Darbre A eds. Practical Protein Chemistry: A Handbook. New
York: Wiley, 1986, 227～335.
[1４]Ueki K,
Matsuda S, Tobe K et al. Feedback regulation of mitogen-activated protein
kinase activity of c-Raf-1 by
insulin and phorbol ester stimulation. J Bio Chem, 1994, 269 (22): 15756～15761.