Received 2000-01-17 Accepted 2000-04-13

*Supported by the Natural Science Foundation of Beijing (No.5932007)

**Corresponding author. Tel: 86-10-62004522; Fax: 86-10-62388927; E-mail: biology@china2.ygi.edu.cn

生理学报, Oct. 2000, 52 (5): 390～394

Acta Physiologica Sinica

茶碱改善东莨菪碱诱发的大鼠记忆障碍

金宗濂**, 文镜, 王卫平, 贺闻涛

(北京联合大学应用文理学院, 北京 100083)

摘要: 用高效液相色谱测定了不同年龄SD大鼠与记忆有关脑区的腺苷和乙酰胆碱水平。结果表明, 18～20月龄鼠的脑内腺苷含量明显高于3～6月龄鼠, 而乙酰胆碱(ACh)含量却显著低于3～6月龄鼠。经腹腔给大鼠注射东莨宕碱建立近期记忆障碍模型, 同时经脑室给予茶碱后, 其跳台成绩明显优于对照组, 且脑内ACh含量亦显著升高。提示腺苷含量的随龄增加可能是老年记忆障碍的一个重要因素, 茶碱作为腺苷受体阻断剂可能通过提高脑内ACh水平起到改善东莨宕碱诱发的大鼠记忆障碍的作用, 因此茶碱可能是治疗老年记忆障碍的一种有希望的药物。

关键词: 腺苷; 茶碱; 乙酰胆碱; 东莨宕碱; 老年学习记忆障碍

学科分类号: Q427

The role of theophylline in the improvement of scop-induced

learning and memory impairment

 JIN Zong-Lian**, WEN Jing, WANG Wei-Ping, HE Wen-Tao

(College of Applied Sciences and Humanities of Beijing Union University, Beijing 100083)

Abstract: Adenosine and ACh contents in hippocampus, striatum region around the nucleus of basal meynert (NBM) and the frontal and temporal parts of rat cortex were measured by a high performance liquid chromotography-electronic detector (HPLC-ECD). Adenosine content in 18～20 month-old rats was significantly higher than that of 3～6 month-old rats, while ACh content in 18～20 month-old rats was lower than that of 3～6 month-old ones. Learning and memory impairment models were established by induction of SD rats with scopolamine (0.5 mg/kg, ip), which were injected with an adenosine recepter antagonist theophylline (1.0 mg/5 μl, icv), and the step-down test was performed. The error frequency in the step-down test decreased significantly (P<0.05), and the retention time was longer than that of control. Furthermore, ACh content increased in all the three different brain regions. The above results suggest that adenosine may play an important role in senile learning and memory impairment, and theophylline may improve scopolamine-induced learning and memory impairment by increasing ACh content. In consequence, theophylline could be a promising drug for ameliorating senile learning and memory impairment.

Key words: adenosine; theophylline; acetylcholine; scopolamine; senile learning and memory impairment

记忆是指将获得新的行为习惯及经验储存一定时间的能力, 这是脑的一种高级机能。记忆过程受神经递质和神经肽的调节, 而中枢胆碱能系统在这一调节过程中起重要作用[1]。有报告表明, 人类中枢神经系统中乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)浓度自40～50岁开始即有明显降低趋势, ACh合成酶亦有随龄降低的改变。而变化最显著的是一些与学习和记忆密切相关的脑区, 如海马、皮层和纹状体等[2]。因此不少学者认为, 脑内胆碱能功能的随龄衰退是老年记忆障碍的脑化学基础。但是脑内ACh为什么会出现随龄降低呢？一些研究曾指出, 胆碱乙酰化酶活性的随龄下降是重要原因。但是临床上采用递质替代疗法却往往不能收到满意效果。提示ACh随龄下降也许存在更深层次的原因。近年来, 腺苷(adenosine)作为一种神经调质逐渐受到人们重视。在离体实验中, 我们也曾观察到腺苷受体激动剂PIA([R]-N6-[1-Methyl-2-phenylethyl]adenosine)能抑制大鼠海马脑区胆碱能神经元释放ACh, 这一效应有随龄变化的特征, 提示海马释放ACh的随龄降低有可能是海马嘌呤能神经元活动随龄增强的结果[3]。本文试图通过整体实验研究腺苷、ACh和老年记忆障碍的关系, 并进一步探讨腺苷受体阻断剂茶碱改善老年记忆的可能机制。

１材料和方法

1.1材料实验用SD大鼠, 根据不同月龄分组。主要试剂有腺苷、茶碱、乙酰胆碱、胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶、东莨菪碱 (Sigma产品)。采用高效液相色谱仪(HPLC, 美国BECKMAN公司)110B溶剂输送系统、ultrasphere ODS C18柱(5 μm颗粒 4.6 mm×250 mm)、166紫外检测器、BAS电化学检测器和GOLD数据处理系统, 以及BECKMAN J2-HS高速冷冻离心机和江湾Ⅰ型脑立体定位器(上海生物医学仪器厂)。

1.2方法

1.2.1大鼠不同脑区腺苷的随龄变化取3～6月龄和18～20月龄SD雄性大鼠各12只。低温下取大鼠海马、纹状体(尾、壳核及苍白球外侧)和皮层(额叶、颞叶), 加10%三氯乙酸、pH 5.8、 I=0.02磷酸缓冲液4 ml在冰浴中匀浆, 15?000 g低温离心25 min, 上清液经0.2 μm膜过滤。取20 μl进HPLC分析。用Lowry法测蛋白质含量。HPLC分离条件[4, 5]: C18柱, A泵甲醇, B泵磷酸缓冲液梯度洗脱。B%变化量: 0～9 min: 90→38%; 9～9.5 min: 38%; 9.5～11 min: 38～90%。流速1 ml/min。紫外检测波长254 nm。

1.2.2大鼠不同脑区乙酰胆碱的随龄变化取1～2、3～6和18～20月龄的SD雄性大鼠各10只, 用四硫氢二铵镉_嵫?Reineche胺盐)沉淀法分别制备大鼠海马、纹状体(尾、壳核及苍白球外侧)和皮层(额叶、颞叶)。用HPLC分析样品[6], HPLC分离后用酶柱(AChE 125 U, Cho 75 U)进行柱后反应, 再以电化学检测器工作电压0.5 V检测。

流动相: 0.2 mol/L Tris-马来酸缓冲液(pH 7.0), 其中包括四甲基氯化铵150 mg/L, 辛基磺酸钠10 mg/L。流速1.3 ml/min。

1.2.3东莨菪碱对大鼠跳台成绩的影响取2～3月龄SD雄性大鼠24只, 18～20月龄SD雄性大鼠26只, 随机分为实验组和对照组。经腹腔给实验组注射东莨菪碱0.5 mg/kg, 对照组注射生理盐水, 30 min后用跳台法(Step-down)作为检测学习记忆行为的模型。记录动物在台上站满5 min受到电击的次数, 即错误次数作为学习成绩。24 h后记录动物第一次跳下平台的潜伏期以及5 min内的错误次数作为记忆的成绩。老年鼠(18～20月龄)和青年鼠(2～3月龄)的电击电压均为36 V。

1.2.4东莨菪碱对大鼠脑内乙酰胆碱的影响取2～3月龄SD雄性大鼠32只, 随机分为实验组和对照组。经腹腔给实验组注射东莨菪碱0.5 mg/kg, 对照组注射生理盐水, 24 h后用HPLC-ECD法测ACh, 方法同1.2.2。

1.2.5茶碱对东莨菪碱近期记忆障碍模型大鼠跳台成绩的影响取2～3月龄 SD 雄性大鼠44只, 随机分为4组。在动物侧脑室部位插入不锈钢管并固定于颅骨上, 以便进行脑室注射。 1周后, 4组大鼠均经腹腔注射东莨菪碱, 以建立近期记忆障碍模型。然后实验组经脑室分别注射1.0、 0.1、 0.01 μg/5 μl茶碱, 对照组注射人工脑脊液 (0.1 mol/L PBS, 5 μl)代替茶碱, 30 min后测跳台成绩, 方法同1.2.3。

1.2.6茶碱对东莨菪碱近期记忆障碍模型大鼠脑内乙酰胆碱含量的影响取2～3月龄SD雄性大鼠32只, 随机分为实验组和对照组。在动物侧脑室部位插入不锈钢管并固定于颅骨上, 以便进行脑室注射。１周后, 两组大鼠均经腹腔注射东莨菪碱以建立近期记忆障碍模型。然后实验组经脑室注射1.0 μg/5 μl茶碱, 对照组注射人工脑脊液(0.1 mol/L PBS, 5 μl)代替茶碱, 24 h后即可用HPLC-ECD法测ACh, 方法同1.2.2。

1.2.7数据处理实验数据用Microsoft Excel软件进行方差分析。

2结果

2.1大鼠不同脑区腺苷的随龄变化

与3～6月龄鼠相比, 18～20月龄大鼠大脑皮层(额叶、颞叶)、海马、纹状体(尾、壳核及苍白球外侧)中腺苷含量分别增加了66.7%、37.2%和27.3%。结果提示, 与记忆有关脑区腺苷含量有随龄增加的特征(表1)。

2.2大鼠不同脑区乙酰胆碱的随龄变化

与 3～6 月龄相比, 18～20 月龄大鼠大脑皮层

表1.不同年龄大鼠大脑皮层、海马、纹状体中的腺苷含量

Table 1.Content of adenosine in hippocampus, striatumand cortex of rat brain (μmol/g protein, mean±SD)

Group[]n[]Hippocampus[]Striatum[]Cortex3～6 months[]12[]6.28±1.29[]8.68±1.01[]4.27±1.2318～20 months[]12[]8.62±2.32*[]11.05±1.80*[]7.13±1.54*P<0.01, compared with the 3～6 months group.

(额叶、颞叶)、海马和纹状体(尾、壳核及苍白球外侧)三脑区的ACh含量分别减少51.7%、60.0%和11.5%。与1～2月龄相比, 3～6月龄大鼠以上三脑区ACh含量分别减少53.6%、47.6%和14.5%。表明SD大鼠以上三脑区中ACh含量有随龄下降的特征(表2)。

表 2.不同年龄大鼠大脑皮层、海马、纹状体中的乙酰胆碱含量

Table 2.Content of ACh in hippocampus, striatum and cortex in rat brain of different ages (pmol/mg pro)

〖ＢＨＤＦＧ4，ＷＫ8ZQ，WK6ZQ2,WK36W〗Group[]n[]Content of ACh in rat brain (mean±SD)Hippocampus[] Striatum [] Cortex1～2 months[]10[] 1275.44±77.09 [] 1305.50±93.40 [] 266.42±25.623～6 months[]10[]592.31±57.61* []684.25±32.62* []227.31±20.50*18～20 months[]10[]286.33±27.24** []301.44±34.53** []201.13±23.02**P<0.05, compared between the mature and the young;*P<0.01, compared among the old, the young and the mature.

2.3东莨菪碱对大鼠跳台成绩的影响

东莨菪碱明显增加了跳台训练期和记忆保持期的错误次数, 缩短了24 h后的潜伏期。表明注射东莨菪碱后, 实验动物的记忆出现显著障碍。同时, 东莨菪碱对18～20月龄大鼠记忆能力的损害程度显著高于2～3月龄。　表明东莨菪碱对于老龄鼠记忆能力的损害更为严重 (表3)。

2.4东莨菪碱对大鼠脑内乙酰胆碱的影响

给予东莨菪碱后, 与正常对照组相比, 大鼠大脑皮层(额叶、颞叶)、海马和纹状体(尾、壳核及苍白球外侧)ACh含量均显著降低 (表4)。

表 3.东莨菪碱对大鼠跳台成绩的影响

Table 3.Effect of scopolamine on the step-down tests of rats (mean±SD)

Group []Treatment []n[]Training periodErrors[][]Memory retained periodRetention time (second)[]Errors2～3 monthsControl[] Normal saline[]12[]1.4±0.2[]235.6±33.0[]0.2±0.1Scop.[]Scop.(0.5 mg/kg)[]12[]15.2±0.9**[]104.0±42.1*[]0.8±0.2*18～20 months Control[] Normal saline[]14[]1.4±0.2[]241.4±31.2[]0.2±0.1Scop.[] Scop.(0.3 mg/kg)[]12[]16.4±1.6**[]25.2±15.6**Δ[]2.3±0.4**ΔScop. (scopolamine) ip 30 min before tests; P<0.05, *P<0.01 compared with the control; ΔP<0.05 compared with scopolamine group (scop. 2～3 months).

表 4.东莨菪碱对大鼠脑内乙酰胆碱的影响

Table 4.Effect of scopolamine (pmol/mg pro) on the content of ACh in rat brains

Scop.: scopolamine, 0.5 mg/kg, ip; *P<0.01, compared with the control (mean±SD).

2.5茶碱对东莨菪碱记忆障碍模型大鼠跳台成绩的影响

表 5显示, 与对照组相比, 三种浓度的茶碱均可明显减少由东莨菪碱造成的近期记忆大鼠训练期的错误次数, 且其作用随浓度增大而加强。1 μg的茶碱还可以明显延长它们记忆保持期的潜伏期。结果表明, 茶碱可显著改善由东莨菪碱造成的近期记忆障碍。

表 5.茶碱对东莨菪碱记忆障碍模型大鼠跳台成绩的影响

Table 5.Effect of theophylline on the step-down tests of rat models induced by scopolamine

〖ＢＨＤＦＧ6，ＷＫ7ZQ,WK3ZQ,WK13,WK1,WK26W]Group

(2～3 months)[] n[]TreatmentΔ Scop.

(mg/kg, ip) [] Theo.

(μg, icv)[][] Step-down tests (mean±SD)Training period

Errors[]Retaining periodRetention (s)Δ [] ErrorsControl[]12[]0.5[]0[][]15.2±0.9 []104.0±42.1 [] 0.8±0.2Theo. 1 []12[]0.5[]1.0[][]4.0±0.5**[]202.9±41.4**[] 0.7±0.3 Theo. 2 []10[]0.5[]0.1[][]6.9±0.8**[]104.1±43.0 [] 0.9±0.2 Theo. 3[]10[]0.5[]0.01[][]12.0±0.8*[]100.4±42.5 []0.7±0.1 Δ: injected 30 min before training. Theo.: theophylline; s: second. P<0.05; *P<0.01, compared with the control.

2.6茶碱对东莨菪碱记忆障碍模型大鼠脑内乙酰胆碱含量的影响

成年鼠实验组动物脑室注射1.0 μg茶碱后与对照组相比, 大脑皮层(额叶、颞叶)、海马和纹状体(尾、壳核及苍白球外侧)中ACh含量明显升高(P<0.01), 其中海马中增高了10.18%, 纹状体中增高了10.89%, 皮层中增高了8.21%。表明茶碱改善由东莨菪碱造成的近期记忆障碍是通过提高与记忆相关脑区ACh水平实现的 (表6)。

表 6.茶碱对东莨菪碱记忆障碍模型大鼠脑内乙酰胆碱含量的影响

Table 6.Effect of theophyline on ACh of rat learning and memory models caused by scoplamine (pmol/mg pro, mean±SD)

*P<0.01, compared with the control. Theo.: theophylline (1.0 mg/5 μl, icv).

3讨论

学习记忆能力, 特别是近期记忆能力的下降是脑衰老的一个重要表现。随着人口老龄化进程的加快, 这一现象受到人们越来越多的关注。众所周知, 中枢神经系统内胆碱能系统的随龄衰退是老年近期记忆障碍的重要原因之一[4], 我们的实验结果支持这一论点。表2所示脑内ACh含量有随龄降低的趋势, 与文献报道一致[7]。但是, 与记忆相关脑区(海马、纹状体、皮层)的ACh水平为什么会呈现随龄降低的趋势呢？从表1的结果可以看到, 海马、纹状体及皮层这些与近期记忆密切相关脑区的腺苷含量有随龄升高的趋势。腺苷作为一种神经调质, 在脑内有广泛的分布。腺苷的释放主要来自突触后效应细胞, 它对突触前末梢存在一种负反馈调节。脑内腺苷通过对突触前抑制的机制对多种递质的释放有向下调节的影响[8]。因此与记忆有关脑结构的ACh水平随龄下降可能是脑内嘌呤能活动增强的结果[9]。以往我们曾在离体实验中观察到, 腺苷受体激动剂PIA对大鼠海马脑片的ACh的释放有显著的抑制作用, 而且这一抑制效应有随龄变化的特征[3]。本次实验进一步在整体实验中证实, 在由东莨菪碱诱发的近期记忆障碍的动物模型上, 和对照组相比, 与记忆有关脑区的ACh含量也呈现显著降低的趋势(表4), 而且与行为测试结果一致(表3)。在采用腺苷受体阻断剂茶碱后, 不仅模型组近期记忆障碍得到显著改善(表5), 而且与记忆有关脑区的ACh含量也出现明显升高(表6), 也与行为改善的结果相一致。茶碱改善大鼠学习记忆行为的机制, 一方面与其提升与学习记忆相关脑区内乙酰胆碱水平有直接关系；另一方面, 可能与茶碱对中枢神经系统有兴奋作用, 可舒张脑血管, 增加脑血流量, 从而改善脑代谢状况有关。此外, 我们的实验还发现, 茶碱也可提升海马、皮层、纹状体及脑干内单胺类递质水平, 从而改善大鼠的学习记忆能力(待发表)。1995年, 在总结了以往的文献报道及我们实验室工作基础上, 我们曾提出过一个假设: 中枢神经系统内腺苷的随龄变化很可能是发生阿尔采默型老年痴呆症(senile dementia of Alzheimer′s type, SDAT)的另一种可能的分子机制[10]。本实验结果不仅从另一侧面支持了胆碱能系统的随龄衰退是老年记忆障碍一个重要原因, 同时也表明脑内嘌呤能活动的增强可能是老年记忆障碍更为深层次上的一种分子机制, 即腺苷的神经调节机制。

综合上述动物实验的结果, 我们认为脑内特别是与记忆相关脑区腺苷活动的随龄增强, 可能是通过它对中枢各类神经元的抑制作用, 特别是对胆碱能神经元抑制作用的增强, 使胆碱能系统的功能出现障碍, 在行为学上表现为老年近期记忆障碍。

参考文献

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