Received 2000-08-03  Accepted 2000-11-16

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39670800) and the Defence Medical Fund (98Z083).

*Corresponding author. Tel: 029-3374584; E-mail: Zhanglf@fmmu.edu.cn

生理学报, Apr. 2001, 53  (2): 123~127

Acta Physiologica Sinica

 

模拟失重大鼠心肌与血管组织的热应激诱导HSP70表达

刘春, 张立藩, 余志斌, 倪鹤鹦

(第四军医大学航空航天生理学教研室, 西安 710032)

 

摘要:  为研究模拟失重是否可引起大鼠心肌与血管组织HSP70的诱导表达发生改变, 用尾部悬吊大鼠模型模拟失重, 以研究失重对生理的影响。用Northern杂交与Western 印迹分析检测4周模拟失重大鼠热应激后并在室温下恢复1 h (SUS-H1)或2 h (SUS-H2)心肌、血管组织HSP70表达的变化。 结果表明, 热应激后, 各组大鼠心肌组织的HSP72 mRNA表达均显著增加, 但SUS-H2大鼠心肌组织的表达显著低于CON-H2组; 各组大鼠心肌组织HSP72表达也均显著增加, 但SUS-H1与SUS-H2大鼠的表达与相应对照组相比, 则仅呈降低趋势。基底动脉血管组织的HSP72 mRNA与HSP72诱导表达均显著增高; 而在股动脉则两者仅呈降低趋势。上述结果提示: 模拟失重可导致大鼠心肌发生类似衰老的心肌改变; 身体前、后部血管组织HSP70的诱导表达变化可能与血管的分化性适应方向一致。

 

关键词: 模拟失重; 热休克蛋白; Northern 杂交; Western 印迹分析; 心肌; 动脉

学科分类号: Q494; R852.22

 

Heat stress-induced HSP70 expression in heart and vessels of

simulated weightless rats

LIU Chun, ZHANG Li-Fan, YU Zhi-Bin, NI He-Ying

(Department of Aerospace Physiology, the Fourth Military Medical University,  Xi′an  710032)

 

Abstract:  To examine the effect of simulated weightlessness on inducible HSP70 expression in the heart and vessel tissues of rats, a tail-suspension rat model was used to simulate weightlessness. HSP72 mRNA and HSP70 expression in heart and vessel tissues of both simulated weightless and control rats exposed to heat stress (ambient temperature, Ta=43℃) and recovered at Ta of 25℃ for 1 h (CON-H1, SUS-H1) or 2 h (CON-H2, SUS-H2) were analyzed using Northern blot and Western blot. The expression of HSP72 mRNA in the myocardium significantly decreased in SUS-H2, as compared with that of CON-H2 rats. The amount of HSP72 in the myocardium tended to decrease in both SUS-H1 and SUS-H2 groups, as compared with the corresponding control groups, but the differences were not statistically significant. The levels of inducible HSP70 expression in the vessels were related with their anatomical locations, for that the expression of both HSP72 mRNA and HSP72 significantly  increased in basilar arteries, whereas it showed a slight decline in femoral arteries. The blunted HSP70 expression in myocardium suggests that simulated weightlessness may induce myocardial changes similar to those in aging. However, the HSP70 expression changes in arteries are in accord with the trend of differential adaptation changes in  vessels to simulated weightlessness.

 

Key words: simulated weightlessness;  heat shock protein; Northern blot;  Western blot; myocardium; artery

 

在航天失重及地面模拟失重大鼠均观察到心肌有萎缩性改变[1]。本实验室还发现, 长期模拟失重大鼠心肌细胞内脂褐素数量增多[2], 心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维数量增多[3], 以及心肌被动性劲度可能增加[1]。这些发现均支持Timiras等关于失重、衰老与不活动三者有相似之处的论点[4]。应激时, 组2期 刘春等: 模拟失重大鼠心肌与血管组织的热应激诱导HSP70表达生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷织热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的诱导表达能力降低可能是机体衰老过程中的一种普遍现象[5]。故进一步阐明模拟失重大鼠心肌组织HSP70诱导表达水平是否也降低确具有重要意义。本实验用Northern杂交与Western印迹分析, 观察模拟失重大鼠受到热应激时心肌HSP70诱导表达的变化, 并与同步对照大鼠进行比较。鉴于在模拟失重下, 不同部位动脉血管分别出现结构与功能的上调和下调变化[6], 那么是否不同血管组织HSP70的诱导表达也会出现相反变化? 因此, 我们对基底动脉与股动脉的HSP70诱导表达也一并进行了观察。

 

１材料和方法

1.1 动物模型及热应激模型雄性SD大鼠48只(180~190 g), 先按体重随机分为4周模拟失重组(SUS)与同步对照组(CON), 每组24只。模拟失重按陈杰等[7]的方法进行。模拟失重4 周后, 两组大鼠又分别被随机划分为3个小组: 即常温组(CON-E, SUS-E), 热应激并在25℃恢复1 h组(CON-H1, SUS-H1), 以及热应激并在25℃恢复2 h组(CON-H2, SUS-H2) 。热应激模型按Qian等[8]的方法进行。先由腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)将动物麻醉, 再将数字温度计的探头插入大鼠结肠内约6 cm, 记录此时的结肠温度。随后将动物置于舱温43±0.5℃、湿度20%的动物高温舱内, 待结肠温度升至42℃时, 维持该结肠温度15 min, 然后再将动物取出, 置于室温(25℃)恢复1 h或者2 h。常温组大鼠麻醉后, 置于舱外室温下。

1.2　心肌与血管组织HSP72 mRNA的Northern杂交分析[9]取麻醉大鼠左室心肌组织、 脑基底动脉和双侧股动脉, 提取总RNA。实验用含人HSP72 cDNA的质粒(第四军医大学消化内科郭建成博士惠赠)。质粒经转化、扩增及抽提后, 用BamHⅠ与PstⅠ两种酶内切, 经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.2 kb 片断作为探针。用Promega公司的随机引物标记试剂盒进行同位素标记。18S rRNA寡核苷酸探针由上海生工生物工程公司合成。用Sigma公司的寡核苷酸探针标记试剂盒进行同位素标记。α-32P dATP与γ-32P ATP由北京福瑞生物工程公司合成。探针放射比活度大于1×108 cpm/μg DNA。本实验提取的组织总RNA OD260/OD280 nm 的比值均大于1.8。总RNA电泳上样量为20 μg。用毛细吸印法将RNA转移到硝酸纤维素膜, 进行预杂交、杂交与放射自显影。将HSP70 探针杂交过的滤膜置于20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA (pH 8.0), 0.1% SDS溶液中, 在65℃下20 min洗去已杂交上去的HSP70 探针, 然后再与18S rRNA探针杂交, 进行放射自显影。

1.3 心肌与血管组织HSP70的Western印迹分析[9]取上述组织, 分别加入62.5 mmol/L Tris 溶液(pH 6.8), 玻璃匀浆器制备匀浆。在匀浆液中加等体积的2倍样品缓冲液(0.125 mol/L Tris-HCl, 4% SDS, 2% β-巯基乙醇, 20%甘油, 0.2%溴酚蓝, pH 6.8)。样品煮沸10 min, 14?000 g×5 min离心, 取上清。取10 μl样品进行SDS-PAGE电泳, 电泳完成, 进行电转移。 将转移后的NC膜用TTBS封闭。 加入小鼠抗HSP70单抗(与HSP72和HSP73抗原均能结合, 1∶5?000 稀释, Sigma公司)。加入羊抗小鼠IgG抗体(1∶2?000 稀释, DARKO公司)。ABC法显色。其间均用TTBS洗膜10 min×3次。

1.4 HSP72 mRNA与HSP70蛋白带扫描与半定量分析采用Kodak图像分析系统对Northern杂交 与Western印迹分析结果进行分析, HSP72 mRNA及HSP分别由18S rRNA及actin归一化处理。所有数据以S表示, 两组间比较采用t检验, P＜0.05被认为具有显著性差别。

 

2结果

2.1 大鼠体重及热暴露时结肠温度的变化

 模拟失重4周后, 模拟失重与对照大鼠的最终体重无显著差别(P>0.05)。热暴露前、后大鼠结肠温度无显著差别(P>0.05)。在热应激过程中, 模拟失重与对照大鼠结肠温度上升速率以及在室温下

 

表 1.大鼠的最终体重、热暴露前后的结肠温度(Tc)及其变化率

Table 1.Final body weight, colonic temperature (Tc) and its changing rate during and after heat exposure in rats

[]Final body

weight (g)[]Tc(℃)Before[]After[][]Rate of Tc changes (℃/min) duringheat exposure[]recoveryControl[]295.7±17.3[]36.8±0.5[]42.3±0.2[][]0.088±0.005[]－0.097±0.0064-wk suspension[]310.3±23.1[]36.7±0.6[]42.1±0.4[][]0.093±0.005[]－0.106±0.008Values are mean±SE, n=24 rats per group.

 

恢复时的结肠温度下降速率亦无显著差别(P>0.05) (表1)。

2.2 大鼠心肌与血管组织HSP72 mRNA表达的变化

未经热应激的CON-E与SUS-E大鼠的心肌组织均不表达HSP72 mRNA。经热应激的对照(CON-H)与模拟失重大鼠(SUS-H)心肌组织均表达HSP72 mRNA。SUS-H1大鼠心肌HSP72 mRNA的表达水平较CON-H1大鼠无显著差别。但SUS-H2大鼠心肌HSP72 mRNA的表达水平较CON-H2大鼠显著降低(P<0.05)(图1)。

 

图1.心肌、基底动脉(BA)与股动脉(FA)组织HSP72 mRNA的表达

Fig. 1.HSP72 mRNA expression in myocardium, femoral (FA) and basilar (BA) arteries of rats. A. HSP72 mRNA as shown by Northern hydridization.  B. 18S rRNA by Northern blot. C. HSP72 mRNA was normalized with 18S rRNA by Northern blot. E.  Euthermic control group.  H1 or H2,  groups heat stressed followed by euthermic recovery for 1 h or 2 h. Vertical bars represent 1 SE. n=4 per each group.~*P<0.05 vs CON-H2; ~+P<0.05, vs CON-H1.

 

CON-E与SUS-E大鼠股动脉与基底动脉均不表达HSP72 mRNA。CON-H与SUS-H大鼠股动脉及基底动脉组织均表达HSP72 mRNA。与CON-H1大鼠相比较, SUS-H1大鼠股动脉组织HSP72 mRNA表达有降低趋势, 但差别未达到显著水平。与CON-H1大鼠相比, SUS-H1大鼠基底动脉HSP72 mRNA的表达水平显著增加(P<0.05)(图1)。

2.3 大鼠心肌与血管组织HSP70表达的变化

CON-E与SUS-E大鼠的心肌组织均表达HSP73, 而HSP72则仅有少量表达。CON-H与SUS-H大鼠心肌组织的HSP73表达并无显著变化, 但HSP72的表达却显著增加。与相应对照大鼠相比, SUS-H1与SUS-H2大鼠心肌组织HSP72的表达水平呈降低趋势, 但差别均未达到显著程度(P>0.05)(图2)。

CON-E与SUS-E大鼠的股动脉组织均不表达HSP73, 而基底动脉组织仅表达少量HSP73; 两者也均不表达HSP72。SUS-H2与CON-H2大鼠股动脉与基底动脉组织均表达HSP72。与CON-H2相比, SUS-H2大鼠基底动脉组织HSP72的表达显著增加(P<0.05); 而股动脉组织HSP72的表达则呈降低趋势, 但差别未达到显著水平(图2)。

 

3讨论

HSP70为热休克蛋白的一个家族, 包括结构型(HSP73)与诱导型两类蛋白(HSP72)。HSP70与细胞内许多蛋白质肽链的折叠、伸展、 组装和拆卸、 以及

 

图2.心肌、基底动脉(BA)与股动脉(FA)组织HSP70 (HSP72, HSP73)的表达

Fig. 2.HSP70 (72, 73) expression in myocardium, femoral (FA) and basilar (BA) arteries in rats. A.  Total proteins from tissues of left myocardium, basilar and femoral arteries were subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie bright blue. B. The same fractions were subjected to Western blot analysis with monoclonal HSP70 recognizing HSP72 and HSP73. C.  Relative amounts of HSP70 (HSP72, HSP73) normalized with actin. Note: E, euthermic control group; H1 or H2, groups heat stressed followed by euthermic recovery for 1 h or 2 h. Vertical bars represent 1 SE.  n=4 per each group. ~*P<0.05, vs H1; ~+P<0.05, vs CON-H2.

 

蛋白质在细胞内的运转等有关[10]。 高表达的 HSP72具有心肌保护作用[11]。

模拟失重4周后, 模拟失重与对照大鼠体重无显著差别, 而且未经热应激的对照与模拟失重大鼠的心肌、基底动脉及股动脉组织均不表达HSP72 mRNA, 表明模拟失重本身并不诱导大鼠心肌、血管组织表达HSP70。以上与Amann等[12]报道搭乘COSMOS 2044生物卫星失重14 d大鼠的睾丸不表达HSP72 mRNA有相似之处。

热应激时, 大鼠组织HSP72 mRNA的诱导表达随大鼠结肠温度的升高而增加, 大鼠结肠温度上升速率越快, 组织HSP70的诱导表达量越多, 温度对组织的损伤也越大[13]。 运动能加快大鼠体内温度的上升速率。本实验先采用戊巴比妥钠麻醉大鼠, 再放入高温舱内, 从而有效地防止了活动对结肠温度上升速率的影响。本实验观察到热应激时两组大鼠结肠温度上升速率无显著差别, 其最高结肠温度都被控制在42℃, 且均维持15 min, 然后再被置于相同的室温下恢复1 h或2 h, 最后处死取材。以上步骤完全排除了大鼠体温因素方面任何差异对HSP70表达的影响。

Cornelussen等[14]报道, 缺血前的热应激预处理可使成年大鼠缺血后的功能恢复到缺血前的60%以上; 而在老年大鼠却不到40%。他们认为这种功能恢复上的差异可能与老年大鼠心肌组织热应激时产生HSP的效率较低及数量较少有关。对老年大鼠和成年大鼠分离的肝细胞研究表明, 随着年龄的增长, 热应激诱导表达的HSP70几乎减少了50%。HSP70减少出现在转录水平, 可能是由于热休克蛋白转录因子缺陷所致[5]。其他研究者发现, 人体单核细胞以及大鼠各种组织在热应激或其它应激时HSP70的表达能力, 均随老龄而下降。因此, 应激时HSP70表达能力下降可能是机体衰老过程的普遍规律之一[5]。本实验观察到, 模拟失重大鼠心肌组织在热应激下HSP70表达下降, 且也出现在转录水平。我室发现长期模拟失重大鼠发生心肌细胞内脂褐素数量增多[2], 以及心肌Ⅰ、Ⅲ胶原间质增多[3]等改变, 均提示模拟失重可导致大鼠心肌发生类似衰老时的改变。

 本实验室曾发现, 模拟失重可引起大鼠不同部位的大、中动脉血管发生性质相反的适应性结构与功能变化[6]。血管组织HSP诱导表达是否也有分化性改变? 这自然引起极大关注。“限动”可引起大鼠主动脉血管组织表达HSP70, 但随着年龄的增加, 这种表达水平逐渐下降。将成年与老年大鼠主动脉血管相互移植后, 发现“限动”时, 移植于老年大鼠体内的成年大鼠主动脉HSP70表达下降, 而移植于成年大鼠体内的老年大鼠主动脉HSP70表达增加, 表明血管所在的环境决定了其对应激的分子反应机制[15]。本工作发现, 未经热应激大鼠的基底动脉组织有少量HSP72表达, 而股动脉组织全然没有表达。热应激后, 基底动脉组织的HSP72 mRNA及HSP70的表达均显著增加; 而在股动脉组织, 则两者均呈降低趋势。这种对应激反应的部位差异性可能与其所处血流动力学环境的不同有关[6]。

总之, 模拟失重导致大鼠在热应激时心肌组织HSP70的诱导表达下降, 提示模拟失重可能导致大鼠心肌发生类似衰老性的改变。此外, 模拟失重还导致大鼠脑与后肢部位血管HSP70的诱导表达分别为增加与降低, 与血管分化性适应变化趋势相符。

 

***衷心感谢第一军医大学南方医院消化内科肖冰副教授, 第四军医大学生化教研室吴元明硕士以及西京医院消化内科尹芳硕士在实验中所给予的帮助!

 

参考文献

[1]Zhang LF, Yu ZB, Ma J. Functional alterations in cardiac muscle after medium- or long-term simulated weightlessness and related cellular mechanisms. J Gravit Physiol, 1995,  2(1): 5~8.

[２]Chen J (陈 杰), Zhang LF (张立藩), Ma J (马 进) et al. Ultrastructural changes of myocardium in long-term tail-suspended rats. Chin J Aviat Med (中国航空医学杂志), 1995,  6(3):133~137 (Chinese, English abstract).

[３]Liu C (刘 春), Zhang LF (张立藩), Mao QW (毛秦雯) et al. Changes of typeⅠand type Ⅲ collagens in rat myocardium after medium- or long-term simulated weightlessness. Chin J Aerospace Med (中华航空航天医学杂志), 2000,  11(1):39~42 (Chinese， English abstract).

[４]Timiras PS. Disuse and aging: same problem, different outcomes. J Gravit Physiol, 1994,  1(1): 5~7.

[５]Heydari AR, Takahashi R, Gutsmann A et al. Hsp70 and aging. Experientia, 1994,  50(11-12): 1092~1098.

[６]Zhang LF, Ma J, Mao QW et al. Plasticity of arterial vasculature during simulated weightlessness and its possible role in the genesis of postflight orthostatic intolerance. J Gravit Physiol, 1997,  4(2): P97~P100.

[７]Chen J (陈　杰), Ma J (马　进), Ding ZP (丁兆平) et al. A modified tail-suspension model for simulating long-term weightlessness. Chin J Space Sciences (中国空间科学学报), 1993,   13(2):159~162 (Chinese，  English abstract).

[８]Qian YZ, Bernardo NL, Nayeem MA et al. Induction of 72-kDa heat shock protein does not produce second window of ischemic preconditioning in rat heart. Am J Physiol, 1999,  276(Heart Circ Physiol, 45): H224~H234.

[９]Sambrook T, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd rev. ed. New  York: Cold Spring Laboratory Press, 1989．

[1０]Huber JJ, Mestril R, Tam EK et al. Overexpression of heat shock protein 72 in transgenic mice decreases infarct size in vivo. Circulation, 1996,  94: 1408~1411.

[１1]Donnelly TJ, Sievers RE, Vissern FL et al. Heat shock protein induction in rat hearts: a role for improved myocardial salvage after ischemia and reperfusion? Circulation, 1992,  85: 769~778.

[1２]Amann RP, Deaver DR, Zirkin BR et al. Effects of microgravity or simulated launch on testicular function in rats. J Appl Physiol, 1992,  73(2 Suppl): 174S~185S.

[1３]Flanagan SW, Ryan AJ, Gisolfi CV et al. Tissue-specific HSP70 response in animals undergoing heat stress. Am J Physiol, 1997,  273(3 Pt 2): H1333~H1341.

[1４]Cornelussen RN, Garnier AV, Vork MM et al.  Heat stress protects aged hypertrophied and nonhypertrophied rat hearts against ischemic damage. Am J Physiol, 1997,  273(3 Pt 2): H1333~H1341.

[1５]Udelsman R, Li DG, Stagg CA et al. Aortic crosstransplantation between young and old rats: effect upon the heat shock protein 70 stress response. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 1995,  50(4): B187~B192.