Received 2000-07-18  Accepted 2000-11-16

*Present address: Emergency Center of Hebei Province People′s Hospital, Shijiazhuang  050051

*Corresponding author. Tel: 010-62373130, 010-63051167; E-mail: niuwz@public3.bta.net.cn

生理学报, Apr. 2001, 53  (2): 158~162

Acta Physiologica Sinica

 

氨基甙类抗生素对家兔离体颈动脉窦压力感受器放电的抑制作用

刘东霞*, 钮伟真**, 沈靖

(首都医科大学心血管研究室,  北京  100054)

 

摘要:  实验用自制的压力感受器标本灌流-记录一体化装置, 研究氨基甙类抗生素、胞外钙离子浓度变化和L-型钙通道拮抗剂对家兔离体颈动脉窦压力感受器活动(CS-BRA)的影响。研究中发现,  (1)链霉素(0.25~0.75 mmol/L)和庆大霉素(0.43~1.29 mmol/L)浓度依赖性地抑制CS-BRA, 停药后可基本恢复; (2)高钙灌流液(3.3 mmol/L)抑制CS-BRA, 而微量钙灌流液(10－５ mol/L数量级)兴奋CS-BRA; (3)维拉帕米和地尔硫在选择性阻断L-型钙通道的有效浓度范围内(<10－７ mol/L)对CS-BRA没有显著影响, 在更高浓度(>10－６ mol/L)时, 则抑制CS-BRA。结果表明: (1)氨基甙类抗生素特异性地抑制CS-BRA, 是一种新的研究压力感受器活动的工具药; (2)钙离子不是形成压力感受器发生器电位的主要离子, 而且L-型钙通道在CS-BRA中没有显著作用; (3) 氨基甙类抗生素对CS-BRA的抑制作用可能不是通过阻断L-型钙通道实现的。

 

关键词: 压力感受器; 氨基甙类抗生素; 钙; L-型钙通道阻断剂

学科分类号:  Q463

 

Inhibitory effect of aminoglycoside antibiotics on rabbit carotid baroreceptor activity in vitro

LIU Dong-Xia*, NIU Wei-Zhen**, SHEN Jing

(Department of Cardiovascular Physiology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054)

 

Abstract:   The present study was to investigate the effects of aminoglycoside antibiotics, changes in extracellular Ca2+ concentration and antagonists of L-type Ca-channels on the activity of rabbit carotid sinus baroreceptors (CS-BRA) in isolated and superperfused  carotid sinus-carotid sinus nerve (CS-CNS) preparations, using extracellular recording technique. The results are as follows. (1) Streptomycin (0.25~0.75 mmol/L) and gentamycin (0.43~1.29 mmol/L) inhibited CS-BRA in a dose-dependent manner, which recovered after the drugs were washed out. (2) Perfusion with high Ca2+ (3.3 mmol/L) solution inhibited CS-BRA, while perfusate with trace Ca2+ (in the order of 10－５ mol/L) increased it. (3) Verapamil and diltiazem had no effect on CS-BRA at a concentration of 10－７mol/L, but inhibited it at higher concentrations (>10－６ mol/L). These results suggest: (1) aminoglycoside antibiotics can inhibit CS-BRA specifically, thus providing a new tool for the study of baroreceptors; (2) calcium ions are not necessary for producing generator potentials of baroreceptors, and the L-type calcium channel does not seem to be involved in CS-BRA per se; and (3) the inhibitory effects of aminoglycoside antibiotics on CS-BRA may not be related to the blocking of L-type calcium channels.

 

Key words:  baroreceptor; aminoglycoside antibiotics; calcium, antagonists of L-type calcium channel

 

动脉压力感受器(BR)是分布于主动脉弓和颈动脉窦血管壁上的感觉神经末梢,其结构细微分散[1],难于从通道水平研究。许多学者认为, BR的换能过程是通过某种机械敏感离子通道(MSIC)实现的[2~4]。MSIC存在于许多组织中, 如耳蜗毛细胞、心室肌细胞等。 研究表明, 氨基甙类抗生素可阻断MSIC, 其机制可能与阻断牵张引起的Ca2+内流有关[5,6]。另外, 有人报道氨基甙类抗生素可抑制L-2期刘东霞等: 氨基甙类抗生素对家兔离体颈动脉窦压力感受器放电的抑制作用生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷型Ca2+通道[7]。 最近, 尹彤[8]等报道链霉素对大鼠压力感受性反射有抑制作用,  然而, 有关氨基甙类抗生素对BR机械-电转导过程的直接作用, 尚未见报道。为进一步研究BR的机械-电转导机制, 本实验在家兔离体颈动脉窦-窦神经(CS-CSN)标本上, 研究了氨基甙类抗生素对压力感受器活动(BRA)的影响, 并探讨其换能过程与钙离子的关系。

成年家兔40只(体重1.9~2.7 kg, 雌雄不拘)经静脉麻醉(1%戊巴比妥钠, 40 mg/kg体重)、暴露颈动脉窦区、静脉注射肝素(500 U/kg体重)抗凝等步骤后, 游离CS-CSN标本[9]。研究采用自制的CS-CSN标本灌流-记录一体化装置[9], 该装置设有灌流槽和记录槽。CS-CSN标本的血管部分置于灌流槽内, 窦神经的游离部分经两槽间隔板上的小孔穿出, 搭在位于记录槽的不锈钢丝记录电极上。记录槽内充石蜡油。无关电极置于灌流槽底。灌流液经两条途径对标本分别进行窦内和窦外灌流[9]。一路对标本表面(窦外)以1 ml/min匀速灌流;另一路则经蠕动泵对窦内(血管内)进行脉动式灌流, 该路灌流压由灌流液出口处的调节阀控制并由连于入口处的压力换能器监测。窦内灌流压搏动频率(取决于蠕动泵转速)为108次/min, 搏动幅度控制在13.2~18/8~12 kPa。对每个标本在用药前后保持灌流压在相同搏动范围内。灌流液温度控制在36~37℃。

窦神经放电活动通过单极记录法引导[9], 信号经前级(JB-101J, Nihon Konden)及后级放大滤波(FZG-81, 上海嘉龙教学仪器厂), 电压总增益为20?000倍, 频带0.16~10 kHz。放大后的信号分三路: (1) 输入示波器, 显示原始信号; (2) 输入生物信号处理系统(SMUP-A型, 上海医科大学), 对超过某一指定幅值的放电自动进行频率直方图处理; (3)输入磁带记录仪(DX-900型, TOSHIBA CORPORATION)。颈动脉窦窦内压信号经二道生理记录仪(LMS-2B型, 成都仪器厂)放大及描记压力曲线, 并与窦神经放电信号同步记录于磁带记录仪。磁带信号可回放输入另一信号采集分析系统(Axoscope, Axon Instruments)进一步分析。

将窦神经分至细束, 可分别记录到单纤维、少纤维和多纤维放电。具有单一形状和幅值动作电_坏姆诺缥ハ宋诺?single-fiber discharge); 如放电中包含有2~5个不同形状的动作电位称为少纤维放电(few-fiber discharge); 放电记录中不同形状及幅度的动作电位超过五个, 则视为多纤维放电(multi-fiber discharge)。对单纤维和少纤维放电, 通过观察放电与窦内压搏动的一致关系, 可判定放电的性质; 对于多纤维放电, 除确定放电与窦内压的关系外, 还观察标本对纯氮平衡的灌流液灌流10 min或对氰化钠(125 μg)窦内注射的反应, 以排除化学感受纤维放电的参与。

灌流液成分为: (1) 普通灌流液(mmol/L): NaCl 154, KCl 4.7, CaCl2 2.2, MgCl2 1.1, glucose 5.5; (2) 高钙灌流液: 除CaCl2为3.3 mmol/L外, 其余成分同普通灌流液; (3)微量钙灌流液: 配制过程中不加CaCl2, 其余成分同普通灌流液。对此溶液以原子吸收分光光度法(GBC-902型原子吸收分光光度计, GBC科学仪器公司)检测, 确定其中Ca2+浓度在10－５ mol/L数量级(22±3 μmol/L, n=3)。以上灌流液均以HEPES-NaOH (5 mmol/L)调节pH值(Model 5986-62, Cole-Parmer Instrument Company), 使之在37℃时为7.40~7.43。除有特殊说明外, 灌流液均持续以100% O2平衡, 其表面覆盖厚层石蜡油, 以隔绝灌流液与气之间的气体交换。

实验经窦内途径给药, 观察分两部分。(1) 分别用含硫酸链霉素(0.25~0.75 mmol/L,华北制药股份有限公司)和硫酸庆大霉素(0.43~1.29 mmol/L, 青岛金峰制药有限公司)的灌流液对标本进行窦内灌流, 观察窦神经放电的变化。为排除pH变化的影响, 灌流前将含药灌流液pH值标定至7.40~7.43, 灌流时间为3~5 min。(2)分别观察微量钙(10－５ mol/L数量级)、高钙(3.3 mmol/L)灌流液以及L-型钙通道拮抗剂维拉帕米、地尔硫 (10－8~10－６ mol/L, Sigma公司)对BRA的影响, 以分析BR机械-电转导过程对Ca2+及L-型钙通道的依赖关系。数据均以给药前基础放电水平为100%, 将所有反应数据标准化, 以mean±SD表示, 分别进行配对或非配对 t 检验。

依次以含链霉素(0.25、0.50和0.75 mmol/L)、庆大霉素(0.43、0.86和1.29 mmol/L)的灌流液对标本进行窦内灌流3~5 min。经2~3 min (潜伏期)后, 可见窦神经放电被不同程度抑制(表1), 以对照灌流液冲洗10~15 min后, 放电可大部分恢复, 但仍低于对照水平(图1)。链霉素和庆大霉素使每个搏动周期中单纤维放电的脉冲数减少, 而对动作电位的形状和幅度没有影响(图1B、C)。

用高钙灌流液(3.3 mmol/L)进行窦内灌流, 11例标本的放电均被抑制(图2A、C), 潜伏期为1~2 min, 平均给药时间为2~3 min, 放电减少为对照水平的(56.9±15.4)%。用微量钙灌流液灌流标本后, 13例标本均产生明显的兴奋性反应(图2B、C), 放电增加为原来的(219.9±19.0)%, 同时, BRA的模

 

图1.不同浓度链霉素对颈动脉窦压力感受器放电的影响

Fig. 1.Effects of various concentrations of streptomycin on carotid baroreceptor discharge.A. Histogram of a single-fiber discharge showing the discharge frequency of sinus nerve fiber (CSND) during control (a) after application of streptomycin (b, 0.25 mmol/L and e, 0.5 mmol/L) and after washout (c, d, and f). The open and closed bars denote the applications of streptomycin (0.25 and 0.5 mmol/L). The bin time was 5 s. B and C were six pieces (a, b, c, d, e and f) of expanded records (CSND) chosen at the time marked with correspondent letters in A. Intrasinus pressure (ISP) was recorded with CSND synchronously.

 

表 1.氨基甙类抗生素对窦神经放电的影响

Table 1.Effects of aminoglycoside antibiotics on CSND

[] Streptomycin (mmol/L) 0.25 []  0.50 [] 0.75[][]  Gentamycin (mmol/L) 0.43 [] 0.86  [] 1.29n  []7  [] 6 [] 5[][] 8 [] 7 [] 6Control (%) [] 100 [] 100 [] 100 [][] 100 [] 100 [] 100Response (%) [] 89.3±1.4* []77.0±2.1* [] 63.0±2.8* [][] 83.6±1.2* []63.8±2.2* []53.1±1.9*Mean±SD.  n, number of CS-CSN preparations. Control and response, normalized discharge frequency during control and after treatment respectively.  P<0.0001, response vs control. ~*P<0.001, compared with each other in the streptomycin and gentamycin groups respectively.

 

式由簇状放电转变为近似连续形式, 这反映了BR的兴奋阈值明显下降(图2B)。当胞外钙离子浓度由微量或高浓度转换到对照浓度时, 放电均可完全恢复。

分别用含维拉帕米或地尔硫 (10－8~10－６ mol/L)的溶液灌流标本, 发现这两种药物在低浓度(<10－７ mol/L)条件下灌流15 min, 不影响窦神经放电(图略); 而在药物浓度增至10-6 mol/L, 经3~5 min可使放电减少, 洗脱后放电能部分恢复; 更高浓度维拉帕米(2.5、5.0和7.5 μmol/L)或地尔硫 (2.5、5.0和7.5 μmol/L)使窦神经放电进一步减少(图3，表2), 个别标本在2.5 μmol/L钙拮抗剂作用下可完全被抑制。

 Sullivan 等[10] 在研究用药物标记的 BR 神经元

 

图2.细胞外钙离子浓度变化对CS-BRA的影响

Fig. 2.Effects of changing extracellular Ca2+ concentration on carotid baroreceptor activity.A and B were chosen from a continuous record in a few-fiber preparation. A. Ca2+ concentration in perfusate was changed from 2.2 (a, control) to 3.3 (b) mmol/L and then returned to 2.2 (c, washout) mmol/L. b was the record at 3 min after application of high Ca2+ perfusate. B. Free Ca2+ in perfusate was changed from 2.2 mmol/L (d) to the order of 10－５ mol/L (e) and then back to 2.2 mmol/L (f). e was recorded at 2.5 min after application of trace-Ca2+ perfusate. C is a statistical histogram of baroreceptor discharge at free Ca2+ concentrations of 2.2 (□, control) and 3.3 (■, n=11) and in the order of 10-5 mol/L (, n=13) in perfusate.

*P<0.05 vs control.

 

图3.高浓度地尔硫 对颈动脉窦BR放电的影响

Fig. 3.Effects of diltiazem on CS-BRA at higher concentrations. Increasing diltiazem concentration from 2.5 (□,  a) to 5.0 (■, b) and 7.5 μmol/L (, c) inhibited CS-BRA dose-dependently. Bin time, 5 s. ISP, 15.6/10.8 kPa.

 

时, 发现机械刺激导致细胞内游离钙浓度升高, 这一结果提示, BR上可能存在钙选择性牵张激活的离子通道。然而, Andresen等[3]发现: 细胞外高钙使大鼠主动脉弓BR放电频率下降, 而胞外低钙的作用相反。当胞外Ca2+浓度降为零时, BR仍保持对压力搏动的敏感性以及高频率的放电。为此, 本文应用家兔离体颈动脉窦-窦神经标本, 再次研究了钙离子在BRA中的地位, 所得结果与Andreson一致, 都说明Ca2+不是形成BR发生器电位的主要离子。 作者认为Sullivan等对BR神经元的牵张刺激是否能等同于对神经末梢即对BR的刺激还值得进一步研究。

有关L-型钙拮抗剂对BRA的影响, Heesch等[11]和Kunze等[12]曾先后进行了研究, 共同的结论是: L-型钙通道阻断剂在选择性阻断L-型钙通道的有效浓度下(10-7 mol/L), 对BRA没有影响, 而高浓度时可抑制BRA。本文用不同灌流方式得到与之

 

表 2.L-型钙拮抗剂对CS-BRA的影响

Table 2.Effects of L-type calcium antagonists on CSND

[]  Verapamil (μmol/L)   2.5 []  5.0 [] 7.5[][] Diltiazem (μmol/L) 2.5 []  5.0 [] 7.5n   [] 9 []  8[]   6 [][] 7 []  7 []    5Control (%) []  100 []  100 []   100 [] []  100 []   100  [] 100Response (%) []77.6±1.7* []66.6±2.8* []47.3±5.3* [][]83.3±1.9* []69.9±1.6* []40.5±3.5* Mean±SD. n, number of CS-CSN preparations. Control and response, normalized discharge frequency during control and after treatment respectively.  P<0.0001, response vs control; ~*P<0.001, compared with each other in the verapamil and diltiazem groups respectively.

 

基本一致的结果。有实验表明, 高浓度钙拮抗剂还可减少钠内流或其它离子电流[11,13]。 因此, 本文认为钙通道拮抗剂对BR的抑制作用不是通过阻滞L-型钙通道实现的, 而高浓度钙拮抗剂的作用可能是非特异性的。

综合钙离子和钙拮抗剂影响BRA的有关研究成果, 我们认为Ca2+不是形成BR发生器电位所必需的离子, 换言之, BR的机械-电转导过程不是通过Ca2+选择性离子通道完成的。

许多学者认为BR的机械-电转导过程是通过MSIC实现的[2，3]。Gd3+作为一种牵张激活离子通道的阻断剂, 已被广泛用于多种MSIC的研究, 也被用于对BR和压力感受神经元的研究[14，15]。然而许多实验表明, Gd3+对其他通道(L-型钙通道、电压依赖性Na+或K+通道等)也有作用[16~18], 其作用的发挥至少需30 min, 这在很大程度上限制了该类药物在BR研究上的应用。氨基甙类抗生素也曾被用于研究MSIC。Gannier等[6]发现链霉素可快速逆转牵张心室肌细胞所致的胞内Ca2+浓度的上升。 Winegar[19]发现, 氨基甙类抗生素结合在骨骼肌细胞的MSIC入口处, 使通道处于亚电导状态, 减少通道的开放时间常数。有研究还表明, 氨基甙类抗生素(链霉素和新霉素)可阻滞鸡前庭毛细胞的MSIC[5]。然而, 有关氨基甙类抗生素对BR的作用则报道较少。尹彤等[8]报道链霉素对大鼠压力感受性反射有抑制作用, 本实验进一步从感受器水平证实氨基甙类抗生素可抑制颈动脉窦BR的放电活动, 其作用发生快(3~5 min), 抑制程度与药物浓度相关, 停药可恢复。与镧系元素Gd3+对BR的作用相比, 氨基甙类抗生素的作用发生得更快, 而且恢复得也快。但从对其他组织的研究结果来看, 氨基甙类抗生素同样表现出对L-型Ca2+通道的抑制作用[7]。如上所述, 由于Ca2+不是形成BR发生器电位所必需的离子, Ca2+内流对BR机械-电转导过程不是必要的。 因此, 作者认为氨基甙类抗生素作为一种研究MSIC的工具药, 对颈动脉窦BRA的抑制作用不是通过抑制钙内流实现的。

 

参考文献

[1]Andresen MC, Yang M. Gadolinium and mechanotransduction of rat aortic baroreceptors. Am J Physiol, 1990,  262: H1415~H1421.

[２]Hajduczok G, Mark MW.  Gadolinium inhibits mechanoelectrical transduction in rabbit carotid baroreceptors. Implication of stretch-activated channels. J Clin Inves, 1994,  94: 2392~2396.

[３]Andresen MC, Kunze DL. Ionic sensitivity of baroreceptors. Circ Res, 1987,  61(4 Pt 2): I66~I71.

[４]Cunningham JT, Wachtel RE, Abboud FM. Mechanosensitive currents in putative aortic baroreceptor neurons in vitro. J Neurophysiol, 1995,  73(5): 2094~2098.

[５]Omori H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. J Physiol, 1985,  359: 189~217.

[６]Gannier F. Streptomycin reverses a large stretch induced increase in [Ca2+]i in isolated guinea pig ventricular myocytes. Cardiovasc Res, 1994,  28(8): 1193~1198.

[７]Haws CM, Winegar BD, Lansman J. Block of single L-type Ca2+ channels in skeletal muscle fibers by aminoglycoside antibiotics. J Gen Physiol, 1996,  107: 421~432.

[８]Yin T (尹 彤), Chen S (陈 爽), He RR (何瑞荣). Streptomycin inhibits sinus baroreflex in anesthetized rats. Acta Physiol Sin(生理学报), 2000,  52(3): 239~242　(Chinese， English abstract).

[９]Xia LY (夏林英), Niu WZ (钮伟真), Shen J (沈 靖) et al. Effects of NO and endothelium on carotid baroreceptor activity. Acta Physiol Sin (生理学报), 1998,  50(6):611~617　(Chinese， English abstract)．

[1０]Sullivan MJ, Sharma RV, Wachtel RE et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons． Circ Res, 1997,  80(6): 861~867.

[１1]Heesch CH, Miller BM, Thames MD et al. Effects of calcium channel blockers on isolated carotid baroreceptors and baroreflexes. Am J Physiol, 1983,  245: H653~H661.

[1２]Kunze DL, Andresen MC, Torres LA. Do calcium antagonists act directly on calcium channels to alter baroreceptor function? J Pharmacol Exp Ther, 1986,  239(2):303~310.

[1３]Saikowa T, Nagamoto Y, Arita M. Electrophysiologic effects of diltiazem, a new slow channel inhibitor on canine cardiac fibers. Jpn Heart J, 1977,  18: 235~245.

[1４]Hajduczok G, Mark MW. Gadolinium inhibits mechanoelectrical transduction in rabbit carotid barorecetors. Implication of stretch-activated channels. J Clin Inves, 1994,  94: 2392~2396.

[1５]Cunningham JT, Wachtel RE, Abboud FM. Mechanosensitive currents in putative aortic baroreceptor neurons in vitro. J Neurophysiol, 1995,  73: 2094~2098.

[1６]Lacampagne A, Gannier F, Argibay J et al. The stretch-activated ion channel blocker gadolinium also blocks L-type calcium channels in isolated ventricular myocytes of the guinea pig. Biochim Biophys Acta, 1994,  1191: 205~208.

[1７]Biagi BA, Enyeart JJ. Gadolinium blocks low and high threshold calcium currents in pituitary cells. Am J Physiol, 1990,  259(3 Pt 1): C515~C520.

[1８]Elinder F, Arhem P. Effects of gadolinium on ion channels in the myelinated axon of Xenopus laevis: four sites of action. Biophys J, 1994,  67(1):84~90.

[1９]Winegar BD, Haws CM, Lansman JB. Subconductance block of single mechanosensitive ion channels in skeletal muscle fibers by aminoglycoside antibiotics. J Gen Physiol, 1996,  107: 433~443.