生理学报, Aug. 2001,
53 (4): 261～264
Acta Physiologica Sinica
大鼠脑线粒体NOS及L-Arg转运的生化特性
曹军1,4, 王蕾2, 赵保路3, 陈清棠2, 齐永芬1, 唐朝枢1,*
(1北京大学第一医院心血管研究所,
2北京大学第一医院神经研究中心, 北京 100034;3中国科学院生物物理研究所, 北京 100101; 4宁夏医学院病理生理教研室, 银川 750004)
摘要: 测定分离纯化的大鼠脑线粒体(mitochondria, Mt)L-精氨酸(L-arginine,
L-Arg)/一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)/NO系统, L-Arg转运和NOS的活性。结果显示: 正常大鼠脑Mt膜上存在高亲和、
低转运、 可饱和的L-Arg转运体。最大转运速率Vmax为5.87±0.46 nmol/mg pro·min－１, 米氏常数Km为7.8±0.56 μmol/L。大鼠脑Mt在正常状态下仅有内皮型NOS
(eNOS)表达。eNOS的最大活化速率Vmax为2.7±0.30 nmol/mg pro·min－1, Km为20.85±3.27 μmol/L。Mt生成和释放NO-2
随孵育时间延长而增加, 60 min达峰值。结果提示, 正常大鼠Mt膜上存在L-Arg转运体, 该转运体与细胞膜上Y+ 型氨基酸转运体相一致; Mt NOS属eNOS.
Mt L-Arg/NOS/NO系统是细胞NO产生的来源之一。
关键词: 线粒体; 一氧化氮; L-精氨酸; 一氧化氮合酶;
脑
学科分类号: Q731
The biochemical properties of L-arginine/nitric oxide pathway in rat brain mitochondria
CAO
Jun1,4,WANG Lei2,ZHAO Bao-Lu3,CHEN Qing-Tang2,QI Yong-Fen1,TANG Chao-Shu1
(1Institute
of Cardiovascular Diseases and 2Center of Neurology Research,The First
Hospital, Peking University, Beijing 100034;
3Institute
of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101;
4Department
of Pathophysiology, Ningxia Medical College, Yinchuan 750004)
Abstract: Biochemical property of L-arginine (L-Arg)/nitric oxide
synthase (NOS)/nitric oxide (NO) system was observed in rat brain mitochondria.
The results showed that there existed L-Arg transporters of high-affinity,
low-transport and saturability in
mitochondria membrane of
normal rat brain. The maximum transport velocity (Vmax) and Michaelis
constant (Km) were 5.87±0.46 nmol/mg pro·min－１ and 7.8±0.56 μmol/L
respectively. In normal condition, endothelium-type NOS was expressed in the
mitochondria of rat brain, with its Vmax and Km being 2.7±0.3 nmol/mg pro·min－１
and 20.85±3.27 μmol/L, respectively. NO production was increased in a time-dependent
manner and reached a maximum value at 60 min. These results suggest that the
L-Arg transporters in MT membrane of normal rat brain were similar with Y+ type
amino acid transporters in cellullar membrane. Furthermore the NOS of mitochondria belongs to eNOS, whereas the
L-Arg/NOS/NO system may be a source of NO.
Key words: mitochondria; nitric oxide; L-arginie transport; nitric
oxide synthase
近年, 生物活性分子一氧化氮(nitric
oxide, NO)与线粒体(mitochodria, Mt)间的关系受到高度重视, 发现NO不仅可抑制Mt的氧化磷酸化过程, 还可使Mt 内膜脂质过氧化, 改变
Mt 内的与细胞凋亡相关的蛋白如细胞色素C和Caspases等的代谢, 并能影响Mt的DNA结构等［1,2］, 表明NO可影响Mt的代谢、 功能与结构。Guilivi等首先在肝细胞发现Mt内存在着独立于细胞浆的完整的L-精氨酸(L-arginine,
L-Arg)/一氧化氮合酶(natric oxide synthase, NOS)/NO生成系统, 并认为该系统生成的NO是细胞生成NO的重要来源之一［3］。NO在神经系统功能活动中具有极重要的作用［2,4］。我们最近报道了大鼠脑Mt能产生NO［5］。本工作进一步测定了Mt
L-Arg跨膜转运, Mt NOS的表达和活性, 及NO的生成, 以探讨脑Mt L-Arg/NOS/NO系统的生理特性。
1材料和方法
1.1 材料L-Arg、 钙调蛋白、 硝酸纤维素膜、 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体、 兔抗大鼠内皮型NOS (eNOS)、 神经型NOS (nNOS)、 诱导型NOS (iNOS)单克隆抗体、 Dowex AG 50 X8 (Na+型) 均为Sigma产品,
Lurbrol PX、 Percoll购于Pharmacia公司, L-［2,3-3H］-Arg (放射比活性2.29 TBq/mol)为Dupont NEN产品,
其余为市售分析纯制剂。Wistar大鼠由北京大学医学部实验动物中心提供。
1.2 大鼠脑Mt的制备体重280～320 g雄性大鼠禁食过夜, 自由饮水。断头取两侧大脑半球以1.15%
KCl冲洗, 在分离介质(IMB: 0.25 mol/L蔗糖、 0.5 mmol/L EDTA-K2、 10 mmol/L Tris-HCl、 0.1%牛血清白蛋白、
1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、 1 g/ml aprotinin、 0.1 mmol/L苯醚, pH 7.4)中匀浆, 差速离心得粗制Mt［6］ 。将粗质Mt重新悬浮于IMB中,
用Percoll 密度梯度离心得纯化Mt［7］。用Lowry法行蛋白定量后, 70℃冻存备用。
1.3 制备的Mt鉴定用电极法［6］测定Mt的呼吸控制率(respiratory
control ratio, RCR)和Sims［7］法测细胞色素C氧化酶的比活性以反映Mt的功能, 并计算出反映Mt膜完整性的指标细胞色素C氧化酶的Latency
［1-(不加Lubrol PX得到直线斜率÷加Lubrol PX得到直线斜率)］。以Swanson［8］法测定内质网标志酶葡萄糖-6-磷酸酶的活性,
Fretes法［9］测定溶酶体标志酶酸性磷酸酶的活性以反映Mt的纯度。
1.4 Mt L-［3H］-Arg转运的测定参照Durante［10］法,
每管加纯化Mt 100 μg, 预孵育后加L-［3H］-Arg, 终浓度分别为1.0～10 μmol/L (18.5 kBq/管), 于37℃孵育1 min,
加冷终止液。 经Millipore抽滤, 用Hepes液冲洗, 干燥后加闪烁液, 在β-液闪计数仪上测定放射活性, 同时设立非特异性平行对照管。 L-Arg的Mt转运=总摄入-非特异性结合,
以nmol/mg pro.min－１表示。
1.5 Mt NOS活性测定［11］取纯化Mt分装入2个Eppendorf
管中, 加1% Triton-X 100, 超声破碎30 s后, 加入孵育液［含25 mmol/L Hepes、 0.2 mmol/L NADPH、 5 μmol/L FMN、 5 μmol/L
FAD、 10 μmol/L BH4、 100 μmol/L L-Arg、 L-［3H］-Arg (18.5 kBq/管), pH 7.4。其中A管加1
mmol/L CaCl2 和10 μmol/L 钙调蛋白, B管则加1 mmol/L EGTA］, 终容积0.5 ml, 37℃孵育10 min, 加入冷终止液(20
mmol/L NaAC、 1 mmol/L L-瓜氨酸、 2 mmol/L EDTA、 0.2 mmol/L EGTA、 pH 5.0), 经Dowex AG 50 W-X 8 (Na+型)过柱, 在β-液闪仪上测
~3H放射活性。计算3H-瓜氨酸的生成量, A管为总NOS (tNOS), B管为诱导型iNOS (非Ca2+依赖型), A-B差值为固有型cNOS活性(Ca2+依赖型)。
1.6 Mt NO-2生成测定［12］取纯化Mt 0.5 mg, 加入孵育液,
37℃摇床孵育, 分别于15～90 min时, 离心取上清, 于等体积Griess试剂混匀, 反应15 min, 546 nm处测OD值, 从亚硝酸钠标准曲线上换算出NO-2
值, 以nmol/mg pro表示。
1.7 蛋白印迹杂交(Western blot)［13］将纯化Mt加入样本缓冲液中加热变性,
做SDS-PAGE (10%～20%梯度聚丙稀酰胺凝胶)电泳, 以含0.05%吐温的PBS洗涤3遍, 按 0.1 ml/cm2加1∶2*#500的多克隆兔抗nNOS、
iNOS、 eNOS抗体, 4℃孵育2 h, 再以PBS冲洗3遍, 加入辣根过氧物酶标的羊抗兔IgG抗体(1∶10*#000)。室温孵育1 h, 以TPS液冲洗3遍,
放入显色液中轻摇3 min, 立即用水冲洗后照相, 计算机灰度扫描处理。
每项指标均做平行管测定, 8次实验, 所得数据以mean±SD表示。
2结果
2.1 纯化脑Mt鉴定
本实验制备的大鼠脑Mt得率(Yield)为6.29±1.26
mg/g 脑组织, Mt功能良好, 膜较完整, 其它亚细胞器如内质网和溶酶体污染极少, 结果见表1。
2.2 Mt L-［3H］-Arg 转运
纯化的大鼠脑Mt L-Arg转运呈现单一的高亲和低转运、
可饱和方式, 转运的最大速率Vmax为5.87±0.46 mmol/mg pro.min－１, 其米氏常数Km为7.87±0.56 μmol/L (图1)。
表 1. 大鼠脑Mt特性和功能及结构完整性的比较
Table 1.Enzymatic characteristics of
isolated rat brain mitochondria
Data are presented as mean±SD, n=5.
*: (Δlog absorbance)/min·mg pro; #: nmol/min·mg pro.
图1.大鼠脑Mt精氨酸转运的动力学特征
Fig. 1.Kinetics of ~3H-L-Arg
transport in isolated
mitochondria. Data are presented as mean±SD, n=8. V, velocity of transport; S, substrate
concentration.
2.3 Mt NOS活性
经测定发现, B管(不含Ca2+/CaM) 几乎无
［3H］-瓜氨酸生成。cNOS于底物结合的Eadie-hofstee 曲线呈较高的亲和方式, 浓度活性曲线呈可饱和特征, Vmax为2.65±0.3
nmol/mg pro·min－１, Km为20.85±3.27 μmol/L (图2)。
图2.大鼠脑Mt cNOS活性特征
Fig. 2.cNOS activity in isolated
mitochondria. Data are
presented as mean±SD, n=8. V, velocity of transport; S, substrate
concentration.
2.4 Mt NO-2生成特征
Mt NO-2生成在一定时间范围内随孵育时间的延长而增加, 60 min时达到峰值, 如图3所示。
图3.大鼠脑Mt NO产生时间曲线
Fig. 3.NO production by brain
mitochondria of rat. Data
are presented as mean±SD, n=8.
2.5 Mt NOS表达
Western印记显示, 正常大鼠脑Mt内iNOS与nNOS均不表达, 仅eNOS表达(图4)。 我们用线栓法造成大鼠左大脑前动脉可复性堵塞,
复制脑缺血-再灌注损伤模型, 观察到脑缺血-再灌注刺激大鼠脑Mt nNOS高表达, eNOS在缺血期高表达, 而在再灌注后恢复到对照水平, 缺血/再灌注不引起iNOS表达。
图4.正常与脑缺血再灌注过程中大鼠脑线粒体NOS表达的Westren
blotting分析
Fig. 4.Western blotting analysis of
NOS expression of mitochondria isolated
from rat brain in the normal and ischemia-reperfusion rat model. A.
eNOS. B. nNOS. M, standard protein. 1, control group; 2, ischemia group; 3,
ischemia-reperfusion (30 min) group; 4, ischemia-reperfusion (4 h) group.
3讨论
血浆L-Arg经氨基酸转运载体跨膜转入细胞内,
与细胞代谢产生的L-Arg共同构成胞浆中的L-Arg池, 在胞浆中NOS作用下合成NO。NO以旁分泌和/或自分泌的方式发挥其生物学效应［14］。已知L-Arg通过质膜的阳离子氨基酸转运体(cationic
amino transporter, CAT)系统y+系统转运。y+系统特征为阳离子氨基酸具有高度亲和性、 非Na+依赖性和膜外底物可刺激其转运能力。目前已克隆出三个转运体,分别命名为CAT-1、
CAT-2A和CAT-2B［16］, 其中CAT-1与L-Arg的亲和性最大,CAT-2B次之。CAT-2A与L-Arg的亲和性仅为CAT-1的1/10, 属低亲和、高容量氨基酸转运体［16,17］。
胞浆内的NOS依其基因结构不同分为神经型(neuronal
NOS, nNOS)、内皮型(endothelial NOS, eNOS)和诱导型(inducible NOS, iNOS)三种, 其中nNOS和eNOS属结构型或固有型(constitutive
NOS, cNOS), 需Ca2+参与才能活化, 而iNOS的活化无需Ca2+参与。
本实验制备了纯度较高的大鼠脑Mt。Mt标志酶细胞色素C氧化酶、
内质网标志酶葡萄糖-6-磷酸酶、 溶酶体标志酶酸性磷酸酶的活性测定结果显示: 我们提取的鼠脑Mt功能良好(RCR值高), 膜的完整率高(Latency>90%),
其他亚细胞器的污染极低(标识酶活性低); 实验证实大鼠脑Mt具有独立的L-Arg/NOS/NO系统。Mt膜上的L-Arg转运体具有高亲和、 可饱和的特点, 符合y+型氨基酸转运体特征［15～17］,
其Km值(7.8±0.56 μmol/L)与文献报道的大鼠肝脏Mt L-Arg转运相近(5～7 μmol/L)［3］。Mt膜内的NOS属cNOS, 几乎无iNOS表达,
cNOS与底物间的关系呈一般酶促反应动力学特征。Western印迹显示正常鼠脑Mt内仅有eNOS表达, iNOS和nNOS均不表达, 与Giulivi［3］ 和Hotta［18］报道的大鼠肝细胞、
豚鼠心肌细胞内Mt NOS相一致。鼠脑Mt内L-Arg经eNOS作用, 生成释放的NO呈时间依赖性, 于60 min时达峰值。
Mt对NO非常敏感, NO可使Mt内多种蛋白质功能损害, 如呼吸链中的复合体Ⅰ(NADH-CoQ
reductase)、 复合体Ⅱ(succinate reductase)和丙酮酸脱氢酶等［19］。Mt通过自身L-Arg/NOS/NO系统产生的NO亦可能严重影响细胞的功能。Ghafourifar等人［20］报道大鼠肝Mt
NOS活性增高, 可引起Mt基质酸化, Mt跨膜转运能力降低。而在豚鼠心肌缺血-再灌注损伤过程中, Mt合成的NO可抑制Ca2+过多进入Mt, 也可能具有一定的心肌保护作用［18］。NO在中枢神经系统活动中也有非常重要的作用,
脑Mt L-Arg/NO系统的生理和病理生理意义, Mt内和胞浆内L-Arg/NO间的关系应值得高度重视。
参考文献
[1] Brown GC. Nitric oxide and mitochondrial respiration.
Bio~chim Biophys Acta, 1999, 1411(2-3):351～369.
［２］Bolnos JP, Almeida
A, Heales SJR. Nitric oxide-mediated mitochondrial damage in the brain:
mechanisms and implications for neurodegenerative diseases. J Neurachem, 1997,
68:2227～2240.
［３］Giulivi C,Poderoso
JJ,Boveris A.Production of nitric oxide by mitochondrial.J Biol Chem,1998,
273(18):11038～11043.
［４］Brorson JR,
Schumacker PT, Zhang H. Nitric oxide acutely inhibits neuronal energy
production. The Committees on Neurobiology and Cell Physiology. J
Neurosci, 1999, 19(1):147～158.
［５］Wang Lei (王 蕾), Tang
CS (唐朝枢), Zhao BL(赵保路) et al. Production of nitric oxide by mitochondrial of
brain in rat. Natl Med J Chin (中华医学杂志), 2000, 80(7):544～545.
［６］Lai JK, Clark JB.
Preparation of synaptic and nonsynaptic mitochondria from mammalian brain.
Methods Enzymol, 1979, 55:51～60.
［７］Simis RN. Rapid
isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions
using percoll density grandient centrifugation. J Neurochemistry， 1990, 55:689～707.
［８］Swanson MA.
Glucose-6-phosphatas from liver. Methods En~zymol， 1955, 2:541～543.
［９］Fretes-RE,
De-Fabro-SP. In vivo and in vitro analysis of lysosomes and acid phosphatase
activity in human chagasic placentas. Exp Mol Pathol， 1995, 63(3):153～160.
［1０］Durante W, Liao L,
Iftikhar J et al. Differential regulation of L-arginine transport and nitric
oxide production by vascular smooth muscle and endothelium. Circ Res, 1996,
78:1075～1083.
［１1］Zhang XB (张新波),Huang
HL (黄海鹭),Zhang LZ (张灵芝) et al. Measurement of nitric oxide synthase activity
and its application. J Beijing Med Univ (北京医科大学学报), 1994, 26(Suppl):173～176
(Chinese, English abstract).
［1２］Green LG, Wager DA,
Glogowski L et al. Analysis of nitrate nitrite and ［15N］ nitrate in biological
fluids. Anal Biochem, 1982, 126:131～136.
［1３］Tatoyan A, Giulivi
C. Purification and characterization of a nitric oxide synthase from rat liver
mitochondria. J Biol Chem, 1998, 332:673～679.
［1４］Tang CS (唐朝枢), Tang
jian (汤 健). Nitric oxide and diseases. Chin Med J (中华医学杂志), 1998, 78(1):5.
［1５］Zheng HZ(郑惠珍),Tang
CS(唐朝枢),SU JL(苏加林) et al.Effects of myocardial ischemia reperfusion injury on
L-arginine/nitric oxide system in rat heart. Acta Physiol Sin(生理学报),1999,51(1):25～30
(Chinese, English abstract).
［1６］William WS, Ellen
IC, James MC et al . Cytokines and insulin induce cationic amino acid
transporter (CAT) expression in cardiac myocytes. J Bio Chim, 1996,
271(20):11694～11702.
［1７］郑惠珍, 唐朝枢. L-精氨酸的跨膜转运及临床意义.
国外医学 (生理、病理科学与临床分册), 1999,
6(19):475～478.
［1８］Hotta Y, Otsuka MH,
Fujjta M et al. Protective role of nitric oxide synthase against mit
ischemia-reperfusion injury in guinea pig myocardial mitochondria. Eur J
Pharmacol, 1999,380(1):37～48.
［1９］Abe K, Hayashi
N, Terada H. Effect of endogenous
nitric oxide on energy metabolism of rat heart mitochondria during ischemia and
reperfusion. Free Radic Biol Med, 1999, 26(3～4):379～387.
［２０］Ghafuorifar P,
Richter C. Mitochondria nitric oxide synthase regulates mitochondria matrix pH.
Biol Chem, 1999, 380(7～8):1025～1028.
Received 2000-10-27Accepted
2000-12-15
This work was supported by National
Major Basic Research Program (G2000056905).
*Corresponding author. Tel:
010-62092183; E-mail Tangchaoshu@263.net