生理学报, Aug

生理学报, Aug. 2001, 53 (4): 303～306

Acta Physiologica Sinica

L-精氨酸L-门冬氨酸盐对血小板功能的抑制

王银叶, 王景燕, 付逸龙, 王超, 彭师奇*

(北京大学药学院，北京　100083)

摘要: 用血小板聚集、粘附、释放实验和出血时间测定观察L-精氨酸·L-门冬氨酸盐(DR)对血小板功能的作用。实验结果显示: DR 15 mg/kg静脉给药, 可明显抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01); 15 mg/kg单次口服给药可明显抑制ADP诱导的家兔血小板聚集; 其药效可持续8 h以上(P<0.01); DR 7.5、 15、 30 mg/kg灌胃给药(Bid×3.5 d), 可明显抑制ADP、胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01), 并延长出血时间(P<0.05)。 DR 30 mg/kg可明显抑制大鼠血小板粘附, 并促进血管内皮释放前列环素(PGI2), 但对活化的血小板释放血拴素(TXA2)无明显影响。本研究发现, DR可抑制血小板聚集和粘附功能, 其作用机制不同于阿司匹林。这些作用部分是由于DR增加了血管内皮PGI2的释放。此结果为血小板功能的调节提供了新线索。

关键词: L-精氨酸·L-门冬氨酸盐; 血小板聚集; 血小板粘附; 血小板释放

学科分类号: Q461; Q256

Inhibition of platelet function by L-arginine·L-aspartate salt

WANG Yin-Ye, WANG Jing-Yan, FU Yi-Long, WANG Chao, PENG Shi-Qi*

(School of Pharmaceutical Sciences, Beijing University, Beijing 100083)

Abstract: The effects of L-arginine·L-aspartate salt (DR) on platelet aggregation, adhesion and release were investigated. Platelet aggregation induced by adenosine 5′-diphosphate (ADP) was significantly inhibited (P<0.01) by intravenous injection of DR (15 mg/kg) in rats or oral administration (15 mg/kg) in rabbits, the inhibitory effect on rabbit platelet aggregation lasting for more than 8 h (P<0.01). Platelet aggregation induced by ADP, collagen or thrombin in rats was all markedly inhibited by 7.5, 15 or 30 mg/kg of DR (bid for 3.5 d, ig, P<0.01). Platelet adhesion to foreign objects was inhibited by 30 mg/kg of DR (ig). Bleeding time in rat tails was prolonged by 30 mg/kg of DR (P<0.05). Furthermore, PGI2 released from the vascular wall was increased in DR-treated rats (P<0.05), however, TXA2 released from platelets was not affected. These data demonstrate the inhibitory effect of DR on platelet function, suggesting that its action target may be different from that of acetylsalicylic acid, and that the increase of PGI2 release may be responsible partly for this effect. It is suggested that DR may probably be used as a new agent for regulating platelet function.

Key words: L-arginine·L-aspartate; platelet aggregation; adhesion; release

血小板在生理性止血和病理性血栓形成过程中发挥重要作用, 有多种因素参与血小板功能的调节: 内源性的血小板聚集诱导剂(如ADP、凝血酶、肾上腺素、 TXA2等)与血小板膜受体结合, 会引起血小板活化、聚集, 血小板内cAMP和cGMP浓度增加, 血液中的PGI2和NO水平升高可抑制血小板聚集。因此从不同途径干预血小板功能, 是血小板相关疾病特别是血栓性疾病防治的必要手段, 如用阿司匹林(ASA)作为环氧酶抑制剂, 通过阻止血小板TXA2的合成抑制血小板聚集; 用双嘧达莫抑制PDE, 升高血小板内cAMP水平抑制血小板聚集［1］。L-精氨酸·L-门冬氨酸盐(L-argnine·L-aspartate, DR)为已知的化合物, 一直作为生化试剂应用［2］。近年来研究认为, 血浆中的纤维蛋白原与其受体的结合, 是各种诱导剂引起血小板聚集的共同通路［3］。纤维蛋白原受体αⅡbβ3 (GPⅡb/Ⅲa)为血小板表面的跨膜糖蛋白, 血小板在静息状态下, GPⅡb/Ⅲa胞浆区的α与β亚基之间有一门冬氨酸和精氨酸形成的盐桥(D-R), D-R的存在使GPⅡb/Ⅲa处于非信号转导状态; 当盐桥断裂时GPⅡb/Ⅲa进入信号转导状态, 与纤维蛋白原结合, 引起血小板活化、聚集［4］。因此设想, 保护盐桥免遭破坏, 即阻止该受体活化, 也可抑制血小板聚集。DR与体内的D-R结构相似, 两者的精氨酸与门冬氨酸之间均为离子键结合, 前者有可能作为盐桥保护剂而抑制血小板功能, 但未见有相关的文献报道。因此, 我们合成了DR, 观察其对血小板功能的影响, 旨在发现血小板功能调节的新途径。

1材料和方法

1.1　材料实验用雄性Wistar、 SD大鼠与雄性家兔, 购自本校试验动物部。 DR由本研究组合成, 临用时溶于蒸馏水(ig)或生理盐水(iv); ASA临用前研细, 溶于蒸馏水或生理盐水(1.5 mg/ml); ADP和凝血酶购自Sigma公司, 用时溶于生理盐水; 胶原溶液按参考文献制备［5］, 胶原蛋白含量用蛋白测定试验盒测定(中生生物技术工程公司产品), TXB2放免药盒为东雅生物技术研究所产品。

1.2 实验方法

1.2.1　大鼠血小板聚集实验(ex vivo iv)雄性Wistar大鼠(430～470　g), 按体重平均分为DR 15 mg/kg组和生理盐水组, 每组5只。戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg ip), 静脉推注生理盐水或DR (0.5 ml/100 g), 处理后5 min腹主动脉取血, 按常规方法制备PRP和PPP, 血小板数调至3.5～4.0×108个/ml, 血小板聚集参考以前方法在双道血小板聚集仪(Sienco.DP-247E)上进行［6］, 诱导剂为ADP (终浓度: 1×10－6～5×10－6　mol/L)。

1.2.2 大鼠血小板聚集试验(ex vivo ig)雄性Wistar大鼠(250～300 g) 70只, 分为7组: 溶媒对照组、 DR 1.5、 3.0、 7.5、 15、 30 mg/kg和ASA 30 mg/kg组。动物给药7次(bid×3.5 d ig), 末次给药后1 h, 戊巴比妥钠麻醉, 腹主动脉取血, 按常规方法制备PRP和PPP, 血小板数调至3.5×108～4.0×108个/ml, 诱导剂为ADP (终浓度: 1×10－６～5×10－6　mol/L), 胶原(终浓度4０～50 μg蛋白/ml)或凝血酶(终浓度0.06～0.07 IU/ml)。血小板聚集实验同1.2.1。

1.2.3 家兔血小板聚集实验(ex vivo po)雄性家兔(2.5～3.8 kg) 12只, 分为两组: 空白对照组和DR 15 mg/kg组。空白组动物口饲饲料粉末胶囊, 处理组动物口饲掺入DR的饲料粉末胶囊, 分别在处理前、后1、 2、 4、 6、 8 h取血, 以ADP为诱导剂, 进行血小板聚集活性测定。

1.2.4 血小板粘附实验雄性SＤ大鼠(250～300 g) 50只, 按体重平均分为5组, DR处理同1.2.1。末次处理后1 h麻醉, 取动脉血, 先进行粘附前计数。然后取同一份抗凝血1.3 ml加入清洁干燥的10 ml圆底烧瓶中, 以3 r/min的速度旋转15 min, 取旋转后的血液进行血小板计数, 为粘附后的血小板数, 计算血小板粘附率［5］。

1.2.5　血小板释放实验雄性SD大鼠(200～250 g 二级), 动物处理及PRP制备同血小板聚集实验。取300 μl　PRP　(血小板浓度为4.0×108个/ml), 37℃温育1　min, 加入ADP (5×10－６ moｌ/Ｌ), 诱导血小板聚集和释放反应, 5 min后加入消炎痛(1×10－５ mol/Ｌ)终止反应, 反应混合物转入冰冷的离心管中, 在3*#500 r/min、 4℃离心10 min, 上清液保存于－20℃待测。用放免法测定其中的TXB2含量。

1.2.6　大鼠主动脉条释放PGI2实验测定雄性SD大鼠(150～220 g, 二级), 按体重平均分为5组: 溶媒对照组、 ASA组、 DR 7.5、 15和30 mg/kg组。动物处理同1.2.2。末次给药前禁食12 h, 给药后1 h麻醉, 取出主动脉弓至腹主动脉间4　cm长的动脉条, 置冰浴上除去脂肪和结缔组织, 放入1 ml冰冷的K-H生理营养液中, 37℃温育30 min后, 取出动脉条, 温育液于－20℃保存待用。用放免法测定其中PGI2的稳定代谢产物6-keto-PGF1α的浓度。

1.2.7　出血时间测定实验雄性SD大鼠 (150～220　g 二级), 按体重平均分为5组: 溶媒对照组、肝素对照组、 DR 7.5、 15、 30 mg/kg处理组, 末次给药后50 min, 阳性对照组动物麻醉下静注肝素(200 U/kg), 10 min后与其它组动物(处理后1 h)一起麻醉, 切去3　mm尾尖, 用滤纸接血滴, 记录出血时间［7］。

2结果

2.1 DR对大鼠血小板聚集的影响

DR 15 mg/kg单次静脉处理后10 min 使ADP引起的血小板聚集率较溶媒对照组明显降低; DR 7.5、 15 、和30 mg/kg (bid×3.5 d,ig), 使ADP、胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集率较溶媒对照组均有明显降低(表1), 表明DR无论胃肠道还是静脉给药, 均可抑制大鼠血小板聚集功能。

2.2 DR对家兔血小板聚集的影响

DR 15 mg/kg一次处理1 h后, 对ADP诱导的家

表1. DR (bid×3.5 d, ig) 对大鼠血小板聚集的影响

Table 1. Effects of DR (bid×3.5 d, ig) on platelet aggregation in rats (ex vivo)

Mean±SD; n=10. ~**P<0.01, compared with H2O.

兔血小板聚集有一定程度抑制作用, 2～6 h之间抑制作用非常明显, 8 h时血小板活性有所恢复, 但仍较对照组动物相应时间点的血小板聚集活性显著降低。结果提示: DR也可抑制家兔血小板聚集功能, 其抑制作用至少可维持8 h (图1)。

图1.DR对ADP诱导的家兔血小板聚集的时效作用

Fig. 1.Effect of 15 mg/kg DR on ADP-induced platelet aggregation course in rabbits. Data are expressed as mean±SD. n=6. ○─○, control group; ●─●, treated group. Statistical analysis was performed by using Student′s t tests, ~**P<0.01, compared with the vehicle (food capsule) group.

2.3 DR对大鼠血小板粘附的影响

DR 7.5、 15 mg/kg (bid×3.5 d,ig)对血小板粘附率无明显影响, 30 mg/kg可明显降低血小板的粘附率, 表明DR在较高剂量也可抑制血小板粘附功能(表1)。

2.4 DR对大鼠血小板释放的影响

DR 7.5、 15 、 30 mg/kg (bid×3.5 d,ig)对ADP诱导的血小板释放无明显影响, 而ASA 30 mg/kg同样条件下可明显抑制血小板释放TXA2 (表2)。

2.5　DR对大鼠主动脉段释放PGI2的影响

DR 7.5 mg/kg 对大鼠主动脉段温育液中的PGI2的稳定代谢物6-keto-PGF1α的浓度无明显影响, 15 mg/kg使6-keto-PGF1α浓度有所增加, DR 30 mg/kg明显升高6-keto-PGF1α的浓度(表3)。

表2. DR (bid×3.5 d,ig)对大鼠血小板粘附和血小板释放的影响

Table 2. Effect of DR (bid×3.5 d,ig) on platelet adhesion and release in rats

Mean±SD, n=10. ~*P<0.05, ~**P<0.01 compared with H2O.

表3. DR (bid×3.5 d,ig)

对大鼠主动脉血管温育液中PGI2 的稳定代谢物6-keto-PGF1α的影响

Table 3. Effect of DR (bid×3.5 d,ig) on PGI2 release from aorta wall in incubated solution (ex vivo)

Mean±SD. ~**P<0.01; ~***P<0.001, compared with H2O.

２.6　DR对大鼠尾出血时间的影响

DR在抑制血小板功能的剂量下似可延长出血时间, 但作用较弱, 也未表现出量效关系, 此作用明显弱于肝素(表4)。

表4. DR (bid×3.5 d,ig) 对大鼠出血时间的影响

Table 4. Effects of DR (bid×3.5 d,ig)on bleeding time in rats

Mean±SD, n=10. ~*P<0.05, ~***P<0.001, compared with H2O.

3讨论

血小板的活化、聚集是心肌梗塞和脑缺血性中风发病的重要诱因, 抑制血小板聚集可预防这些疾病的发生和复发。体内可引起血小板聚集的因素有多种, 抑制单一因素不可能得到理想的预防效果, 因此需要有在血小板活化的不同环节的共同作用, 方可有好的效果。基于这一思路, 本研究试图通过干扰纤维蛋白原受体的活化来调节血小板功能。 DR的分子结构特点与GPⅡb/Ⅲa胞浆区的α与β亚基之间的门冬氨酸和精氨酸形成的盐桥相似, 有可能替代这一盐桥被水解, 而减少盐桥的破坏, 从而抑制血小板活化、聚集。本研究结果显示: DR经静脉或胃肠道途径给药, 对不同诱导剂引起的动物血小板聚集均有抑制作用, 在较高剂量也可抑制血小板粘附, DR抑制血小板聚集的同时不影响TXA2的释放, 剂量稍高时可促进血管壁释放PGI2, 而在相同实验条件下阿司匹林可明显抑制血小板TXA2和血管壁PGI2的释放。DR延长出血时间的作用也反映了它对血小板功能的抑制作用。结果提示, DR与阿司匹林的作用靶点不同, 其抗血小板作用机制还可能与血管内皮PGI2释放增加有关, 然而这些资料尚不足以阐明其确切机制。总之, 这一结果为血小板功能的调节提供了新思路。其确切的作用机制的研究正在进行中。

参考文献

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Received 2000-11-03Accepted 2001-01-30

*Corresponding author. Tel: 010-62092274; Fax: 010-6201-5584; E-mail: psqbmu@263.net.cn