生理学报, Dec. 2001,
53 (6): 419～424
Acta Physiologica Sinica
研 究 论 文
脂多糖直接损伤血管内皮细胞后内皮细胞膜脂的修饰
王翔1，*, 蔡绍皙1, 罗向东2, 王裴2, 罗勤2, 梁光萍2, 杨宗城2
(1重庆大学生物工程学院,
国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室, 重庆 400044;
2第三军医大学西南医院烧伤研究所,
重庆 400038)
摘要: 我们前期的研究显示, 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)直接损伤人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein
endothelial cell, HUVEC) 后, HUVEC膜粘度随LPS浓度的增加而增大, 这暗示LPS可能改变HUVEC的膜结构和组成。本文旨在研究LPS直接损伤HUVEC后内皮细胞膜脂的修饰。用高效毛细管电泳(high
performance capillary electrophoresis, HPCE)法测定HUVEC膜磷脂组成, HUVEC用不同浓度(0、 0.3125、
0.625、 1.25、 2.5、 5、 7、 8.5、 9、 10 μg/ml)的LPS无血清培养液直接损伤3 h; 用含LPS (0.625 μg/ml)的无血清培养液直接损伤1、
3、 6、 12、 24、 48 h。结果显示: 在3 h LPS的作用下, HUVEC的总磷脂含量随LPS浓度的增加而增加, 在0.625 μg/ml
LPS的浓度条件下, HUVEC的总磷脂含量随LPS作用时间的延长而降低; 磷脂酰肌醇(PI)、 磷脂酰胆碱(PC)的含量随LPS浓度的增加而增加, 随LPS作用时间的延长而降低;
LPS的作用浓度和作用时间对磷脂酰鞘磷脂(SM)、 磷脂酰乙醇胺(PE)以及磷脂酰丝氨酸(PS)的含量影响不大。LPS激活膜磷脂代谢的反应特性表现出典型的酶促动力学特性。实验结果表明,
LPS可直接激活血管内皮细胞膜磷脂代谢, 诱导HUVEC膜磷脂的修饰, 提示LPS直接损伤血管内皮细胞HUVEC的途径可能与膜结构组成及膜脂代谢有关。
关键词: 脂多糖; 直接损伤; 内皮细胞; 膜磷脂修饰
学科分类号: Q463; Q735
Modification of membrane lipid of human umbilical vein endothelial cells after direct lipopolysaccharide injury
WANG
Xiang1，*, CAI ShaoXi1, LUO XiangDong2, WANG Pei2, LUO Qing2, LIANG GuangPing2, YANG ZongCheng2
(1Bioengineeing
College of Chongqing University, The Open Laboratory for Biomechanics and Biorheology
Under the Ministry of Education, Chongqing 400044；
2Burn
Research Institute of Southwestern Hospital, Third Military Medical University,
Chongqing 400038 )
Abstract: Our previous study showed that the membrane viscosity of human umbilical vein endothelial cells
(HUVECs)increased with lipopolysaccharide
(LPS) concentration after direct LPS damaging, implying that LPS could change the membrane structure and composition of HUVECs. The purpose of the present
study was to investigate the modification of HUVECs membrane lipid by LPS under direct LPS injury to HUVECs.
Phospholipid components of HUVEC membrane were determined with high performance
capillary electrophoresis (HPCE), and HUVECs were directly damaged by LPS of different concentrations: 0,
0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5 and 10 μg/ml
for 3 h, and by 0.625 μg/ml for 1,
3, 6, 12, 24 and 48 h. The results show that total phospholipid content of
HUVECs increased with the increase of
LPS concentration at 3 h, and decreased with the duration of LPS effect at 0.625 μg/ml. Phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylcholine (PC) contents
increased with the increase of LPS concentration and decreased with
the duration of LPS effect; LPS
contents and its effect duration had slight effect on sphingomyelin (SM),
phosphatidylethanolamine (PE)
or phosphatidylserine (PS)
contents. The LPS activating effect of HUVEC membrane lipid showed a typical
property of enzymatic dynamics. These experimental results indicate that
LPS directly activates the metabolism of HUVEC membrane lipid and
induces the modification of HUVEC membrane phospholipid, which implies that
the mechanism of the impairment of
HUVECs by LPS may be related to the membrane structure of HUVECs and the
metabolism of HUVEC membrane lipid.
Key words: lipopolysaccharide
(LPS); direct damage; human
umbilical vein endothelial cell (HUVEC);
modification of membrane lipid
血管内皮细胞是血管内皮的主要屏障。其重要的功能是形成和实现血液与组织间的选择性物质传输。在病理条件下, 许多毒素、 炎症和成血栓性介质均可以损伤内皮屏障的功能, 导致通透性增高, 血液中有形成分和血浆蛋白质渗出, 引起组织器官水肿、 加剧脏器损坏,
从而造成组织脏器功能障碍。在烧创伤条件下, 内毒素血症是导致血管内皮损伤, 造成内皮功能障碍的主要原因。已有的研究发现, 内毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可引起血管内皮细胞微丝Factin降解、 抑制内皮细胞间连接分子VE钙粘附分子的表达;
促进血液凝固性增强、 白细胞在内皮细胞表面粘附等。但LPS对血管内皮细胞损伤的机制, 特别是LPS直接损伤内皮细胞的机制尚不清楚［1～6］。
在研究LPS直接损伤内皮细胞后内皮细胞生物力学特性变化时发现,
LPS增加可使内皮细胞的膜粘度增大［7］; 而且荧光标记的LPS直接作用于内皮细胞后, 内皮细胞的激光共聚焦图谱说明LPS在内皮细胞膜上有显著的浸润效应。这种现象揭示,
LPS可能对内皮细胞膜脂质的组成及代谢发生影响。本文通过分析LPS直接损伤人脐静脉血管内皮细胞后内皮细胞膜脂质的组成, 研究LPS直接损伤血管内皮细胞后内皮细胞膜脂质的修饰作用。
1材料和方法
1.1 材料LPS、
M199培养液等均购自美国Sigma公司, 小牛血清等其他药品均为国产分析纯试剂。
细胞株的培养: 实验采用人脐静脉血管内皮细胞(human
umbilical vein endothelial cell, HUVEC)株ECV304(购自美国ATCC公司)和M199培养液(含10%的小牛血清)。
在25 ml玻璃培养瓶中进行培养、 传代; 每24 h更换培养液一次。
高效毛细管电泳(high
performance capillary electrophoresis, HPCE)实验药品: 异丙醇、 氯仿、 甲醇等均为国产高效液相色谱纯; 胆酸钠(sodium
cholate NaCh)、 磷脂标准品盒(phospholipid standard kit)均购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 LPS对血管内皮细胞的直接损伤LPS浓度组: HUVEC经胰蛋白酶消化分散后, 以无血清培养液培养4 h, 再用含不同浓度的LPS无血清培养液培养3
h; LPS: 0、 0.3125、 0.625、 1.25、 2.5、 5、 7、 8.5、 9、 10 μg/ml, 细胞浓度为～106。LPS作用时间组:
HUVEC 经胰蛋白酶消化、 无血清培养液培养4 h后, 用含LPS 0.625 μg/ml的无血清培养液培养1、 3、 6、 12、 24 h。细胞数约106。
1.2.2 用HPCE分析内皮细胞膜磷脂［8，9］及内皮细胞膜脂的分离提取正常和被LPS直接损伤的血管内皮细胞经胰蛋白酶消化后,
用无血清培养液培养4 h, 离心除去培养液。加入0.5 ml 80%的甲醇溶液悬浮HUVEC, 再加入等体积的膜脂提取液(甲醇/氯仿: 1/2)萃取3次, 离心后合并有机相;
用氮气吹干后, 将样品储存在－20℃冰箱中备用。
内皮细胞膜脂样品液制备: 将膜脂提取液样品用200
ml氯仿溶解, 加入等体积的样品溶解液(75 mmol/L NaCl, 10 mmol/L NaH2PO4, 6 mmol/L 四硼酸二钠, 30%异丙醇,
pH 8.5)混合, 分析前用0.20 μm的膜过滤。
HPCE测定条件: 仪器: Beckman P/ACE System 5010 毛细管电泳仪; 毛细管: 75 mm×47
cm (有效长40 cm) (河北永年光导纤维厂); 缓冲液: 75 mmol/L胆酸钠, 10 mmol/L NaH2PO4, 6 mmol/L 四硼酸二钠,
30%异丙醇, pH 8.5; 操作电压: 18 kV; 毛细管温度: 45℃; 检测波长: 200 nm; 进样量30 nl。
1.2.3 荧光观测LPS在内皮细胞膜脂质中的浸润用含有荧光标记LPS(F3665,
Sigma公司)的无血清培养液与内皮细胞共培养3 h, 然后用无血清培养液洗掉过量的含荧光标记LPS的培养液;
处理后的内皮细胞用0.25%胰蛋白酶0.01%EDTA消化, 离心后于细胞样品中加入0.5 ml 80%的甲醇溶液悬浮HUVEC, 在加入等体积的膜脂提取液(甲醇/氯仿:
1/2)萃取3次, 离心后合并有机相; 用氮气吹干后备用。
1.2.4 数据处理实验数据用Microsoft Excel的分析软件进行统计,
采用两样本均数的t检验。
2结果
2.1 内皮细胞膜脂的HPCE电泳图谱及标准曲线
内皮细胞膜脂的HPCE图谱显示了各个磷脂组分的峰呈现较好的分辨率(图1);
基线平稳、 杂峰干扰小; 标准曲线稳定, 呈现较高的线性相关值 (表1)。
2.2 脂多糖浓度对内皮细胞膜脂组成的影响
由表2可见, LPS直接损伤血管内皮细胞后, 对内皮细胞膜脂质的修饰作用十分显著,
特别是对磷脂酰肌醇(PI)、 磷脂酰胆碱(PC)的影响尤为明显; 随着LPS浓度的逐渐增加, 内皮细胞膜上PI、 PC含量亦渐渐增加, 而当LPS的浓度从7 μg/ml增加到10
μg/ml时, PI、 PC含量增幅变缓并逐渐趋于稳定。LPS的作用浓度范围为0.313～10 μg/ml; 磷脂酰鞘磷脂(SM)、 磷脂酰乙醇胺(PE)以及磷脂酰丝氨酸(PS)的变化无明显的规律或变化不大,
但总体来看, SM随LPS的浓度增加而增加, PS随LPS的浓度增加而减少, PE变化很小。表2中数据还显示, 随着LPS的浓度增加, PC/SM比值基本上呈下降趋势。
图1.高效毛细管电泳测定内皮细胞膜脂的标准曲线图
Fig. 1.Electrophoretogram of
phospholipid separated by micellar
electrokinetic capillary chromatography. A. Electrophoretogram of standard
phospholipid from Sigma Co. B. Electrophoretogram of phospholipids isolated
from HUVEC membrane. SM,
sphingomyelin; PC,
phosphatidylcholine; PE,
phosphatidylethanolamine; PI,
phosphatidylinositol; and PS, phosphatidylserine.
表1. 高效毛细管电泳测定内皮细胞膜磷脂的标准曲线公式及相关系数表
Table 1. Formula and correlation
coefficients of standard curve of phospholipid standard kits with the HPCE
2.3 脂多糖作用时间对内皮细胞膜磷脂组成的影响
从表3中可以看出, LPS作用于内皮细胞的时间对内皮细胞膜脂的组成也有较大影响,
其影响程度较大的仍是PI、 PC; 随着LPS作用时间的延长, 内皮细胞膜中PI、 PC的含量逐渐降低; 而SM、 PE以及PS的变化则无明显的规律性。值得注意的是,
表2. 脂多糖浓度对内皮细胞膜磷脂组成的影响
Table 2. Concentrationdependent effects of LPS on the composition of
HUVEC membrane phospholipid (treated with LPS for 3 h, n=5; mean±SD)
~*P<0.05 compared with LPS group:
0.000 (μg/ml).
表3. 脂多糖作用时间对内皮细胞膜磷脂组成的影响
Table 3. Timedependent effect of
LPS on the composition of HUVEC
membrane phospholipids (LPS: 0.625 μg/ml,
n=5; mean±SD)
~*P<0.05 compared with the control
group.
随着LPS作用时间的延长, PC/SM比值迅速下降,
呈现出较大变化。
2.4 脂多糖在内皮细胞膜脂质中的浸润
图2展示了荧光标记LPS对内皮细胞膜浸润后, 通过提取浸润后内皮细胞膜脂质,
用荧光显微镜观测并拍摄到的荧光标记LPS在内皮细胞膜上浸润的照片。实验结果说明, LPS可以通过其亲脂部分如类脂A嵌入内皮细胞的脂质, 而且荧光LPS嵌入的量有浓度依赖性。
3讨论
以前的研究发现, 在LPS直接作用于内皮细胞的情况下,
内皮细胞的力学特性内皮细胞弹性模量K1、 K2 发生较大的变化［7］; 随着LPS浓度的增加, K1显著地下降; K2也呈下降趋势; 而对粘性系数μ的影响则与K1、
K2相反, 随着LPS浓度的增加, μ缓慢的增加。内皮细胞膜粘度的变化揭示, LPS直接作用于内皮细胞, 可使内皮细胞膜结构和组成发生改变。如同其它细胞一样,
血管内皮细胞膜主要由膜蛋白和膜脂构成, 膜脂的主要成分是磷脂, 包括SM、 PC、 PE、 PI、 PS等; 膜脂在保持细胞的正常生理功能、 维持细胞的形态及其变化方面起着重要的作用。一方面,
膜脂为细胞铸成一道疏水性屏障, 在这个疏水环境中一些膜蛋白能够维持正常的生理构像, 同时也有利于一些生化反应的进行并可调控性地阻遏胞外极性物质的通透; 另一方面,
膜脂也使细胞膜具有良好的可变形性、 流动性, 细胞膜是动态结构, 膜脂双层是介于固态与液态之间的液晶态, 其流动性与细胞膜的各种重要功能密切相关,如图2.在提取的内皮细胞膜磷脂中观察到的不同浓度的荧光标记脂多糖
Fig. 2.Fluorescent labeled LPS of different
concentrations found in extracted HUVEC membrane phospholipid. A. LPS: 0.000 μg/ml; B. LPS: 0.625 μg/ml;
C. LPS: 1.25 μg/ml; D. LPS: 2.50 μg/ml; E. LPS: 5.00 μg/ml; F. LPS: 10.00 μg/ml.
膜脂的翻转、 侧向扩散、膜蛋白运动等。膜流动性的变化受细胞内外因素的调控, 膜脂的代谢使膜脂成分改变(如PC/SM 比值), 胞外脂溶性物质的嵌入也能使细胞膜的流动性发生改变, 从而导致膜粘度变化。另外, 膜磷脂还是重要的细胞信号转导分子,
在细胞自膜向核的信号转导过程中, 介导一系列重要的细胞反应。
本研究发现, LPS直接作用于内皮细胞后, 内皮细胞膜磷脂组成发生改变:膜磷脂代谢与LPS浓度呈线性相关依赖性,
随着LPS作用浓度的逐渐增加, 内皮细胞膜上PI、 PC含量逐渐增加; 膜磷脂代谢还与LPS作用时间呈相关性, 随着LPS作用时间的延长, 内皮细胞膜中PI、
PC的含量逐渐降低。而且LPS与血管内皮细胞直接作用, 表现出显著的酶促动力学特性: 如LPS的浓度从7 μg/ml增加到10 μg/ml时, PI、 PC含量增幅变缓并逐渐趋于稳定。
内皮细胞膜脂质中PI含量随LPS浓度的正相关增加,
说明LPS有可能激活内皮细胞的肌醇脂质信号系统。在LPS作用下, 内皮细胞膜磷脂含量随LPS作用浓度而增加, 极有可能是LPS与受体结合激活磷脂酶C(PIPLC),
促使细胞膜上肌醇磷脂代谢生成一系列肌醇磷脂衍生物: IP3、 IP2、 PIP2和DG等, 进而产生相应的细胞反应, 如加剧血小板的分泌和聚集、 促使血管内皮细胞产生的缩血管物质(内皮素)多于舒血管物质(NO、
PGI2)［10］。
比较LPS损伤血管内皮细胞的浓度效应和时间效应,
可见在LPS损伤内皮细胞的早期(LPS作用前3 h), 内皮细胞膜磷质中PC、 PI均随LPS浓度的增加而增加; 损伤后期(LPS作用3 h后) PC、 PI则随LPS的作用时间的延长而下降。其原因可能是:
在LPS损伤内皮细胞的早期, 内皮细胞中磷脂酶如磷脂酶C、 磷脂酶A2等被LPS的激活, 磷脂分解代谢增强, 产生了许多磷脂的衍生物、 同系物(多为参与信号传导的信息分子),
所以在损伤早期, PC、 PI均随LPS浓度的增加而增加; 而随着LPS损伤时间的延长, 由于磷脂酶介导膜磷脂分解代谢产物的耗竭速度高于其代偿性合成代谢速度,
因此内皮细胞膜磷脂PC、 PI随LPS作用时间的延长而下降。
膜质的组成对膜的流动性和粘度有重要的影响, 特别是PC和SM的比值。
比值越大, 膜粘度越小流动性越好; 比值越小, 膜粘滞性增加流动性降低［2］。实验中发现LPS作用的浓度与时间均对内皮细胞膜质中PC/SM比值有不同程度的影响。LPS浓度对膜粘度的影响不显著,
表现为初始低浓度阶段的影响, 尽管浓度成倍数地增加, 但增至一定水平后, 其影响程度渐趋减小。LPS作用时间的影响相对来说更显著些, 在时间条件实验中,
LPS浓度均较低(0.625 μg/ml)。在LPS作用3 h内, PC/SM比值迅速下降; 3 h后, 下降趋势减缓。
用荧光显微镜观测并拍摄到的荧光标记LPS在内皮细胞膜上浸润的实验结果说明,
LPS在内皮细胞膜上的结合至少受在胞外环境与细胞膜之间的LPS浓度梯度的调控, 而在内皮细胞膜上形成一种扩散性的浸润。
实验结果说明: LPS直接损伤血管内皮细胞后,对内皮细胞膜脂质的修饰,
无论从LPS浓度效应, 还是LPS作用的时间效应来说, 都是十分显著的; 而且从LPS与内皮细胞作用的初始浓度效应和反应初始时间效应来看, LPS与内皮细胞膜的结合作用呈明显的酶促动力学特征。
实验结果还表明， LPS与内皮细胞作用之后, 会显著地影响内皮细胞膜脂组成, 进而增加内皮细胞膜粘度、 降低膜流动性。
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Received 20010121 Accepted 20010510
*Corresponding author. Tel: 02365102508;
Fax: 65102507; Email: xwangchn@cqu.edu.cn